2. 山东大学公共卫生学院
1-溴丙烷(1-bromopropane, 1-BP)是含溴化合物生产的化工原料，被美国EPA建议作为臭氧层消耗物质(ozone depleting substance, ODS)和可疑致癌性干洗剂的替代剂，用于药品、农药、香精、汽油添加剂和阻燃剂的生产，也被用作石蜡、脂肪、树脂以及脱垢剂的溶剂，全球1-BP消耗量和生产量增长迅速。我国是1-BP主要生产国和出口国，国内应用也逐年增加，接触人群呈快速上升趋势。临床神经中毒病例和研究显示1-BP具有明确的神经毒性[1-5]。2013年溴丙烷中毒被列入我国新版《职业病分类和目录》。调查显示我国1-BP接触工人作业情况不容乐观，有些工作岗位监测点浓度达到报道的平均中毒浓度，有研究报道低剂量接触1-BP仍可观察到神经系统损害。因此，研究1-BP的毒性机制，探索1-BP神经毒性效应标志物，可以为接触人群保护措施的制定和完善提供可靠数据，同时也将丰富毒理学内容，具有重大公共卫生意义。
现已证实1-BP代谢过程中可产生多种活性产物[6-7]，其中，1-BP的C2经氧化生成1-溴-2-丙醇，继续氧化形成溴丙酮[8]，此途径被认为是1-BP最主要和具有毒理学意义的代谢途径。本文研究了动态顶空-气相色谱-串联质谱联用法定性定量检测尿液中1-溴-2-丙醇和溴丙酮的方法。
1 材料与方法 1.1 试剂与材料超纯水(符合GB/T 6682-2008一级水的要求)；甲醇(德国MERCK公司，色谱纯)；标准品：溴丙酮(纯度>98%，山东西亚，批号T2189)；1-溴-2-丙醇(纯度>99.5%, 美国Sigma-Aldrich, Lot#MKBL6 974 V)；实验动物(Wistar雄性成年大鼠，经口染毒，剂量为(200~800) mg/kg ·bw)；高纯氦气(≥99.999%)；低流失石英毛细管质谱柱(DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm)。
1.2 仪器及测定条件 1.2.1 仪器动态顶空浓缩进样装置(HST40，美国PerkinElmer公司); 气相色谱—串联质谱联用仪(Trace1300-TSQ8000Evo，带EI离子源，美国Thermo Fisher公司)。
1.2.2 仪器条件气相色谱条件柱温：起始柱温40℃，保持1.0 min；以10℃/min升温至120℃，保持3.0 min；气化室温度270℃，分流进样，分流比：10 :1；载气(He)，流速：1.0 mL/min。质谱分析条件：传输线温度280℃，EI电离源，离子源温度230℃，离子化能量：70 eV，用全扫描模式(扫描范围(35~300) amu)进行定性检测，定量检测采用选择离子扫描(SIM)模式。动态顶空浓缩进样条件：炉温70℃，针温120℃，传输线温度150℃，捕集阱低温40℃，捕集阱高温280℃，顶空气捕集循环次数为4次。
1.3 标准制备与样品测定 1.3.1 标准溶液的制备准确称取溴丙酮、1-溴-2-丙醇标准品0.1 000 g于100 mL容量瓶中，用甲醇定容并摇匀，得到浓度为1.0 mg/mL的混合标准储备液。取1.0 mL混合标准储备液于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到浓度为10.0 μg/mL的混合标准中间液，再取10.0 μg/mL的混合标准中间液0.10 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到浓度为10.0 ng/mL的混合标准应用液。分别取混合标准应用液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL于20 mL顶空瓶中，加超纯水至10 mL，配制得到含量分别为1.00，2.00，5.00，10.0，20.0，50.0，100 ng的标准系列。
1.3.2 样品分析步骤取1 mL实验动物尿液样品于20 mL顶空瓶中，超纯水稀释至10 mL。置于顶空装置自动进样器中顶空富集，浓缩、富集、解吸后的气体1 mL进入气相色谱分离后，在质谱完成定性分析和外标法定量分析。
1.4 计算待测组分含量(ng)和对应的定量离子峰面积分别绘制标准曲线，将样品中待测组分定量离子的峰面积响应值代入外标标准曲线中，计算得到样品中对应组分的含量(ng)，再根据取尿液体积(mL)计算得到样品中待测组分的浓度(ng/mL)。
1.5 质量控制 1.5.1 空白实验取未接触1-BP的Wistar雄性成年大鼠尿液作为空白样品，空白试验与样品测定同时进行，每批实验均须进行样品空白检测，空白实验结果均须低于方法的检出限。
1.5.2 标准质控样品取未接触1-BP的Wistar雄性成年大鼠尿液，准确加入溴丙酮、1-溴-2-丙醇混合标准储备液，制备得10.0 ng/mL的质控样品，质控样品与测试样品同时进行测定，每批实验均须进行质控样品检测，质控样品检测结果与配置浓度偏差须小于10%。
1.5.3 精密度取未接触1-BP的Wistar雄性成年大鼠空白尿液，分别加入低、中、高浓度的标准溶液制备加标尿样各10 mL，各取1.0 mL样品于顶空瓶中，加超纯水至10 mL，按照样品分析步骤分别测定10次，计算结果间相对偏差。
1.5.4 准确度采用标准加入法，计算加标回收率。取无溴丙烷暴露的Wistar雄性成年大鼠尿液作为空白样品，准确加入一定量的低、中、高浓度的溴丙酮和1-溴-2-丙醇的标准溶液制备加标尿样。取加标后尿样1 mL于顶空瓶中，加超纯水至10 mL，置于顶空进样器中进行定量检测，计算回收率。
1.5.5 方法检出限和定量限取无溴丙烷暴露的Wistar雄性成年大鼠的空白尿液，按照样品分析步骤进行检测，以保留时间附近的色谱信号为噪声，以三倍噪声的信号强度计算方法检出限，以十倍噪声的信号强度计算方法定量下限。
2 结果 2.1 定性用1.2的色谱—质谱分析条件，全扫描模式下，溴丙酮保留时间是2.796 min(图 1)，1-溴-2丙醇的保留时间是2.904(图 2)。溴丙酮碎片离子m/z是137、94、43(定量离子)(图 3)，1-溴-2丙醇碎片离子m/z是125、45(定量离子)(图 4)。
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| 图 1 1-溴丙酮总离子流图(TIC) |
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| 图 2 1-溴-2丙醇总离子流图(TIC) |
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| 图 3 溴丙酮质谱图 |
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| 图 4 1-溴-2-丙醇质谱图 |
2.2 精密度试验
取Wistar雄性成年大鼠空白尿样，加入标准溶液制备浓度为2.00、8.00和25.0 ng/mL加标尿样各10 mL，各取1.0 mL样品于顶空瓶中，加超纯水至10 mL，置于顶空进样器中进行定量检测，相对标准偏差为1.34%~4.79%(表 1)。
| 测定 次数 |
测得值/ng | |||||||
| 加标尿样1 | 加标尿样2 | 加标尿样3 | ||||||
| 溴丙酮 | 1-溴-2-丙醇 | 溴丙酮 | 1-溴-2-丙醇 | 溴丙酮 | 1-溴-2-丙醇 | |||
| 1 | 1.93 | 1.85 | 8.07 | 7.83 | 25.04 | 24.96 | ||
| 2 | 1.84 | 2.06 | 8.09 | 7.94 | 25.36 | 25.63 | ||
| 3 | 1.88 | 1.90 | 7.98 | 7.82 | 24.84 | 24.38 | ||
| 4 | 1.95 | 2.08 | 7.90 | 8.21 | 25.10 | 25.75 | ||
| 5 | 1.93 | 1.86 | 8.00 | 8.04 | 25.12 | 25.76 | ||
| 6 | 1.90 | 2.02 | 8.10 | 8.10 | 23.83 | 24.31 | ||
| 7 | 1.96 | 2.07 | 7.84 | 8.02 | 24.00 | 24.87 | ||
| 8 | 2.05 | 1.94 | 7.82 | 7.88 | 25.17 | 24.25 | ||
| 9 | 2.05 | 2.08 | 7.87 | 8.22 | 25.64 | 25.75 | ||
| 10 | 1.86 | 2.07 | 7.90 | 8.13 | 25.36 | 24.95 | ||
| X | 1.93 | 1.99 | 7.96 | 8.02 | 24.95 | 25.06 | ||
| S | 0.072 | 0.095 | 0.107 | 0.148 | 0.586 | 0.624 | ||
| CV/% | 3.74 | 4.79 | 1.34 | 1.85 | 2.35 | 2.49 | ||
2.3 准确度试验
采用标准加入法，计算加标回收率。取无溴丙烷暴露、溴丙酮和1-溴-2-丙醇的浓度均低于方法检出限的Wistar雄性成年大鼠尿液，作为空白样品，准确加入一定量的溴丙酮和1-溴-2-丙醇的标准溶液制备加标尿样。取加标后尿样1 mL于顶空瓶中，加超纯水至10 mL，置于顶空进样器中进行定量检测，计算回收率。溴丙酮回收率在93.4%~109.6%之间、1-溴-2丙醇回收率在91.8%~105.9%之间(表 2)。
| 成分名称 | 加入值/ng | 测得值/ng | 回收率/% | ||||||||
| 低浓度 | 中浓度 | 高浓度 | 低浓度 | 中浓度 | 高浓度 | 低浓度 | 中浓度 | 高浓度 | |||
| 溴丙酮 | 2.00 | 10.00 | 50.00 | 2.19 | 10.26 | 46.71 | 109.6 | 102.6 | 93.4 | ||
| 1-溴-2-丙醇 | 2.00 | 10.00 | 50.00 | 2.12 | 10.07 | 45.90 | 105.9 | 100.7 | 91.8 | ||
2.4 线性范围与检出限
溴丙酮和1-溴-2-丙醇的标准系列各浓度点分别是1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL，以浓度对应化合物定量离子对峰面积的比值绘制标准曲线，呈良好的线性关系。回归方程及相关系数分别是溴丙酮：y=2.539x+0.340, r=0.999 3，1-溴-2-丙醇：y=2.045x+0.423, r=0.999 1。
以三倍信噪比计算检出限，以十倍信噪比计算方法定量下限，本方法溴丙酮和1-溴-2-丙醇的检出限是0.1 ng/mL，定量下限是0.3 ng/mL。
2.5 方法应用用本研究建立的方法对10只1-溴丙烷染毒的大鼠尿液进行了检测，所有样品均检出溴丙酮和1-溴-2-丙醇，检出率为100%，浓度范围是(8.40~32.1) ng/mL。
3 讨论本研究建立了一种尿液中1-溴丙烷代谢产物溴丙酮和1-溴2-丙醇的检测方法，方法灵敏度高，准确度和稳定性好，样品前处理简单，具有较好的推广价值。
1-溴丙烷代谢产物中N-乙酰-S-丙基-L-半胱氨酸(AcPrCys)检测方法研究较多，多为液相色谱—串联质谱联用法[9-10]，而溴丙酮和1-溴2-丙醇的检测方法研究较少，未见文献报道，本研究建立的方法结合了动态顶空的浓缩作用和气相色谱—串联质谱联用法的高灵敏度、高选择性的特点，填补了溴丙酮和1-溴-2-丙醇的检测方法空白。
动态顶空法对于易挥发性有机物的检测有较大优势，其浓缩吸附肼配置可以弥补静态顶空灵敏度不够的缺点。同时，样品处理过程中只对顶空气体进行浓缩吸附，固体或液体样品不进入设备管路，可以有效避免设备污染和记忆效应，可以到达吹扫捕集法的灵敏度，又避免了吹扫捕集过程中的样品交叉污染和设备管路堵塞。
尿中1-溴丙烷代谢产物有1-BP、AcPrCys、总溴离子、溴丙酮、1-溴-2-丙醇等，但膳食成分对溴离子及其他含溴化合物的影响[11]、1-BP高挥发性致稳定性问题使1-BP和溴离子作为暴露评估标志物有一定的局限性，AcPrCys是1-BP与谷胱甘肽(GSH)直接结合产物，尿中含量随工作场所空气中1-BP浓度升高而增加[12-15]，在一定程度上反映的是1-BP解毒过程。目前缺乏反映1-BP神经毒性的效应标志物，本研究建立的1-BP活性产物溴丙酮、1-溴-2-丙醇的检测方法对于探索1-BP神经毒性的效应标志物，评价1-BP的危险度和保护措施的制定和完善有积极的意义。
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