随着以二氧化钛为代表的光催化材料的研究逐步深入,其应用也越来越广泛,已经成为新型的、具有开发前途的绿色环保型材料[1-3]。根据菌类的特性和测试方法不同,现在应用于民生的抗菌技术分为抗真菌和抗细菌两类,其中抗真菌技术的应用既可以防止疾病传播,也可防止产品受到真菌污染而变质,具有重大的实用价值[4-6]。然而,我国目前并没有标准化的光催化材料及制品的抗真菌性能检测的方法。因此,建立一个符合我国国情,简易、可操作、可重复的检测方法,不但可以提升光催化材料及制品的技术含量,还有助于推动光催化材料及其产业的健康发展。
关键光照条件是光催化抗菌测试的关键要素,因此,确定合适的光照条件对建立稳定、可标准化的光催化材料抗真菌性能检测方法至关重要。本文以紫外光相应的光催化材料为研究对象,参照《光催化抗菌材料及制品抗菌性能的评价》(GB/T 23763-2009)[5]规定,选取365 nm荧光作为光源,黑曲霉和白色念珠菌作为实验菌种,测试了不同光照强度和光照时间对光催化材料抗真菌性能检测的影响,并测试了方法的稳定性。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验菌种黑曲霉CGMCC 3.5487(批号:2009-02-25),白色念珠菌ATCC 10231(批号:2010-12-02)。上述菌种购自广东省微生物菌种保藏中心,本实验室保存。
1.1.2 培养基及试剂PDA,SDA,去离子水及洗脱稀释液(质量分数为0.005%吐温-80和0.9%氯化钠的溶液),培养基及试剂均购自广东环凯生物科技有限公司,去离子水为实验室自制三级水。
1.1.3 其它材料50 mm×50 mm石英玻璃板;塑料贴膜(聚乙烯膜);光催化材料(市场购买)。
1.1.4 仪器设备荧光灯(365 nm),紫外照度计(配有长波紫外段(UVA,320 nm~400 nm)传感器,测定范围0~100 mW/cm2);微生物培养计数设备,其它微生物实验材料。
1.2 试验方法 1.2.1光催化材料抗真菌性能检测的基本流程参照《光催化抗菌材料及制品抗菌性能的评价》(GB/T 23763-2009)[5]制定一个光催化材料及制品抗真菌性能检测的流程,其测试检测步骤如下:
1.2.1.1 样品和空白对照样片制备将实验中用的光催化样品和相应的空白对照样片制备成50 mm±2 mm方块(厚度 < 10 mm),其中实验样片6片(3片用于光照测试,3片用于暗条件测试)。空白样片9片(3片用于0时间洗脱,3片用于光照测试,3片用于暗条件测试),试验中的空白样片采用石英玻璃,塑料片或者相同材质不具备抗菌功能的材料样片。试验前应采用合适的方法对样品进行清洁消毒,以消除微生物污染对最终结果的影响。
1.2.1.2 制备接种用孢子悬液用吸管或接种环轻轻的刮取产孢良好的黑曲霉或新鲜的白色念珠菌培养物,通过消毒棉或双层纱布过滤,然后将滤液用吸管或涡旋混合器混匀得到孢子悬液,稀释至(105~106)cfu/mL作为接种液。
1.2.1.3 样片接种接种将空白对照样片和光催化样片分别放入无菌培养皿中,测试面朝上。用移液管吸取0.2 mL的菌悬液,滴加到每个试样的表面,然后用薄膜(40 mm×40 mm)覆盖。调节薄膜使菌液在样片和薄膜之间分散均匀。注意不要将菌液溢出。
1.2.1.4 培养皿中样片的放置培养皿中平铺保湿纸,加入10 mL无菌水浸泡滤纸,然后将玻璃管或玻璃棒置于滤纸上面。将已接种的样片和薄膜小心放在玻璃管或玻璃棒上,用玻璃板盖住培养皿光照培养。
1.2.1.5 光照培养打开光源,稳定30 min,然后调节灯管位置或功率调节光照强度。将需要光照的接种样片(3片光催化样片,3片空白对照样片)置于灯下进行光照,控制温度在25℃±2℃,相对湿度不低于85%。同时将3个光催化样片、3个空白对照样片置于暗条件下,暗条件的培养温度控制在25℃±2℃,相对湿度不低于85%,持续培养时间等同光照条件。
1.2.1.6 样片的活菌洗脱计数接种后立即用无菌镊子分别将3个“0”接触时间的空白对照样片置于均质袋内,将10 mL稀释液倒入袋中,用手捏均质袋进行洗脱,充分洗脱后,对洗脱液进行10倍梯度稀释和活菌培养计数;光照条件和暗条件培养后,样片按上述步骤洗脱试样上的真菌并进行活菌培养计数。
1.2.1.7 材料的总抗真菌率的计算按公式(1)计算材料的总抗真菌率R总。
$ {{\rm{R}}_{\rm{总}}} = [({{\rm{B}}_{\rm{L}}}-{{\rm{C}}_{\rm{L}}})/{\rm{ }}{{\rm{B}}_{\rm{L}}}] \times 100\% $ | (1) |
其中: R总—光照条件下的总抗真菌率;
BL—光照后空白对照样片上活菌数的平均值,cfu/片;
CL—光照后光催化材料样片上活菌数的平均值,cfu/片。
1.2.1.8 材料的光催化抗真菌率的计算按公式(2)计算材料的光催化抗真菌率R光。
$ {{\rm{R}}_光} = [({{\rm{C}}_{\rm{D}}}-{{\rm{C}}_{\rm{L}}})/{\rm{ }}{{\rm{C}}_{\rm{D}}}] \times 100\% $ | (2) |
其中: R光—光催化抗真菌率;
CD—暗条件下光催化材料样片上活菌数的平均值,cfu/片;
CL—光照后光催化材料样片上活菌数的平均值,cfu/片。
1.2.2 不同光照强度对实验菌种生长情况的影响结合真菌的生物特性及不同光催化材料制品抗菌性能的研究报导[5, 7-8],分别测试在1.2,0.8及0.4 mW/cm2三种光照强度下,照射24 h后真菌的存活生长情况。试验时,将制备好的菌悬液同时接种到3片相同的空白试验载体上(黑曲霉为石英玻璃,白色念珠菌采用塑料薄膜片),分别在接种后、光照24 h、暗条件24 h条件下分离回收菌落,比较不同光照强度照射后真菌的生长情况。每个光照强度分别进行5次试验作为实验平行。
1.2.3 不同光照时间对光催化材料抗真菌性能的影响按照光催化材料抗菌性能测试的步骤,分别光照24,38及48 h后,计算材料的抗真菌率,比较得到最合适的光照时间。
1.2.4 测试方法的可重复性不同的检验人员按照上述试验流程及实验条件,独立测试了四种样品对白色念珠菌的抗菌率,检测完成后,计算人员之间数据的变异程度,从而判断方法的可重复性。
2 结果与讨论 2.1 光照强度对实验菌种生长情况的影响结果显示,经1.2 mW/cm2光照强度照射24 h后,黑曲霉(CGMCC 3.5487)的菌落数量呈现下降趋势,菌落总数(以对数计)由最初的5.55 Log10下降到了5.30 Log10,而在0.8及0.4 mW/cm2光照强度下,黑曲霉的菌落数量没有明显减少或者有少量增加,分别由4.91 Log10增加到了4.92 Log10(0.8 mW/cm2)和由4.55 Log10增加到4.85 Log10(0.4 mW/cm2)。白色念珠菌(ATCC 10231)的实验也呈现出相似的变化趋势。经过1.2 mW/cm2强度照射24 h后,菌落的数量由初始的5.10 Log10下降到了0.36 Log10,其自然死亡率超过99%,而在0.8和0.4 mW/cm2时,菌落数量没有明显的变化(分别为-0.04 Log10和0.02 Log10)(表 1)。这一实验结果与ISO 13125 :2013《精细陶瓷(高级陶瓷,先进技术陶瓷)半导体光催化材料测试抗真菌活性的方法》[7]中推荐使用的光照强度是一致的。因此,在进行光催化材料及制品的抗真菌性能检测中,采用(0.4~0.8) mW/cm2的光照强度进行测试,是比较合理的。
实验条件 | 0时菌落数(Log10) | 24 h时光照后菌落数(Log10) | 24 h暗条件菌落数(Log10) |
黑曲霉,1.2 mw/cm2,光照24 h | 5.55±0.43 | 5.30±0.47 | 5.88±0.08 |
黑曲霉,0.8 mw/cm2,光照24 h | 4.91±0.27 | 4.92±0.28 | 4.89±0.24 |
黑曲霉,0.4 mw/cm2,光照24 h | 4.55±0.07 | 4.85±0.28 | 4.65±0.24 |
白色念珠菌,1.2 mw/cm2,光照24 h | 5.10±0.15 | 0.36±0.49 | 5.14±0.16 |
白色念珠菌,0.8 mw/cm2,光照24 h | 4.90±0.31 | 4.86±0.34 | 4.96±0.63 |
白色念珠菌,0.4 mw/cm2,光照24 h | 5.24±0.30 | 5.26±0.33 | 5.14±0.18 |
2.2 光照时间对光催化材料抗真菌性能的影响
试验中选用的10组样品的结果见表 2和表 3。结果显示,光照24 h时,样品的抗真菌性能普遍较低,光催化材料的抗真菌活性可能还没有充分发挥作用,光照48 h测试结果显示样品都具有抗菌效果,但样品间的结果区分度差,而光照38 h时,光照在样品抗菌中的区分作用已经得到较好的发挥,测试结果的区分度最好,最适合做光催化材料的抗菌性能的效果评价。因此,如果是对多种材料的光催化效果进行统一评价时,推荐采用38 h。
样品名称 | 性状 | 总抗真菌率/% | ||
24 h | 38 h | 48 h | ||
陶瓷片 | 固体片状 | 23.6 | 46.9 | 99.9 |
光触媒抗菌陶瓷 | 固体片状 | 90.6 | 99.3 | 99.9 |
光触媒液体 | 液体 | 4.76 | 91.6 | 96.7 |
瓷砖 | 固体片状 | 41.8 | 60.3 | 99.2 |
负离子释放剂 | 液体 | 87.4 | 96.0 | 99.8 |
过滤网1 | 固体片状 | 37.1 | 52.9 | 87.8 |
过滤网2 | 固体片状 | 23.7 | 76.8 | 99.3 |
复合板材 | 固体片状 | 56.8 | 89.5 | 98.9 |
光触媒液 | 液体 | 67.4 | 94.8 | 99.7 |
涂料 | 液体 | 89.3 | 95.7 | 99.9 |
样品名称 | 性状 | 总抗真菌率/% | ||
24 h | 38 h | 48 h | ||
陶瓷片 | 固体片状 | 92.5 | 96.9 | 99.9 |
光触媒抗菌陶瓷 | 固体片状 | 93.2 | 99.6 | 99.9 |
光触媒液体 | 液体 | 94.4 | 98.9 | 99.9 |
瓷砖 | 固体片状 | 48.2 | 78.6 | 96.9 |
负离子释放剂 | 液体 | 90.4 | 97.8 | 99.9 |
过滤网1 | 固体片状 | 55.9 | 76.8 | 95.7 |
过滤网2 | 固体片状 | 88.1 | 96.5 | 99.9 |
复合板材 | 固体片状 | 72.3 | 90.7 | 99.5 |
光触媒液 | 液体 | 45.1 | 95.9 | 99.9 |
涂料 | 液体 | 98.4 | 98.9 | 99.9 |
2.3 方法的可重复性测试
不同的检测人员依据相同的实验方法进行了0.8 mW/cm2强度下,光照38 h时的抗真菌性能检测(表 4)。结果表明,4位检测人员对同一样品测试结果的变异系数分别为1.45%,0.13%,1.22%及2.57%,其变异程度在微生物的误差范围内(一般认为是15%内),表明方法可重复性较好。
样品 | 总抗真菌率/%(白色念珠菌ATCC 10231) | |||||
人员 A |
人员 B |
人员 C |
人员 D |
均值±标准差 | 变异 系数 |
|
陶瓷片 | 96.9 | 94.6 | 95.7 | 97.8 | 96.25±1.40 | 1.45 |
光触媒抗菌陶瓷 | 99.6 | 99.8 | 99.9 | 99.7 | 99.75±0.13 | 0.13 |
光触媒液体 | 98.9 | 96.1 | 97.6 | 98.2 | 97.70±1.19 | 1.22 |
瓷砖 | 78.6 | 76.3 | 79.7 | 75.4 | 77.50±1.99 | 2.57 |
3 结论与展望
真菌具有细胞壁和细胞核,其细胞结构比细菌更加复杂,耐受光辐射能力比细菌更强,因此,光催化作用对真菌的抑制或杀灭作用所需的时间也比细菌更长。建立光催化材料抗真菌性能的测试方法时,应特别考虑真菌的特殊性。本研究在选取紫外光源时,充分考虑了国内外标准的采用和研究情况,认为365 nm既可以激发光催化材料的催化抗菌活性,本身没有杀菌性能,同时已经被《光催化抗菌材料及制品抗菌性能的评价》(GB/T 23763-2009)[5]用作光催化激发光源使用,故而认为365 nm的荧光可以作为合适的光源。鉴于真菌的抗性更强,本研究综合参考了《精细陶瓷(高级陶瓷,先进技术陶瓷)半导体光催化材料测试抗真菌活性的方法》(ISO 13125 :2013)[9](光照时间为(8~24) h,光照强度(0.4~0.8 mW/cm2)、《纺织品抗真菌性能检测方法-平板法》(ISO 13629-2 :2014)[10](抗真菌处理时间为48 h),《鞋类和鞋类部件抗菌性能技术条件》(QB/T 2881-2013)[11](对白色念珠菌的抗菌处理时间采用48 h),确定了实验的光照强度和光照时间。结果表明,0.8 mW/cm2的光照强度对真菌的生长活性影响不大,而38 h的光照时间对光催化材料抗真菌的性能区分度最好。根据确定的这两个实验条件,采用0.8 mW/cm2,38 h照射时,人员比对结果显示该方法流程检测结果稳定可重复,是一种简便可行的实验方法。该方法首次采用了贴膜法定量测试光催化材料的抗真菌性能,可有效填补我国在光催化材料抗真菌检测方面方法缺乏的问题,为光催化材料及产品抗真菌性能的标准化提供数据支持,也可为广大光催化材料的生产企业提供可靠的测试方法,有助于提高产业的技术水平。
本研究重点考察了光照条件对该方法稳定性的影响,并为实验条件的选择提供了一些数据支持。但对实验方法中其它的要素,比如接种量、接种体积等,本研究是根据目前在用的标准方法及检测经验确定的。尽管2.3方法的可重复性测试结果显示,采用实验确定的参数时,结果也稳定可靠,但在实际的检测过程中,根据材料的不同,可能会在初始接种量或接种体积上发生一些变化,这些变化是否会对结果产生影响,什么样的接种量和接种体积是最合适的,还需要进一步的研究。
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