引用本文
阳晓燕, 袁园, 石莹, 王翀, 张宏伟, 阮鸿洁. 应用小鼠局部淋巴结ATP检测法检测染发剂刺激性[J]. 环境卫生学杂志, 2018, 8(6): 499-502.
YANG Xiaoyan, YUAN Yuan, SHI Ying, WANG Chong, ZHANG Hongwei, RUAN Hongjie. Evaluation on Skin Irritation of Hair Dyes with Modified Local Lymph Node Assay[J]. Journal of Environmental Hygiene, 2018, 8(6): 499-502.
应用小鼠局部淋巴结ATP检测法检测染发剂刺激性
阳晓燕, 袁园, 石莹, 王翀, 张宏伟, 阮鸿洁     
中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所
基金项目: 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所横向课题（FZ015）
作者简介: 阳晓燕, 硕士, 从事环境毒理学工作
通信作者: 阮鸿洁, 副主任技师, 主要从事化学品毒理研究, Email:ruanhongjie@uieh.chinacdc.cn
联系方式：北京市朝阳区潘家园南里7号；邮编：100021；Email:yangxiaoyan@nieh.chinacdc.cn
摘要: 目的 对比小鼠局部淋巴结法ATP检测法（LLNA：DA）和经典皮肤刺激实验，评价两方法检测染发剂刺激性的能力。方法 市场随机购买15种不同牌子染发剂，按照OECD442（A）和OECD404标准方法，对15种染发剂进行刺激性检测。结果 LLNA：DA法中3号、4号、5号、6号、11号、13号和15号染发剂具有刺激性；多次皮肤刺激实验中3号、7号、和13号具有轻刺激性，4号和11号具有中刺激性。结论 LLNA：DA法检测染发剂刺激性的能力与多次皮肤刺激实验相当，值得深入探讨研究。
关键词: 染发剂    刺激性    局部淋巴结法    
Evaluation on Skin Irritation of Hair Dyes with Modified Local Lymph Node Assay
YANG Xiaoyan, YUAN Yuan, SHI Ying, WANG Chong, ZHANG Hongwei, RUAN Hongjie
Abstract: Objectives To compare a murine local lymph node assay (LLNA):DA method and the classical dermal irritation method to evaluate the dermal irritation of hair dyes, and evaluate their ability of detecting the irritation of hair dyes. Methods Fifteen kinds of hair colorants were randomly selected. The sensitization of 15 kinds of hair dyes were examined according to OECD442 (A) and OECD442 (B) standard method. Results Samples No.3, 4, 5, 6, 11, 13 and 15 showed a positive irritation tested by LLNA:DA method. Samples No.3, 4 and 5 showed a light positive irritation and samples No.11 and 13 showed a moderate positive irritation tested by dermal irritation test. Conclusions The sensitivity of LLNA:DA method for evaluating the dermal irritation of hair dyes was equal to that of classical dermal irritation test.
Key words: hair dyes    irritation    murine local lymph node assay    

染发剂是一类特殊的化妆品，含有芳香胺类、氨基苯酚类、过氧化氢偶氮类、三苯甲烷、蒽醌或吲达胺类等，具有刺激性、致敏性、致癌性及致突变性等毒理学特性，其毒性不容忽视[1]。

小鼠局部淋巴结ATP检测法(Local lymph node assay :DA，LLNA :DA)是化学品皮肤致敏性检测的方法之一[2-4]。在实验过程中也会伴随着刺激性指标(耳厚差和耳重)的检测[5-7]，多数学者只重视该实验对受试物致敏性的判断，仅仅将耳厚差和耳重当作辅助判断致敏性的指标，忽略了该实验也能对受试物刺激性进行“有或无”的初步判断。本实验将LLNA :DA法中的刺激指标单独分出，与经典的动物刺激实验结果进行比较，旨在对比两实验对受试物刺激性判断的能力，评价LLNA :DA法能否与经典刺激实验一样评价受试物的刺激性，为染发剂刺激性检测方法提供数据依据。

1 材料和方法 1.1 实验动物

SPF级Balb/c小鼠，购于北京华阜康生物科技股份有限公司(合格证号：SCXK(京)2014-0004)，雌性，(8~12)周龄，(18~22) g。动物实验环境条件：SPF动物房，温度22℃±2℃，相对湿度60%~80%，12/12 h黑白交替照明。

白色成年、健康、皮肤无损伤家兔，购于北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司(合格证号：SCXK(京)2015-0005)，单笼饲养，常规饲料，饮水不限。

1.2 仪器和试剂

分析天平(万分之一)；打孔器(直径9 mm)；十二烷基硫酸钠(Sodium Lauryl Sulfate，SLS)，购于Sigma公司。

受试物：15种随机采购的不同牌子的染发剂，A牌2.0、B牌3.0、C牌黑发霜882S、C牌染发膏3 N、C牌黑发霜8833S、D牌无氨20、B牌53、A牌3.68、A牌4-5、D牌2/0、A牌3-0、D牌4/0、E牌2.2 N、F牌38、G牌3-0。

1.3 实验方法

1.3.1 LLNA :DA法

按照OECD TG442(A)[4]的标准方法进行，本实验只介绍耳厚差和耳重两个指标的采集方法，完整方法请参照OECD TG442(A))，具体如下：

Balb/c小鼠适应1周后进行随机分组，4只/组，称重并用游标卡尺测量小鼠右耳耳缘厚度(预实验发现左右耳厚度差距无统计学意义，故为简化实验流程，正式实验全部只测小鼠右耳耳厚)，重复测量3次，取平均值。其次，进行受试物染毒。所有受试物均按照说明书上的配置方法进行配置(例如有的需要A剂和B剂混合)，所有受试物均现配现用。每次染毒前1 h，将小鼠双耳背部分别涂1%的十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate，SLS)，接下来再分组涂抹受试物空白对照不做处理。第1、2、3、7 d重复以上步骤。

第8天测量小鼠耳缘厚度，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠耳廓直径9 mm组织称重(mg)，即指标耳重，重复3次取平均值。第8天的耳缘厚度减去第0天的耳缘厚度即得指标耳厚差。

耳厚差和耳重两个指标中有一个指标受试组与对照组相比差异有统计学意义，则认为该受试物具有刺激性。

1.3.2 多次皮肤刺激实验

试验前将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为3 cm×3 cm，涂抹面积2.5 cm×2.5 cm。受试物配置同LLNA :DA法，现配现用。

染毒第一天，取受试物约0.5 mL(g)涂抹在一侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹1次，连续涂抹14 d。从第2天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。1 h后观察结果，按《化妆品卫生规范》(2007)版皮肤刺激反应评分表进行评分，对照区和试验区同样处理。按以下公式计算每天每只动物平均积分:

每天每只动物平均积分=(∑红斑和水肿积分/受试动物数)/14

按照《化妆品卫生规范》(2007)版皮肤刺激强度分级判定皮肤刺激强度。0~0.5为无刺激性，0.5~2.0为轻度刺激性，2.0~6.0为中等刺激性，6.0~8.0为强刺激性。

1.3.3 统计分析方法

用SPSS 17.0对实验结果进行分析，数据型指标用单因素方差分析进行统计分析，如果差异有统计学意义，则进一步用Dunnt'T检验法对受试组与对照组进行两两比较。用配对χ2检验对实验结果进行比较。

2 结果 2.1 LLNA :DA的实验结果

15种染发剂中，仅4号的耳后差差异有统计学意义，3号、5号、6号、11号、13号和15号染发剂耳重差异均有统计学意义，依照耳后差和耳重有一项差异有统计学意义则判断为有刺激性的标准，将3号、4号、5号、6号、11号、13号和15号染发剂判为刺激性染发剂(表 1)。

表 1 LLNA :DA法检测15种染发剂的结果
序号 样品名称 耳厚差/mm 耳重/mg 刺激性
1 A牌2.0 0.00±0.01 10.90±1.66 -
2 B牌3.0 0.01±0.01 9.90±1.53 -
3 C牌黑发霜882S 0.02±0.01 14.25±1.75** +
4 C牌染发膏3 N 0.10±0.15* 13.53±5.68** +
5 C牌黑发霜8833S 0.04±0.05 13.15±3.66** +
6 D牌无氨20 0.03±0.02 11.88±5.18* +
7 B牌53 0.02±0.01 8.45±0.91 -
8 A牌3.68 0.02±0.01 10.70±2.2 -
9 A牌4-5 0.06±0.07 11.08±2.75 -
10 D牌2/0 0.01±0.01 10.43±5.35 -
11 A牌3-0 0.07±0.09 15.08±8.83** +
12 D牌4/0 0.04±0.03 9.83±1.42 -
13 E牌2.2 N 0.06±0.02 17.45±2.32** +
14 F牌38 0.01±0.01 8.83±2.15 -
15 G牌3-0 0.08±0.14 13.28±3.86** +
16 对照组 0.00±0.00 6.45±0.58
注：“*”表示与对照组比较差异有统计学意义，P < 0.05；“ **”表示与对照组比较差异有统计学意义，P < 0.01；“+”表示刺激阳性；“-”表示刺激阴性
表选项

2.2 多次皮肤刺激实验结果

如表 2结果显示，3号、4号，7号，11号和13号具有刺激性。

表 2 多次皮肤刺激实验检测15种染发剂的结果
序号 样品名称 刺激性
1 A牌2.0 -
2 B牌3.0 -
3 C牌黑发霜882S +
4 C牌染发膏3 N ++
5 C牌黑发霜8833S -
6 D牌无氨20 -
7 B牌53 +
8 A牌3.68 -
9 A牌4-5 -
10 D牌2/0 -
11 A牌3-0 ++
12 D牌4/0 -
13 E牌2.2 N +
14 F牌38 -
15 G牌3-0 -
16 对照组
注：“+ +”表示中刺激性；“+”表示轻刺激；“-”表示无刺激性。
表选项

2.3 两方法结果比较

对两方法进行配对卡方检验(表 1-表 3)。经计算，χ2值为0，P>0.05，差异无统计学意义。

表 3 两方法刺激性结果配对卡方检验
DA法 多次皮肤刺激实验 合计
+ -
+ 5 2 7
- 1 7 8
合计 6 9 15
注：“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果
表选项

3 讨论

LLNA :DA方法中刺激指标的引用最先是为了排除刺激引起的淋巴结的增生[4]，但换个角度思考，该方法中刺激指标也能用于对受试物刺激性进行初步的“有或无”的判断，目前鲜有人对此开展过研究，本实验则针对此空白进行了初步探索。

在本次实验中，LLNA :DA法中3号、4号、5号、6号、11号、13号和15号染发剂具有刺激性；多次皮肤刺激实验中3号、7号、和13号具有轻刺激性，4号和11号具有中刺激性。就“是或否”具有刺激性的判断来说，80%(12/15)的受试物判断结果一致，可以认为两方法对染发剂刺激性判断能力没有差异。如果以多次皮肤刺激实验为标准，LLNA :DA法的灵敏度为83.3%(5/6)，特异度为77.8%(7/9)，假阳性率为22.2%(2/9)，假阴性率为16.7%(1/6)，由于受试物数量有限，故暂时只能保守的认为LLNA :DA法具有判断染发剂刺激性的潜能。

多次皮肤刺激实验受试动物为家兔，染毒14次，实验时长14 d，而LLNA :DA法受试动物为小鼠，染毒4次，实验时长8 d。从动物伦理学和“3R”原则来说，后者无疑具有更大的优势。本次实验初步认为两方法判断受试物刺激性能力相当，但此结论需要扩大受试量和受试范围来予以验证。

本实验随机采购的染发剂来源于不同商场和超市，其中不乏有常见的大品牌，两方法分别有7/15(46.7%)和5/15(33.3%)检测出具有刺激性，提示我国染发剂市场监管方面具有较大的提升空间。

本次实验拓展分析了LLNA :DA法的应用，认为该方法有成为染发剂刺激性检测的潜能，值得深入探索研究。

参考文献
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OECD. Test Guideline No: 442(A) Guideline for the testing of chemicals. Skin Sensitization: Local lymph Node Assay: DA[S]. Paris: OECD, 2010.
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胡培丽, 张露勇, 单纯, 等. LLNA:BrdU-ELISA改良法在化学物/化妆品皮肤刺激性和致敏性评价中的应用[J]. 毒理学杂志, 2015, 29(4): 282-285.
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Zhang HW, Shi Y, Wang C, et al. An improvement of LLNA:DA to assess the skin sensitization potential of chemicals[J]. J Toxicol Sci, 2017, 42(2): 129-136. DOI:10.2131/jts.42.129
DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2018.06.011
中国疾病预防控制中心主办。
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阳晓燕, 袁园, 石莹, 王翀, 张宏伟, 阮鸿洁
YANG Xiaoyan, YUAN Yuan, SHI Ying, WANG Chong, ZHANG Hongwei, RUAN Hongjie
应用小鼠局部淋巴结ATP检测法检测染发剂刺激性
Evaluation on Skin Irritation of Hair Dyes with Modified Local Lymph Node Assay
环境卫生学杂志, 2018, 8(6): 499-502
Journal of Environmental Hygiene, 2018, 8(6): 499-502
DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2018.06.011

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