过敏性接触性皮炎(Allergic Contact Dermatitis, ACD)是一种皮肤接触致敏物质后引发的迟发型过敏反应,该反应涉及一系列的反应过程,其有害结局路径(Adverse Outcome Pathway, AOP)包括:致敏成分穿透真皮层,发生蛋白修饰(关键事件1);角质形成细胞(关键事件2)和树突状细胞(关键事件3)被激活产生信号和炎症介质;树突细胞加工、提呈抗原后引起T细胞的增殖分化(关键事件4)。随着欧洲化妆品法规1223/2009和REACH(Registration, Evaluation, Authorisation and restriction of Chemicals)法规的推行,皮肤致敏的检测方法已经由传统的动物实验检测方法越来越转向可靠、安全的体外替代检测方案[1]。已经通过经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)法规的体外检测方法包括OECD TG442C:直接多肽结合试验(Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA)[2]、OECD TG442D:ARE-Nrf2荧光素酶检测方法(ARE-Nrf2 Luciferase Test Method, KeratinoSensTM)[3]和OECD TG442E:人细胞系活化试验(Human cell line activation test, h-CLAT)[4]等方法。
皮肤致敏性检测是皮肤接触类用品安全性评价的重要部分,随着国际监管加强和动物伦理原则的推行,在实验室建立可靠的皮肤致敏体外检测方法必不可少。其中OECD TG442E:h-CLAT方法是模拟皮肤致敏过程中关键事件3,通过荧光染色测量类树突状细胞THP-1表面分子的表达来判定待测物是否具有致敏性。当致敏物接触THP-1会引起其表面分子CD86和CD54的上调,代表树突状细胞被活化,发生了皮肤致敏过程。在对100种化学物质进行的致敏性检测中,和小鼠局部淋巴结(Local Lymph Node Assay, LLNA)试验结果以及人体实验结果对比,h-CLAT结果的准确度分别达到84%[5]和83%[6]。同时h-CLAT试验很容易实现实验室转移,在美国、欧洲和日本进行的环形比对实验中,实验室内和室间再现性均很高[7-8],是一种适合在实验室建立的稳定、可靠的体外检测方法。本研究通过10种OECD TG442E附表推荐的实验室验证物质在实验室内建立h-CLAT检测方法,并将其应用于染发类原料和成品的测定。检测过程中同时对比CCK-8法和流式法在该实验中检测细胞毒性结果的一致性。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞来源实验采用悬浮细胞人急性单核白血病细胞(The human monocytic leukaemia cell line, THP-1),购于中国食品药品检定研究院。
1.1.2 实验试剂RPMI1640培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇、双抗、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS)均购自Sigma公司;人Fc受体阻断剂(Human BD Fc Block)、7-氨基放线素菌-D(7-Amino-Actinomycin D, 7-AAD)、FITC标记的小鼠单克隆CD86抗体(FITC-CD86)、FITC标记的小鼠IgG1(FITC-IgG1)、PE标记的小鼠单克隆CD54抗体(PE-CD54)、PE标记的小鼠IgG1(PE-IgG1)均购自BD公司。
1.1.3 主要仪器流式细胞仪(BD公司,型号FACS Calibur)、台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司,型号GS-15R)、二氧化碳培养箱(Thermo Scientific公司)、Varioskan Flash全波长多功能读数仪(Thermo Scientific公司)、超声仪、自动细胞计数仪、电热恒温水箱。
1.1.4 能力确认物质和测试样品OECD TG442E方法附表二能力验证物质:2, 4-二硝基氯苯(2, 4-Dinitrochlorobenzene,DNCB,CAS:97-00-7)、乳酸(CAS:50-21-5)、硫酸镍(CAS:10101-97-0)、脒脲(CAS:39236-46-9)、对苯二胺(CAS:106-50-3)、异丙醇(CAS:67-63-0)、2-巯基苯并噻唑(CAS:149-30-4)、R+柠檬烯(CAS:5989-27-5)、甘油(CAS:56-81-5)、4-氨基苯甲酸(CAS:150-13-0)均购自SIGMA公司;测试样品:染发剂原料3-硝基-4-氨基苯酚(CAS:610-81-1)、染料中间体4-氨基-3-甲基苯酚(CAS:2835-99-6)均购自SIGMA公司。2种超市购买的的染发剂成品,标识齐全,成分标识清晰,使用说明明确,分别编号为染发剂1号、2号。
1.2 方法 1.2.1 THP-1细胞培养THP-1细胞在37 ℃、CO2体积为5%的细胞培养条件下,使用含10%胎牛血清、1%双抗、0.05 mMβ-巯基乙醇的RPMI1640基础培养液在75 cm2培养瓶中水平悬浮培养,镜下观察细胞状态。每隔(2~3) d,300×g离心5 min(离心半径=65 cm)至2×105个/mL进行传代培养。
1.2.2 细胞倍增时间检测接种2×105个/mL密度的细胞于24孔细胞培养板上,每隔24 h(最高72 h)将其适当稀释后,用台盼蓝对活细胞染色并在显微镜下计数。每次测定每组设置3个平行孔。使用公式法计算细胞平均倍增时间,确定细胞稳定性。
$ \text{倍增时间=24}\times \frac{\text{ Log10}\left( \text{2} \right)}{\text{Log10(Con}{{\text{c}}_{\text{high}}}\text{) - Log10(Con}{{\text{c}}_{\text{low}}}\text{)}}\text{ } $ |
式中:Conchigh—第t小时细胞浓度,105个/mL
Conclow_—第(t-24)小时细胞浓度,105个/mL
1.2.3 受试物细胞毒性检测方法 1.2.3.1 流式细胞术检测方法受试物提前溶解于RMPI1640完全培养液(最高浓度设置为5 mg/mL)或者DMSO (最高浓度设置为1 mg/mL)中,2倍倍比稀释配制6个浓度值。如果细胞毒性结果无法计算出细胞75%活率所对应的受试物质量浓度值(75% cell viability,CV75)则适当调节受试物浓度,但终浓度不允许超过5 mg/mL(1640)和1 mg/mL(DMSO)。以2×105个/mL的初始密度培养2 d后,调节细胞密度至2×106个/mL,取受试物和细胞各500 μL混合接种于24孔板上。将孔板置于细胞培养箱中孵育24 h后,转移至1.5 mL离心管中,4 ℃下300×g离心5 min(离心半径:5 cm)。收集细胞后加入1 mL染色缓冲液(PBS+0.1%BSA)清洗,加入7-AAD对死细胞进行染色。1 mL染色缓冲液清洗两次。最终加入500 μL染色缓冲液重悬细胞,移入5 mL流式管上机测定。选取流式细胞仪FL3通道对7-AAD染色进行测定,利用空白细胞调节流式细胞仪电压,建立测定方法,一次进样累计收集10000个活细胞。根据流式细胞仪给出的活细胞占总细胞的百分比得到受试物6个不同浓度下的细胞活率。在不同两天进行两次独立平行试验得到两组数据,用R软件绘制受试物细胞毒性曲线并计算CV75值。
1.2.3.2 CCK-8检测方法以2×105个/mL的初始密度培养2 d后,将细胞密度调节至1×106个/mL。受试物处理同上。取受试物溶液和细胞悬液各100 μL混合接种至96孔平底板上,每个浓度设置3个平行复孔。每次同时设置溶剂对照(细胞和培养液1 :1混合)、空白对照(除细胞外的其他介质)。将96孔板置于37 ℃细胞培养箱培养24 h后,每孔加入20 μL CCK-8染液,置于培养箱培养3 h。450 nm波长下使用酶标仪测定每孔OD值。
细胞活性=(受试孔OD值-空白孔OD值)/(溶剂对照孔OD值-空白孔OD值)。用R软件绘制受试物细胞毒性曲线并计算CV75值。
1.2.4 CD86和CD54表达测定根据已经测得的CV75值配制受试物浓度。最高浓度设置为1.2× CV75,1.2倍稀释得到6个浓度。细胞以2×105个/mL的初始密度培养2 d后,离心调节密度至2×106个/mL。取受试物和细胞各500 μL混合接种于24孔板上。将孔板置于细胞培养箱中孵育24 h。24 h后将细胞从24孔板转移到1.5 mL离心管,使用1 mL的染色缓冲液清洗1次。洗完后使用人Fc受体阻断剂对细胞进行Fc段抗体封闭和7-AAD染色,完成后使用1 mL的染色缓冲液清洗1次,再分别对细胞进行抗体染色(FITC-CD86、PE-CD54)和同型对照染色(FITC-IgG1、PE-IgG1)。每管加入FACS缓冲液形成共50 μL的染色体系,4 ℃暗室下进行抗体染色30 min。染色完成后加入200 μL染色缓冲液清洗两次。最终用500 μLFACS缓冲液重悬细胞移至流式管中待用。用空白细胞和单染细胞调节电压补偿,建立测定方法,确定活细胞范围并获取相应的荧光强度指标。
荧光强度均值(MFI)=荧光强度几何平均数
$ {\rm{相对荧光强度}}\left( {{\rm{RFI}}} \right){\rm{ = }}\frac{{\left( {{\rm{化学物质处理组MFI - 化学物质处理组同型对照MFI}}} \right) \times {\rm{100}}}}{{\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;{\rm{溶剂对照组 - 溶剂对照处理组同型对照MFI}}\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;}} $ |
本实验每组化学物质至少需要两次独立试验。每次实验在细胞活率大于50%的前提下,如果RFICD86≥150,则该次CD86表达判定为阳性;RFICD54≥200,则该次CD54表达判定为阳性。两次实验中CD86和CD54任一指标两次判定为阳性则判定该物质具有致敏性。如果两次实验CD86和CD54的表达均不具有一致性,则进行第三次实验。若第三次试验中CD86和CD54表达均为阴性,判定为非致敏物,否则判定该物质具有致敏性。
1.2.6 有效作用浓度计算对于具有致敏性的物质,进一步进行有效作用浓度(Effective Concentration,EC)值的计算。对CD86分子指标,计算EC150:CD86的RFI达到150时受试物的最低有效浓度。对CD54分子指标,计算EC200:CD54的RFI达到200时受试物的最低有效浓度。选取RFI>150(CD86)或200(CD54)的最低浓度作为A浓度(μg/mL);RFI < 150(CD86)或200(CD54)的最高浓度作为B浓度(μg/mL)。
EC150(CD86)=B浓度+[(150-BRFI)/(ARFI-BRFI)×(A浓度-B浓度)]
EC200(CD54)=B浓度+[(200-BRFI)/(ARFI-BRFI)×(A浓度-B浓度)]
若所测浓度范围内RFI均>150(CD86)或200(CD54),选取最低浓度作为B浓度,选取比BRFI大至少10%的最低浓度值作为A浓度。
EC150=2^{log2(B浓度)+(150-BRFI)×[log2(A浓度)-log2(B浓度)]/(ARFI-BRFI)}
EC200=2^{log2(B浓度)+(200-BRFI)×[log2(A浓度)-log2(B浓度)]/(ARFI-BRFI)}
两次独立平行实验中选取较高的EC150和EC200值作为测定最终值。
1.2.7 统计学方法实验数据采用R软件进行分析,数据之间差异用单因素分差分析进行比较,显著性水平α=0.05,P < 0.05认为差异具有统计学意义。
1.2.8 质量控制进行CD54和CD86表达测定实验的时候,同时设置培养基对照、溶剂对照和阳性对照(2.5 μg/mL的DNCB)。每两个星期对细胞稳定性进行检测,使用2.5μg/mL的DNCB作为阳性检测物,2000 μg/mL的乳酸作为阴性检测物。当细胞可以准确对阳性和阴性物进行表达区分时才可以继续进行实验。细胞的使用不超过30代。
2 结果 2.1 细胞培养图 1为THP-1细胞生长曲线,公式法计算出使用的THP-1细胞平均倍增时间为41 h(8次独立实验测定的时间范围为32~45 h),符合正常生长THP-1细胞倍增时间(均值43 h,范围30~55 h)[1]。
2.2 验证物质检测结果 2.2.1 细胞毒性检测结果
验证物质的细胞毒性CV75值见表 1,由表可见流式法和CCK-8法测定10种不同致敏级别的验证物质(1种极强致敏物、1种强致敏物、2种中等致敏物、2种弱致敏物、4种非致敏物)的细胞毒性结果均符合OECD参考值范围。
2.2.2 细胞毒性两种检测方法比较
CCK-8法和流式法测定细胞毒性结果的一致性检验见表 2。使用组内相关系数(intraclass correlation coefficient,ICC)对两种细胞毒性检测方法的一致性进行分析。用R软件中psych包的ICC功能实现,ICC模型选取Two-way,计算类型选取absolute agreement。单测量预测的ICC值为0.993(P < 0.001),>0.75。判断两种方法测量结果的一致性好。
2.2.3 CD86和CD54表达结果
10种验证物质致敏性测定结果及相应的EC值见表 3。每种物质进行两次平行独立测定,每次测定所得EC值分别见表中第一次和第二次结果。10种验证物质的致敏性的预测和EC值均和OECD参考值范围一致。
μg/mL | ||||||||
致敏性 | 验证物质 | EC150 | EC200 | OECD EC150 参考范围[9] |
OECD EC200 参考范围[9] |
是否符合OECD 范围[9] |
||
第一次 | 第二次 | 第一次 | 第二次 | |||||
极强致敏物 | DNCB | 1.65* | 1.23 | 2.22* | 1.81 | 0.5~10 | 0.5~15 | 是 |
强致敏物 | 对苯二胺 | 3.11 | 6.25* | 4.74* | 阴性 | < 40 | 阴性or>1.5 | 是 |
中等致敏物 | NiSO4 | 24.50* | 22.31 | 34.86 | 52.99* | < 100 | 10~100 | 是 |
2-巯基苯丙噻唑 | 58.85 | 74.56* | 109.05 | 137.10* | 阴性or >10 | 10~140 | 是 | |
弱致敏物 | 脒脲 | 30.04 | 40.08* | 28.09 | 38.01* | 20~90 | 20~75 | 是 |
R+柠檬烯 | 阴性 | 阴性 | 109.79* | 108.45* | 阴性or>5 | < 250 | 是 | |
非致敏物 | 4-氨基苯甲酸 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性(>1000) | 阴性(>1000) | 是 |
乳酸 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性(>5000) | 阴性(>5000) | 是 | |
甘油 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性(>5000) | 阴性(>5000) | 是 | |
异丙醇 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性(>5000) | 阴性(>5000) | 是 | |
注:“*”为最终确定EC值 |
验证物质中6种致敏阳性物CD86和CD54的相对荧光强度值及细胞活率结果分别见图 2和图 3。由图可见,每次测定中至少一半浓度范围下细胞活率大于50%,随着受试物浓度的增加,细胞活率总体呈现下降趋势。
验证物质中4种致敏阴性物CD86和CD54相对荧光强度值及细胞活率结果分别见图 4和图 5。4-氨基苯甲酸、甘油和异丙醇三种物质虽然在最高浓度时细胞活率仍大于90%,但由于已经达到本实验规定的最大溶解浓度(5 mg/mL),按OECD标准判定为致敏阴性物。
4种样品CD86和CD54的相对荧光强度值及细胞活率结果分别见图 6和图 7。两次独立测定过程中,4种样品的CD54都产生了阳性表达,3-硝基-4-氨基苯酚产生了一次CD86阳性表达,其他3种样品的CD86均为阴性表达。
2.3 样品测定结果
4种样品的h-CLAT致敏性结果、CV75值和EC值见表 4,两次独立测定所得EC值分别见表中第一次和第二次结果。4种样品的致敏性检测结果均和小鼠局部淋巴结(Local Lymph Node Assay, LLNA)试验检测结果一致。
3 讨论
本研究选用OECD 442(E)附表中推荐的10种验证物质进行能力认证,在实验室建立了可靠的h-CLAT体外皮肤致敏筛查方法。方法建立后对2种原料和2种染发剂成品的致敏性做出了阳性判定。3-硝基-4-氨基苯酚和4-氨基-3-甲基苯酚都是常见的染发剂原料,两种化合物中均含有4-氨基苯酚的结构,而4-氨基苯酚被认为具有皮肤致敏性[11]。2种染发剂成品原料的有效成分相似,都含有间苯二酚、m-氨基苯酚等被普遍认为具有致敏性的染料[12]。结合和已知LLNA判定结果一致,可以认为样品的阳性判定结果准确。
在方法建立过程中,和OECD TG442E标准方法不同的地方是更改了同型对照和细胞活率的染色试剂。测定CD54分子同型对照时选用的是PE标记的小鼠IgG1抗体,而非OECD中使用的FITC标记的小鼠IgG1。在OECD TG442E中分别使用了FITC和PE对CD86和CD54进行标记,而在扣除非特异性结合的时候只使用单一的FITC标记的小鼠IgG1抗体作为同型对照。考虑到PE和FITC在荧光表达上具有差别,所以本法分别使用相对应的染料扣除非特异性结合,从而获得更准确的荧光强度值。检测细胞毒性时选用的染料为7-AAD而非OECD方法中使用的PI染料。7-AAD和PI都是核酸染料,对死亡细胞进行DNA染色,于488 nm处被激发。不同的是7-AAD发射波长比PI窄,只在流式细胞仪上的FL-3通道进行检测。而PI发射波长同时占用FL-2和FL-3两个通道,对同样在FL2通道检测的PE-CD54荧光测定干扰较大。由于7-AAD干扰小,通过后期荧光补偿的调节,可以达到在前期染色时对一管细胞同时进行7-AAD、FITC、PE三种染料的多染,从而精简了实验操作。
本研究对10种验证物质分别使用CCK-8法和7-AAD染色流式法两种方法检测细胞毒性,测定结果均在OECD参考值范围内,且一致性很高。说明可以考虑使用CCK-8法代替流式法进行CV75浓度范围的确定。7-AAD是一种核酸染料,无法通过正常质膜,只能对坏死细胞进行DNA染色,常和Annexin V- PE联用用以区分早期凋亡细胞和坏死细胞。CCK-8法测定原理是试剂中的WST-8被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物,生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,通过检测OD值对活细胞数量进行测定。对10种验证物质细胞毒性的测定中,除了对苯二胺,CCK-8法测定的CV75毒性阈值均低于流式法,原因可能是CCK-8检测的是正常活性细胞,而对于一些已经发生早期凋亡但未完全坏死的细胞,7-AAD并未进行染色。所以在相同浓度下流式法检测出细胞活率高于CCK-8法。但出现此种结果的具体生物机制还有待深入研究。Ashikaga[13]在h-CLAT的优化实验中就曾经使用MTT法来测定细胞毒性,CCK-8和MTT基本原理基本相似,但CCK-8操作更为便捷、灵敏度更高,是更好的优化方法。
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