2016年7月2日黔西南州疾病预防控制中心接到当地州中医院收治一例在其“关节液标本检出土拉弗朗西斯菌”病例的电话报告，接到报告后，中心分管领导本着以为今后科学防控追溯基础资料，立即组织流行病防治、应急办、病媒生物、实验室等相关科室人员赴现场开展流行病学调查与核实，经流行病学调查及实验室相关检测，最后判定为1例熊猴类芽孢杆菌感染者。为探索该杆菌感染人的途径和发病表现等，以及为今后防控工作提供依据，现将调查资料收集整理报告如下。

1 资料方法 1.1 资料来源

对病例进行流行病学个案调查，到病例就诊医疗机构收集病历，临床实验室资料来源于就诊医院的黔西南州中医院。赴病家及村寨开展流行病学现场调查，收集当地气象、农业、地理位置等资料。

1.2 调查内容

病人居住环境、水源、危险因素、当地医疗机构病例主动搜索，以及当地自然疫源性疾病等。

1.3 病原检测

检测标本为病例关节腔无菌操作穿刺抽取关节液。检测方法为医院对患者关节液进行细菌培养，用梅里埃自动细菌分析仪进行鉴定，结果为土拉弗朗西斯菌96%的吻合率。国家疾控中心专家经关节液培养的初始菌用带有抗生素的土拉菌选择性培养，无菌落生长。再将关节液分离的菌株和提取核酸进行16rRNA扩增，得到扩增片段，交由有资质的某公司进行双向测序和拼接，得到完整的1 379 bp的序列，再用Blast对比。

实验所需仪器、试剂全自动微生物鉴定及药敏分析系统(VITEK2)、AC2-4S1型生物安全柜(新加坡艺思高生产)、HH.CP-01型二氧化碳细胞培养箱(上海博讯实业有限公司)、K30B型干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)、21R型高速冷冻离心机(Thermo)、测序仪、含半光氨酸血平板(北京天一辉远生物科技有限公司)；咖啡培养基、上海之江生物有限公司提供的16SrRNA核酸提取试剂、原装进口试剂(土拉热弗朗西斯氏菌血清)等。

2 结果 2.1 基本概况

病例户籍地为黔西南州晴隆县马场乡马场村三组，现住址晴隆县马场乡前进村三组(离马场村三组约1 km)，该村距乡镇约3 km，距县城约30 km，距黔西南州府所在地约100 km，位于黔西南州东北面，前进村三组共有45户203人，为汉族、布依族，苗族、彝族等民族杂居村寨，以旱地为主，水田少，海拔1 420 m，年降雨量1 350 mm左右，年平均温度13.7℃~17.1℃，无霜期大于280 d，农户以饲养猪、牛、犬、鸡为主；农作物主要有玉米、水稻、小麦、洋芋、红苕等，经济作物主要有柑橘、花生、油菜、甘蔗等, 马场的矿产主要有陶土和煤。晴隆县属温凉湿润的高原亚热带季风气候区，气候温和，位于云贵高原中段，苗岭山脉西部，贵州省西南面，黔西南州的东北面，地处东径105°01′~105°25′，北纬25°33′~26°11′之间。

患者龙某，男性，44岁，汉族，已婚，晴隆县人，病例及其家属共8人居住于晴隆县马场乡前进村三组1栋平房和1栋木结构瓦房。患者病前3个月从外地务工回来，2016年1月4日因“发热、咳嗽、胸部不适”就诊于晴隆县医院，1月10日初步诊断为“肺结核”，1月13日按抗结核方案治疗，同时患者口述生病期间在本县城一家私立医院进行理疗，半月后自感膝关节出现“肿胀、疼痛，活动受限”，停药后未改善，但由于家庭生活困难，一直在家观察休养。

2.2 临床表现及体征

2.2.1

2016年6月28日自觉关节肿胀明显，活动受限等，于是前往黔西南州中医院住院治疗，入院诊断为“左膝关节结核”，意识清楚，查体：T36.4℃，脉搏62次/分，呼吸21次/分，血压110/70mmHg, 左膝关节肿胀，皮温不高，关节周围压痛不明显，左膝浮髌试验、过伸过屈试验阳性，肌力Ⅳ级，左腘窝内侧可触及一(8~12) cm包块，左侧腹股沟淋巴结肿大。于2016年6月29日采集病例关节液送本院实验室检测。

2.2.2

该病例截止到2017年7月，咳嗽、咳痰症状消失，病灶处(左膝关节)无变化，但活动有好转。

2.3 家属及当地结核病发病情况

2.3.1

该病例家共计8人，除病例外，其余家属无结核病患病史。

2.3.2 当地2013—2017年结核病发病情况
2.4 实验室检测及辅助检查

2.4.1

菌株鉴定结果黔西南州中医院将病例关节液初始培养出的细菌使用全自动微生物鉴定及药敏分析(VITEK 2)进行鉴定，PyrA(吡咯烷基芳胺酶)为阳性，判定此菌为土拉弗朗西斯菌。再用此菌进行土拉弗朗西斯菌抗原、抗体、病原学和16SrRNA扩增、测序、对比等检测，用菌种鉴定的16SrRNA引物，扩增病例关节液培养出的菌株提取核酸，得到目的扩增片段，进行双向测序和拼接，得到完整的1 379 bp序列，在美国生物技术信息中心(NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)用与提取的生物核酸片段局部序列对比检索(BIast)进行比对，获得同源性最高的微生物是熊猴类芽孢杆菌(Paenibacillusassamensis)。

2.4.2

血常规检测结果白细胞(WBC)数为5.27×10⁹(参考4~10)，红细胞数4.10(参考4.3~5.8)，嗜酸性粒细胞数为0.56(参考0.02~0.5)，中性粒细胞百分比(N)为48.50%(参考50~70)，嗜酸性粒细胞百分比为10.60%(参考值0.5~5)，血红蛋白浓度为116.00(参考值130~175)g/L，红细胞压积为37.50(参考值40~50)，平均红细胞血红蛋白为309.00(参考值320~360)g/L，血小板数为203.00×10⁹(参考值100~300)。

2.4.3

关节液生化检查结果总蛋白39.7(参考值60~ 80)g/L，葡萄糖6.60(参考值3.6~6.11)mmol，乳酸脱氢酶430.0(参考值109~245)U/L。

2.4.4

CT检查结果右肺尖肺泡大；右上肺感染性病变；左膝关节软组织改变，化脓感染可能性大；左膝关节退行性变；左侧腘窝包块超声波检查示：左侧腘窝液实混合性包块。

2.5 病原生物学特性

类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的种类原归在芽孢杆菌属(Bacillus)，随着分子生物学的发展，16S rDNA序列分析、基因探针以及类脂分析、醌类分析等技术的应用，芽孢杆菌属已从原来的1个属发展分为8个属，1993年由Ash等应用PCR探针技术将原属于芽孢杆菌属的11个种分出来，建立了新属—类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，此属倾向会产生膨胀的、椭圆形的芽孢。

熊猴类芽孢杆菌通常分布在温水、土壤等环境中，革兰染色可变，为严格需氧嗜温菌，可形成孢子，细胞长约(1.0~2.5) μm，宽约(0.5~0.6) μm，菌落呈圆形。

2.6 病例居住地环境及水源调查

患者家依山而建的住房为一栋木结构瓦房和一栋砖混结构平房，位于村寨背后，房前有稻田，有一水泥砖砌简易猪舍、一小型鸡舍及玉米地，房屋背侧、右侧为树林和灌木丛。该村寨的生活用水为附近洋海田水井引到位置比较高的储水池后二次供入每家每户，供水区自该病例发生前后无其他类似病例。

2.7 危险因素调查

病例家室外林地、耕地常见室内鼠(黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠)、室外鼠(松鼠等)活动；猪舍及室内经常见鼠活动。

病例病前日常劳动以种地、养猪、家务为主，半年前曾到自家房屋背后的树林中伐木3天，但本人否认发病前被蚊、虫等叮咬史。

2.8 病例接触史及病例主动搜索

家中其余人员近半年来未患“发热、淋巴结肿大”等疾病；查阅马场乡卫生院2016年1月1日以来门诊日志10 876人次，未发现“发热、淋巴结肿大”病例。

2.9 自然疫源性疾病调查

自1978年至今在晴隆县境内39年间共计发现皮肤炭疽疫情21起，发病183例，其中7例死亡，总病死率为3.83%；无病例的年份分别是1984、1985、1987、1994、2000、2001、2003、2004、2006、2008—2016年共计18年无病例；晴隆县马场乡近10年也就是2005年报告2例、2007报告5例病例，两年均无死亡病例。

3 讨论

该病例经流行病学调查、病例临床表现、实验室检测及相关辅助检查，目前尚无确切诊断标准，并结合《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》及《农业灾害研究》等文献排除土拉弗朗西斯菌引起的土拉杆菌病例^[1]，在该病例膝关节液中培养出熊猴类芽孢杆菌，其病例膝关节肿胀是否是此类芽孢杆菌所致，有待进一步调查研究。

类芽孢杆菌是一类具有可作为植物病害生物防治潜力的细菌，不少菌株还具有促进植物生长的作用，熊猴类芽孢杆菌可以内生芽孢，芽孢又具有较强的抗热或耐热性能，所以一旦发展作为生防菌(指的是那些有益微生物，可以防治植物病害的各种措施)，就能够具备相对较长的货架期(指食品被贮藏在推荐的条件下，能够保持安全；确保理想的感官、理化和微生物特性；保留标签声明的任何营养值的一段时间)；当地属温凉湿润的高原亚热带季风气候区，气候温和，植被良好，较适宜熊猴类芽孢杆菌在温水、土壤等环境中需氧嗜温菌的病原学生物特性^[2]，为了掌握该类芽孢杆菌为外环境的孳生繁殖、侵入人体途径、致病机理等情况，建议当地政府和卫生行政部门组织专业人员进行相关调查及标本检测，为今后防控工作提供有效的科学依据，填补当地对这一菌种认识的空白；目前国内尚无熊猴类芽孢杆菌感染人类的相关文献记载和报道，若如难辩梭状芽孢杆菌感染人类，近20年以来在我国有逐年上升趋势，而且已经成为消化系统的常见病^[3-5]，熊猴类芽孢杆菌是否致病，该病例膝关节肿胀是否为该菌导致等问题的提出，以及当地首次从人体组织液中培养出熊猴类芽孢杆菌等成果，对当地政府和卫生行政部门既是一种机遇也是一次挑战，需要我们作进一步去调查和研究；自动分析仪的结果与最后鉴定为熊猴类芽孢杆菌存在差异，可能是鉴定方法不一致所产生的差异而致^[6-7]。

芽孢杆菌的研究历史已经发展到《伯杰氏细菌学鉴定手册》1984年的第九版和1991年Ash等研究的rRNA序列^[7]，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外线辐射所造成的伤害，维持自身能力不受影响。至于熊猴类芽孢杆菌是不具有这些生物学特征，有待进一步研究，这一生物学特性具有非常良好的应用前景^[8]；芽孢杆菌是一类嗜氧或兼性厌氧、能产生抗逆性芽孢、并能在极端条件下生存的细菌。芽孢杆菌在解决各种环境问题上具有巨大的潜能，现在很多国家已经对这项课题展开了广泛且深入的调查与研究，但如今该课题中还存在很多有待解决的问题：现已发现的芽孢杆菌虽然来源于不同的环境，但是大部分都是从普通的环境中分离获得的，相信某些环境特别是一些极端环境中还有很多未被人们发现的芽孢杆菌，其中应该不乏人类从未对其进行分类学鉴定的新菌。熊猴类芽孢杆菌适不适宜在极端条件下生存，也有待进一步调查研究。

(衷心感谢中国疾病预防控制中心王艳华、张恩民老师的大力支持和耐心的指导！同时也感谢黔西南州第二人民医院、晴隆县卫生和计划生育局、县疾病预防控制中心及所有参与人员给予的大力协助！)