镉是天然存在的金属元素，环境中的镉一方面来自矿产及岩层中，另一方面来自工农业生产过程中的污染排放[1]。体内存在的镉均来自外界环境，镉及其化合物可通过呼吸道及消化道进入人体，主要累积在肝脏和肾脏。国际癌症研究机构(IARC)将其列为1类致癌物，主要是由于通过吸入暴露可以明确导致肺癌的发生[2]。美国环保局(USEPA)将其通过吸入暴露致癌性列为B1组(很可能致癌)，将经口暴露致癌性列为D组(不确定为人类致癌物)[3]，说明不同途径接触镉引起的健康效应有明显差异。对于一般人群来说，经口摄入为其主要暴露方式，食物和水均可以因为土壤及水源中的污染导致镉离子含量升高。研究表明，根据镉化合物的溶解性不同，啮齿类动物经口半数致死剂量也有很大差别[4]，急性镉中毒主要引起呕吐等症状，慢性镉中毒主要对肾脏以及骨组织造成损伤。
我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)[5]规定饮用水中镉限值为0.005 mg/L，由于天然水中存在的镉含量很低，水中镉离子质量浓度增高多为企业不按规定排放含镉废水所致，近年来饮用水源被镉污染的现象时有发生[6]，供水单位的传统处理工艺不足以有效清除突发水污染事件时高浓度的含镉污水[7]。在加大力度规范企业排放废水的同时，有必要研究短期镉暴露所引起的健康效应，以备在突发水污染事件时监控健康效应指标，合理向公众告知其健康效应及可能产生的影响，消除公众恐慌情绪。
本文以SD大鼠为试验动物，14和28 d为试验周期，评价氯化镉短期经口暴露引起大鼠急性毒效应，以验证EPA根据保护敏感人群原则所制定的短期暴露健康参考值[8]，为镉短期暴露健康效应提供相应的毒理学依据。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂7180型生化分析仪(日立公司，日本)、Clinitek Advantus尿液分析仪(西门子，德国)，电感耦合等离子体质谱仪(Thermo Fisher公司，美国)，Milli-Q纯水机(Millipore公司，美国)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)大鼠血清生化检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，中国)，标准溶液(AccuStandard公司，美国)，氯化镉(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，中国)。
1.2 实验动物健康清洁级雄性SD大鼠，(200~ 300)g，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2015-0005。饲养于中国疾病预防控制中心清洁级动物房内，动物房使用许可证号SYXK(京)2014-0043。实验期间，大鼠可自由摄食、饮水，22℃~24℃。本动物实验经中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所实验动物管理与福利伦理审查委员会审查并批准(2016007)。适应性饲养1周后开始实验。
1.3 实验方法根据美国环境保护总署(Environmental Protection Agency, EPA)[8]参考的1978年Kotsonis和Klaassen进行的大鼠24周饮水暴露效应研究，选择与原文献相对应的0.8、2.0和5.0 mg/(kg ·d)3个剂量组，由于暴露方式及暴露时间与该研究不同，因此增加了最低、最高剂量组以观察短期经口暴露健康效应。将72只SD大鼠随机分为1个阴性对照组(去离子水)和0.4、0.8、2.0、5.0和12.5 mg/(kg ·d) (以镉计)5个剂量组，每组12只。采用经口灌胃方式连续染毒28 d，每日1次。每周测定并记录体重、进行尿常规检测。于染毒后14和28 d分别处死每组6只大鼠。腹主动脉取血，检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、及血尿素氮(BUN)。用电感耦合等离子体质谱仪检测血清中镉含量。取肝、肾、脾、脑和睾丸，分别称重计算脏器系数，并进行病理检测。
1.4 统计分析实验结果数据以x±s表示，应用SPSS 22.0软件(IBM，美国)进行统计学分析。体重等数值变量采用单因素方差分析法，方差齐时组间两两比较用LSD法分析，方差不齐时用Dunnett法分析。尿常规等分类变量采用Kruskal-Wallis非参数秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 氯化镉对大鼠摄食量和体重影响结果如表 1所示，随灌胃剂量升高，除2.0 mg/(kg ·d)剂量组外，大鼠平均进食量呈现下降趋势。大鼠体重随饲养时间增加而增长。试验组大鼠在各时间点，体重随灌胃剂量升高而降低，5.0和12.5 mg/(kg ·d)剂量组在各时间点大鼠体重与阴性对照组相比差别有统计学意义(P < 0.01)。第28天时，除最低剂量组[0.4 mg/(kg ·d)]外，其他实验组与阴性对照组相比，体重均呈现有统计学差异的降低(P < 0.05)。
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | 平均进食量/ [g/(只·d)] | 0 d | 7 d | 14 d | 21 d | 28 d |
| 0 | 29.26±1.42 | 214.53±8.92 | 285.48±12.99 | 343.67±17.71 | 389.33±10.56 | 423.00±20.60 |
| 0.4 | 27.27±0.77 | 215.82±8.59 | 284.89±12.20 | 345.83±21.57 | 380.00±22.94 | 416.00±17.30 |
| 0.8 | 24.08±3.94* | 216.15±11.62 | 281.38±15.03 | 343.42±20.40 | 365.50±22.12 | 397.33±21.01* |
| 2.0 | 29.53±3.57 | 216.31±7.74 | 283.46±8.41 | 335.92±9.28 | 373.17±8.35 | 399.50±17.06* |
| 5.0 | 23.38±2.78** | 214.96±8.89 | 269.99±13.74** | 324.75±13.17** | 353.17±14.77** | 381.33±16.16** |
| 12.5 | 22.25±3.36** | 212.49±7.48 | 258.03±16.04** | 304.80±19.31** | 326.20±19.78** | 352.20±18.90** |
| 注：“*”与阴性对照组相比，P < 0.05；“ **”与阴性对照组相比，P < 0.01 | ||||||
2.2 氯化镉对大鼠脏器系数的影响
第14天及第28天时大鼠脏器系数见表 2和表 3。由表 2可见染毒暴露14 d，高剂量组[12.5 mg/(kg ·d)]肾脏系数与阴性对照组相比明显降低(P < 0.01)，其余脏器均无明显变化。表 3所示染毒暴露28 d，0.8 mg/(kg ·d)剂量组大鼠肝脏系数与阴性对照组相比降低(P < 0.05)，但并未呈现有剂量反应关系的改变；脑及睾丸的脏器系数结果显示，高剂量组[12.5 mg/(kg ·d)]与阴性对照组相比明显增加(P < 0.05)。
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | 肝 | 肾 | 脾 | 脑 | 睾丸 |
| 0 | 4.48±0.31 | 0.79±0.08 | 0.25±0.05 | 0.56±0.07 | 0.88±0.05 |
| 0.4 | 4.40±0.37 | 0.74±0.03 | 0.25±0.04 | 0.56±0.06 | 0.96±0.09 |
| 0.8 | 4.16±0.19 | 0.74±0.05 | 0.26±0.02 | 0.56±0.04 | 0.91±0.14 |
| 2.0 | 4.16±0.42 | 0.78±0.03 | 0.24±0.03 | 0.58±0.04 | 0.98±0.09 |
| 5.0 | 4.31±0.29 | 0.74±0.01 | 0.23±0.01 | 0.58±0.02 | 0.85±0.08 |
| 12.5 | 4.29±0.15 | 0.71±0.05** | 0.22±0.02 | 0.60±0.06 | 0.89±0.12 |
| 注：“ **”与阴性对照组相比，P < 0.01 | |||||
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | 肝 | 肾 | 脾 | 脑 | 睾丸 |
| 0 | 4.06±0.39 | 0.67±0.04 | 0.22±0.04 | 0.48±0.04 | 0.80±0.04 |
| 0.4 | 3.95±0.21 | 0.69±0.07 | 0.29±0.07 | 0.47±0.03 | 0.85±0.04 |
| 0.8 | 3.67±0.39* | 0.68±0.02 | 0.21±0.02 | 0.51±0.03 | 0.85±0.03 |
| 2.0 | 3.79±0.17 | 0.65±0.04 | 0.22±0.05 | 0.50±0.02 | 0.85±0.09 |
| 5.0 | 3.83±0.24 | 0.65±0.02 | 0.18±0.01 | 0.50±0.03 | 0.86±0.07 |
| 12.5 | 3.82±0.23 | 0.68±0.03 | 0.22±0.03 | 0.52±0.04* | 0.97±0.08** |
| 注：“*”与阴性对照组相比，P < 0.05；“ **”与阴性对照组相比，P < 0.01 | |||||
2.3 氯化镉对大鼠血清ALT、AST和BUN的影响
表 4结果显示染毒14 d，氯化镉并未引起血清ALT、AST及BUN等指标的改变。染毒28 d后血清ALT随染毒剂量增加而升高，5.0和12.5 mg/(kg ·d)剂量组与阴性对照组相比差异显著(P < 0.05)，且呈现明显的剂量反应关系；实验组血清AST及BUN指标与阴性对照组相比并无明显差异。
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | 14 d | 28 d | |||||
| ALT/(U/L) | AST/(U/L) | BUN/(mmol/L) | ALT/(U/L) | AST/(U/L) | BUN/(mmol/L) | ||
| 0 | 52.20±7.60 | 114.00±8.31 | 5.47±0.59 | 45.33±5.54 | 118.33±25.59 | 5.27±0.86 | |
| 0.4 | 55.00±8.60 | 122.00±26.75 | 5.57±0.47 | 38.83±6.97 | 94.83±16.93 | 4.65±0.46 | |
| 0.8 | 49.67±6.19 | 116.00±10.58 | 5.72±0.61 | 53.83±12.25 | 134.00±10.56 | 5.40±0.69 | |
| 2.0 | 56.67±9.48 | 118.33±36.46 | 5.04±0.25 | 48.00±5.44 | 123.17±22.01 | 5.28±0.22 | |
| 5.0 | 63.60±11.15 | 100.40±25.71 | 5.25±0.79 | 65.83±25.81* | 136.83±41.56 | 5.53±0.81 | |
| 12.5 | 81.00±24.18 | 120.50±19.43 | 5.67±0.50 | 74.20±20.32** | 137.20±18.86 | 5.28±0.73 | |
| 注：*与阴性对照组相比，P < 0.05；**与阴性对照组相比，P < 0.01 | |||||||
2.4 氯化镉对大鼠尿常规指标的影响
实验开始至实验结束(28 d)，尿胆红素(BIL)、隐血(BLD)、尿亚硝酸盐(NIT)及尿白细胞(LEU)均为阴性。尿胆原(UBG)均为3.2 μmol/L。尿葡萄糖(GLU)、尿酮体(KET)及尿蛋白(PRO)(表 5)，尿比重(SG)及pH(表 6)，经统计学分析结果显示各实验组与阴性对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。
| 剂量/ [mg/ (kg·d)] | 尿葡萄糖(GLU) | 尿酮体(KET) | 尿蛋白(PRO) | |||||||||||||||||||||||
| 0 d | 14 d | 28 d | 0 d | 14 d | 28 d | 0 d | 14 d | 28 d | ||||||||||||||||||
| 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | |||||||||
| 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 5 | 1 | 5 | 1 | 5 | 1 | 4 | 2 | 4 | 2 | 6 | 0 | ||||||||
| 0.4 | 5 | 1 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 4 | 2 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 5 | 1 | ||||||||
| 0.8 | 5 | 1 | 5 | 1 | 4 | 2 | 5 | 1 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 1 | 6 | 0 | 6 | 0 | ||||||||
| 2.0 | 5 | 1 | 6 | 0 | 5 | 1 | 6 | 0 | 5 | 1 | 5 | 1 | 5 | 1 | 6 | 0 | 6 | 0 | ||||||||
| 5.0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 5 | 1 | 4 | 2 | 4 | 2 | 4 | 2 | 6 | 0 | 5 | 1 | 6 | 0 | ||||||||
| 12.5 | 5 | 1 | 5 | 1 | 3 | 3 | 6 | 0 | 6 | 0 | 5 | 1 | 5 | 1 | 5 | 1 | 6 | 0 | ||||||||
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | SG | pH | |||||
| 0 d | 14 d | 28 d | 0 d | 14 d | 28 d | ||
| 0 | 1.012±0.007 | 1.013±0.013 | 1.017±0.008 | 7.83±0.61 | 7.92±0.97 | 7.75±0.88 | |
| 0.4 | 1.018±0.008 | 1.016±0.009 | 1.018±0.008 | 7.25±0.76 | 7.58±0.74 | 7.25±0.42 | |
| 0.8 | 1.013±0.008 | 1.013±0.003 | 1.015±0.004 | 7.58±0.80 | 7.67±0.52 | 7.25±0.42 | |
| 2.0 | 1.022±0.010 | 1.010±0.004 | 1.013±0.004 | 7.25±0.69 | 7.75±0.52 | 7.58±0.80 | |
| 5.0 | 1.015±0.008 | 1.010±0.004 | 1.012±0.003 | 7.60±0.96 | 8.30±0.27 | 7.80±0.91 | |
| 12.5 | 1.014±0.007 | 1.013±0.008 | 1.013±0.003 | 7.58±0.74 | 7.50±0.71 | 7.92±0.66 | |
2.5 氯化镉对大鼠血清镉含量的影响
从质谱仪检测血镉质量浓度结果(表 7)可看出，氯化镉连续经口暴露能够使大鼠血镉质量浓度随镉暴露剂量升高而逐渐增加。且28 d时血镉质量浓度明显高于相对应剂量14 d时血镉质量浓度，说明经口暴露氯化镉能够导致血镉产生累积效应，高剂量血镉质量浓度增加较低剂量更为明显。
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | 14 d/ (μg/L) | 28 d/ (μg/L) |
| 0 | — | — |
| 0.4 | 0.32±0.17 | 0.44±0.37 |
| 0.8 | 0.60±0.33 | 0.64±0.17 |
| 2.0 | 1.21±0.47 | 2.42±1.02 |
| 5.0 | 2.10±0.82 | 3.32±0.85 |
| 12.5 | 7.79±0.52 | 11.38±3.41 |
| 注：“—”为未检出 | ||
| 剂量/ [mg/(kg·d)] | 病变分级(14 d) | 病变分级(28 d) | |||
| 0 | 1 | 0 | 1 | ||
| 0 | 4 | 2 | 1 | 5 | |
| 0.4 | 4 | 2 | 2 | 4 | |
| 0.8 | 6 | 0 | 0 | 6 | |
| 2.0 | 4 | 2 | 0 | 6 | |
| 5.0 | 1 | 4 | 4 | 2 | |
| 12.5 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
| 注：病变分级0，无病理改变；1，肾小管有轻微玻璃样变 | |||||
2.6 氯化镉对大鼠组织病理的影响
连续经口染毒氯化镉14及28 d，并未引起大鼠肝脏、脾脏、脑和睾丸组织发生病理改变，肾脏检查病理结果见表 7，观察到肾小管上皮细胞有轻微的玻璃样变，但上述病变在阴性对照组及其它各剂量组均有发现，未见明显的剂量关系，无统计学差异，可能是由于大鼠自发性病变，不是由受试物引起的相关病理改变。
3 讨论原环保部会同原卫生计生委等多部门，于2017年发布了我国《优先控制化学品名录(第一批)》，镉及镉化合物被列为22种优先控制化学品之一[9]。全世界对镉的使用进行了严格的管控，但我国作为镉矿的储备大国(约占全球20%)及镉的生产大国(约占全球30%)[10]，依旧不能忽视镉对人类健康产生的急、慢性危害[11]。
本实验基于Kotsonis的实验[12]，为观察大鼠经口短期暴露镉引起的急性损伤，因此设计实验周期为28 d。从各项指标检测结果来看，EPA参考的用于计算10 d健康参考值的NOAEL(0.8 mg/kg ·d)在短期摄入14 d未引起各项异常，证明利用其计算的10 d健康参考值安全；经口暴露28 d内时，0.8 mg/kg ·d剂量组开始大鼠体重明显降低，说明长期低剂量摄入镉会产生一定的健康效应。出于安全考虑，EPA在确定露10 d的健康参考值时，保守推荐了用暴露1 d的健康参考值0.04 mg/L[13]作为暴露10 d的健康参考值，更增大了安全系数。本实验中也增加了0.04 mg/L所对应的剂量0.4 mg/kg ·d作为实验最低剂量，亦未发现任何指标出现异常反应。
5.0和12.5 mg/kg ·d剂量组大鼠平均每日进食量显著降低，导致体重从第一周开始增长减慢，应为灌胃剂量增大引起食欲不振造成相应影响，说明短期摄入高剂量镉能够影响体重。12.5 mg/kg ·d镉能够引起血ALT升高，提示肝脏受损，但病理报告未见肝出现实质性损伤，说明短时间摄入高剂量的镉能够引起肝功能异常，但未能形成实质性的病理改变。由于观察时间的不同，本实验未能得到与Kotsonis进行的24周大鼠实验研究[12]一致的健康损害效应(包括6周时产生的肾损伤及蛋白尿，以及24周时高剂量组肾小管萎缩)，但该研究开始到3周时进行所有指标测定未见任何指标异常，这与本实验基本一致。在14 d时，高剂量(12.5 mg/kg ·d)大鼠肾脏系数明显低于阴性对照组，是由于高剂量镉显著降低大鼠体重同时使肾重明显减轻而造成，28 d时由于自适应能力使得肾脏系数与阴性对照无明显差异，说明正常机体能够消除外界污染物带来的一定影响，但随着体内血镉质量浓度不断的累积，机体尤其是肝脏和肾脏等代谢器官能否在污染物长期暴露下发挥正常功能，且对于肾脏功能异常机体能否有效抵御镉造成的影响，需要进一步研究加以证实。
本实验为镉短期经口暴露所引起的健康效应积累了相应数据，为更好的应对突发水污染事件所产生的健康影响评估提供了实验依据。由于镉在体内半衰期较长，短期暴露在健康效应上不会产生极为严重的后果，但在制定镉相应的短期健康参考值时应充分考虑到半衰期的影响，以充分考虑人类健康为目的，制定严格的管理标准。
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