纳米CuO离子化水平及其对细胞毒性影响观察
赵康峰1, 宋予晴2, 顾雯1, 董力1, 张兴3, 戴洪兴3, 白雪涛1     
1. 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所;
2. 北京协和医学院;
3. 北京工业大学环境与能源工程学院
摘要: 目的 试验测评纳米CuO在体外培养条件下离子化水平及其对细胞毒性贡献率。方法 粒径为40和200 nm的近球型CuO纳米颗粒(CuO-NPs)用于测试。以超滤离心滤过液中铜元素的含量代表CuO-NPs的离子化水平。ICP-MS方法用于铜元素含量测定。细胞毒性试验设CuO-NPs(40和200 nm粒径)组、CuSO4组、HPMC组和无处理组。在添加和不添加D-青霉胺(D-PA)情况下给A549细胞染毒,分别于染毒后6和24 h采用刃天青法测算细胞抑制率(IR)并计算离解铜离子对细胞毒性贡献率。结果 在CuO-NPs-DMEM/F12体系中,40和200 nm CuO-NPs在孵育6 h时滤过液中铜离子测定浓度分别为(3.6±0.1)和(2.8±0.2)mg/L,在孵育24 h滤过液中铜离子测定浓度分别为(3.9±0.1)和(1.8±0.1)mg/L,上述两个时间点下40 nm CuO-NPs滤过液中铜离子测定浓度均显著高于200 nm CuO-NPs(P < 0.05)。细胞毒性试验结果显示,在添加D-青霉胺情况下,40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的细胞抑制率分别是64.7%和47.2%,作用24 h的细胞抑制率分别是87.5%和70.9%。在不添加D-青霉胺情况下,40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的细胞抑制率分别是90.3%和69.4%,作用24 h的细胞抑制率分别是95.2%和86.0%。求得40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的离子化毒性贡献率分别为28.3%和32.0%,作用24 h的离子化毒性贡献率分别为8.1%和17.6%。结论 CuO-NPs在体外培养体系中发生离子化现象,离子化水平与CuO-NPs粒径和时间有关。离子化对CuO-NPs细胞毒性具有一定贡献。
关键词: 氧化铜纳米颗粒     离子化     细胞毒性     贡献    
Assessment of Copper Oxide Nanoparticles(CuO-NPs) Ionization Level in in vitro Culture System and its Contribution to Cytotoxicity
ZHAO Kangfeng1, SONG Yuqing2, GU Wen1, DONG Li1, ZHANG Xing3, DAI Hongxing3, BAI Xuetao1     
Abstract: Objectives To assess the ionization level of copper oxide nanoparticles(CuO-NPs) in in vitro culture system and its contribution to cytotoxicity. Methods Both 40 and 200 nm sized CuO-NPs with a globoid shape were synthesized to used in the study. Ionization level of CuO-NPs was represented by the content of copper element in the ultrafiltration fluid. Inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS) method was used to determine copper content. Cytotoxicity test was divided into 5 groups including 40 nm CuO-NPs group, 200 nm CuO-NPs group, CuSO4 group, HPMC group and no-treatment group. When test, A549 cells were exposed to 40 and 200 nm CuO-NPs, CuSO4 and HPMC with the dosages of[IC50(6 h)+IC50(24 h)]/2 respectively in with or without addition of D-penicillamine(D-PA) situation. At the 6th and 24th hour respectively after the initial exposure, the cell inhibition rate(IR) was determined by resazurin method, and the contribution(C) of the dissociated copper ions to cytotoxicity was calculated. Results In 40 nm and 200 nm CuONPs-DMEM/F12 suspension system, copper contents in the ultrafiltration fluid were 3.6±0.1(40 nm) and 2.8±0.2(200 nm) mg/L respectively when incubation for 6 hours, and were 3.9±0.1(40 nm) and 1.8±0.1(200 nm) mg/L respectively when incubation for 24 hours The values of 40 nm CuO-NPs were both significantly higher than 200 nm CuO-NPs'(P < 0.05) in two different hours. Cytotoxicity test result showed the IR of 40 and 200 nm CuO-NPs on A549 cells were 64.7% and 47.2%(with D-PA) and 90.3% and 69.4%(without D-PA) respectively when treated for 6 hours, were 87.5% and 70.9%(with D-PA) and 95.2% and 86.0% (without D-PA) respectively when treated for 24 hours. The cytotoxicity contribution rate of 40 and 200 nm CuO-NPs were calculated 28.3% and 32.0%(treated for 6 hours) and 28.3% and 32.0%(treatment for 24 hours) respectively. Conclusions CuO-NPs can ionize in in vitro culture system. The ionization level of CuO-NPs is related to their size and storage time. Furthermore, CuO-NPs do some contribution in cytotoxicity.
Key words: copper oxide nanoparticles (CuO-NPs)     ionization     cytotoxicity     contribution    

离子化现象在一定程度上改变了金属纳米材料生物学毒性效应特点[1-2],对认识和判断金属纳米毒性危害带来影响。纳米CuO是一类人造纳米材料,目前广泛应用于抗菌、催化、半导体工业等领域[3-5]。为了解纳米CuO毒性特点,本研究设计观察CuO纳米颗粒(CuO-NPs)在体外培养条件下的离子化水平及其对细胞毒性贡献率大小,研究结果也为后续开展研究设计及提升其安全应用水平提供参考数据。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料和仪器

A549细胞株购自协和细胞库,为本实验室留存。DMEM/F12培养液(Grand Island, NY, USA),胎牛血清(FCS)(Grand Island, NY, USA)。刃天青(Alfa Aesar)。羟丙基甲基纤维素(HPMC)(Sigma-Aldrich)。D-青霉胺(TCI)。CuSO4(国药集团)。3kDa超滤离心管(Sartorius Stedim Biotech)。GS-15R台式离心机(Beckman)。细胞培养箱(Thermo),倒置显微镜(Olympus),DP21显微成像系统(Olympus, Japan)。Varioskan Flash全波长多功能读数仪(Thermo, USA)。电感耦合等离子体质谱ICP-MS(Agilent 7 500 a, USA)。

1.2 方法

1.2.1 纳米材料合成及表征

研究用CuO-NPs由北京工业大学环境与能源工程学院实验室参考Pandey的方法[6]制备提供,即以蒸馏水配制0.5 mol/L的Cu(NO3)2溶液,在充分搅拌条件下缓慢向其中滴加络合剂氨水(NH3 ·H2O),使之逐步生成铜氨络合物([Cu(NH3)4]2+)。继续在搅拌条件下,按照与硝酸铜摩尔比为1 :3加入沉淀剂NaOH进行反应,待反应完全后抽滤,沉淀依此经蒸馏水,无水乙醇洗涤后,置450℃高温焙烧3 h后得到CuO-NPs粉体。采用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)对制备的CuO-NPs进行表征。

1.2.2 细胞半数抑制浓度(IC50)测定

将细胞按照1×105 cells/mL密度接种于96孔培养板中。于接种后3 h向板孔中加入不同浓度的CuO-NPs(CuO-NPs以1.0% HPMC分散,配制成质量浓度均为500 mg/L CuONPs-HPMC混悬分散液,以含10% FCS的DMEM/F12培养液稀释此混悬液制备不同浓度CuO-NPs染毒液)、CuSO4和1.0% HPMC,置培养箱(37℃,5% CO2)分别作用6和24 h后,向孔板中添加终浓度为5 μmol/L[7]的刃天青液,继续在培养箱中孵育4 h,以激发波长530 nm,发射波长590 nm条件下测定各板孔的荧光强度(FI)。以测得FI值反映细胞活性。按照公式IR(%)=[(FI对照组-FI试验组)/(FI对照组-FI本底)]×100%,求得各浓度组的细胞抑制率。以改良寇氏法计算IC50。

1.2.3 CuONPs-DMEM/F12液中CuO-NPs离子化程度测定

分别配制浓度为[IC 50(6 h)+IC 50(24 h)]/2的40和200 nm两种粒径CuO-NPs(先以1.0% HPMC分散CuO-NPs,经充分搅拌配制成质量浓度为500 mg/L的CuO-NPs混悬液,再以含10% FCS的DMEM/F12培养液稀释上述混悬液而成)、CuSO4和1.0% HPMC测试用液。将上述测试用液转移至细胞培养箱(37℃,5% CO2)中,分别于6和24 h时间点吸取部分上述混悬液,移至3 kDa超滤离心管中,以1 500 g离心30 min超滤离心[8]后,以ICP-MS测定滤过液中铜元素(离子铜)含量。试验同时设DMEM/F12(10% FCS)培养液组作为对照。

1.2.4 CuO-NPs离子化细胞毒性贡献评估试验

配制和1.2.3质量浓度相同的40和200 nm两种粒径CuO-NPs(配制方法同上)、CuSO4和1.0% HPMC细胞染毒液,在加入D-青霉胺(100 μM)[9]和不加入D-青霉胺情况下给A549细胞染毒。分别于染毒6和24 h以刃天青法测定板孔中细胞活性,求得各浓度组的细胞抑制率。铜离子对细胞毒性贡献率以式C(%)=[(IR不添加-IR添加)/IR不添加] ×100%计算。试验以DMEM/F12(10% FCS)培养液组作为无处理对照。

1.2.5 数据处理

数据采用SAS9.4统计软件进行处理。细胞半数抑制浓度(IC50)以IC50 (95% CI)表示,测定的铜元素含量以X±SD表示。均数比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 CuO-NPs材料

肉眼见制备的CuO颗粒材料呈深色粉末状,透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)图像如图 1,可见CuO颗粒外形呈近球形,表面圆滑,可见到颗粒团簇团聚。

图 1 制备的CuO颗粒透射电镜(TEM)图像(左,标尺80 nm)和CuO颗粒扫描电镜(SEM)图像(右,标尺200 nm)

2.2 细胞半数抑制浓度(IC50)

CuO-NPs、CuSO4和HPMC对A549细胞作用6和24 h的IC50见表 1

表 1 作用6和24 h情况下CuO-NPs、CuSO4和HPMC对A549细胞IC50(IC50 (95% CI), mg/L)
测试物 IC50 (95% CI)
6 h 24 h
40 mg CuO-NPs 38.5(25.4, 51.6) 27.1(18.6, 35.6)
200 mg CuO-NPs 83.3(56.1, 110.5) 88.1(53.6, 122.6)
CuSO4 112.3(84.6, 140.0) 97.5(39.2, 135.8)
HPMC >2 500* >2 500*
注:“*”试验最高染毒剂量设为2 500 mg/L情况下未见明显细胞活性降低。

2.3 CuONPs-DMEM/F12液中CuO-NPs离子化程度

用含10% FCS的DMEM/F12培养液配制[IC50(6 h)+IC50(24 h)]/2浓度,即分别为32.8、85.7、104.9和2 500 mg/L的40 nm CuO-NPs混悬液、200 nm CuO-NPs混悬液、CuSO4和HPMC测试用液。经孵育后上述测试用液超滤滤过液中铜(离子)元素含量见表 2。其中40 nm CuO-NPs组6和24 h滤过液中铜离子含量分别为(3.6±0.1)和(3.9±0.1) mg/L,6和24 h之间数值比较无显著性差异。200 nm CuO-NPs组6和24 h滤过液中铜离子含量分别为(2.8±0.2)和(1.8±0.1) mg/L,24 h测定值较6 h测定值有所降低,数值之间比较具有显著性差异(P<0.05)。HPMC组和DMEM/F12组6和24 h滤过液中铜离子含量均低于检出限0.01 mg/L。

表 2 孵育6和24 h时滤过液中铜(离子)元素含量(mg/L,X±SE,n=6)
组别 配制浓度/
(mg/L)
孵育时间
6 h 24 h
40 mg CuO-NPs 32.8 3.6±0.1Δ 3.9±0.1Δ
200 mg CuO-NPs 85.7 2.8±0.2 1.8±0.1*
CuSO4(Cu2+) 104.9(41.8) 22.8±0.3 27.2±0.8*
1.0 HPMC 2 500 <0.01a <0.01 a
DMEM/F12(10% FCS) 原液 <0.01 a <0.01 a
注:“*”和作用6 h测定值比较P<0.05;“Δ”和200 mg CuO-NPs组测定值比较P<0.05;“a”检出限为0.01 mg/L

2.4 CuONPs离子化细胞毒性贡献评估

求得40和200 nm CuO-NPs、CuSO4和HPMC在添加100 μMD-青霉胺和不添加D-青霉胺情况下对A549细胞抑制率结果(表 3)。

表 3 CuO-NPs、CuSO4和HPMC对A549分别作用6和24 h情况下的细胞抑制率IR
%
组别 6 h 24 h
+D-PA -D-PA +D-PA -D-PA
40 mg CuO-NPs 64.7 90.3 87.5 95.2
200 mg CuO-NPs 47.2 69.4 70.9 86.0
CuSO4 3.7 43.7 1.5 65.1
1.0% HPMC 3.5 2.9 2.8 4.2
DMEM/F12(10% FCS) 0.4 0.3 1.1 0.6

根据式C(%)=[(IR不添加-IR添加)/IR不添加] ×100%计算得到40和200 nm CuO-NPs在作用6 h的离子化毒性贡献率分别为28.3%和32.0%,作用24 h的离子化毒性贡献率分别为8.1%和17.6%。

3 讨论

金属纳米材料发生离解后释放出金属离子,原有体系组成和毒性作用特点发生改变,从而对判定金属纳米材料毒性带来影响。本研究就CuO-NPs在体外培养条件下离子化水平及其对细胞毒性贡献率大小进行测评。研究选择以粒径为40和200 nm的近球型CuO-NPs作为试验材料,在测定其在DMEM/F12完全培养液中模拟培养条件下离子化水平的基础上,通过对人类肺泡基底上皮细胞A549细胞毒性试验评估CuO-NPs离子化对毒性贡献大小。

研究中采用超滤离心方法以使CuO-NPs和其离解铜离子发生分离,以超滤滤过液中铜元素的含量代表CuO-NPs离子化的水平[8]。为保证细胞毒性试验中出现明显可观察效应,在对CuO-NPs离子化细胞毒性贡献评估中选用[IC50(6 h)+IC50(24 h)]/2作为染毒浓度。为实现对CuO-NPs有效分散并染毒,选用HPMC[10]作为分散剂用于配制CuO-NPs分散悬液。HPMC是一种非离子型纤维素醚,具有显著增稠能力。为便于观察,本研究中以离子铜和CuO-NPs对A549细胞影响作用相互独立为假设前提,即CuO-NPs染毒液总毒性等于离子铜毒性和CuO-NPs毒性之和。研究试验中采用向染毒体系中添加铜离子螯合剂D-青霉胺以获得去除铜离子干扰下的CuO-NPs细胞毒性。

研究中发现,在CuONPs-DMEM/F12体系中,在孵育6和24 h条件下,CuO-NPs发生离子化现象,其中40和200 nm CuO-NPs在孵育6 h滤过液中铜离子测定浓度分别为(3.6±0.1)和(2.8±0.2) mg/L,在孵育24 h滤过液中铜离子测定浓度分别为(3.9±0.1)和(1.8±0.1) mg/L,上述两个时间点下40 nm CuO-NPs滤过液中铜离子测定浓度均显著高于200 nm CuO-NPs(P<0.05),200 nm CuO-NPs组24 h测定值较6 h测定值有所降低,数值之间比较具有显著性差异(P<0.05)。上述结果表明CuO-NPs离子化水平与其粒径和时间有关。研究中还发现离子化对CuO-NPs细胞毒性具有一定贡献,其中40和200 nm CuO-NPs对A549细胞作用6 h的离子化毒性贡献率分别为28.3%和32.0%,作用24 h的离子化毒性贡献率分别为8.1%和17.6%。以上结果表明,在对纳米CuO毒性研究中,为消除因离子化对结果带来的影响和客观揭示纳米CuO毒性特点,宜考虑对纳米CuO粒径等离子化影响相关因素进行必要的条件控制选择。研究中还发现,CuSO4对照组超滤离心滤过液中铜元素含量(6 h和24 h分别为(22.8±0.3)和(27.2±0.8) mg/L)测定值较配制浓度(41.8 mg/L)有所降低,联系前述出现200 nm CuO-NPs组24 h滤过液中铜离子测定值较6 h测定值明显降低现象,分析其原因可能存在超滤离心管管壁以及超滤滤膜对溶液中铜离子具有一定的吸附作用导致。由此推断,实际当中40和200 nm CuO-NPs离子化水平,可能高于本试验中测试数值。

本研究实施以A549细胞对CuO-NPs离子化无影响,离子铜和CuO-NPs对A549细胞影响作用相互独立,且两者的协同作用表现为各自独立作用的叠加为假设前提,并且研究中不涉及区分由CuO-NPs离解而成的铜离子价态(Cu2+和Cu)之分,也未分析溶液pH变化给结果带来的影响等。研究结果可揭示纳米CuO一方面的毒性特点,相关研究仍需要继续深入进行。

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DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2018.03.001
中国疾病预防控制中心主办。
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赵康峰, 宋予晴, 顾雯, 董力, 张兴, 戴洪兴, 白雪涛
ZHAO Kangfeng, SONG Yuqing, GU Wen, DONG Li, ZHANG Xing, DAI Hongxing, BAI Xuetao
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