DNA甲基转移酶在苯并[a]芘致小鼠空间学习记忆功能障碍中的改变

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曹晶晶, 郝忠锁, 刘爱香, 李欢, 张志红, 张红梅. DNA甲基转移酶在苯并[a]芘致小鼠空间学习记忆功能障碍中的改变[J]. 环境卫生学杂志, 2018, 8(1): 1-6. 复制到剪切板

CAO Jingjing, HAO Zhongsuo, LIU Aixiang, LI Huan, ZHANG Zhihong, ZHANG Hongmei. The Change of DNA Methyltransferase in Mice with Spatial Learning and Memory Impairment Induced by Benzo[a]pyrene[J]. Journal of Environmental Hygiene, 2018, 8(1): 1-6. 复制到剪切板

DNA甲基转移酶在苯并[a]芘致小鼠空间学习记忆功能障碍中的改变

曹晶晶, 郝忠锁, 刘爱香, 李欢, 张志红, 张红梅

山西医科大学

基金项目: 山西省回国留学人员科研资助项目（2017-059）；山西省高等学校科技创新项目（2016155）；山西医科大学2016年大学生创新校级项目资助（20160305）；山西省研究生联合培养基地人才培养项目（2017JD24）

作者简介: 曹晶晶, 主要从事环境污染物的神经毒性方向研究

通信作者: 张红梅, 副教授, 硕士生导师, 主要从事环境污染物的神经毒性方向研究, Email:zhhm_108@163.com

联系方式：山西省太原市迎泽区新建南路56号;邮编:030000;Email: 957825952@qq.com

摘要: 目的研究DNA甲基转移酶在苯并[a]芘（B[a]P）致小鼠学习记忆功能障碍中的改变，为B[a]P神经毒作用机制的研究提供科学依据。方法将48只成年雄性SPF级hauschka（ICR）小鼠按体重随机分为4组，每组12只，分别为溶剂（花生油）对照组，0.5 mg/kg（低剂量）、2.0 mg/kg（中剂量），和10.0 mg/kg（高剂量）B[a]P染毒组，隔天腹腔注射染毒1次，连续染毒30次。染毒结束后，用Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力。并在染毒第10、20和30次后，用实时荧光定量-聚合酶链式反应（qPCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠大脑皮质DNA甲基转移酶（DNMTs）的基因表达和蛋白活性的改变。结果水迷宫结果显示，随着染毒剂量的增加，小鼠到达平台的潜伏期逐渐延长，高剂量组潜伏期显著高于溶剂对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；小鼠进入目标象限的总次数和在目标象限的游泳路程逐渐减少，高剂量组显著低于溶剂对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；与溶剂对照组相比，各染毒组小鼠大脑皮质中DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的基因表达量和蛋白激酶的活性均逐渐增强，呈明显的剂量和时间依赖性，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论 B[a]P诱导大脑皮质DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因表达水平和蛋白激酶的活性增强，可能是B[a]P致小鼠空间学习记忆障碍的重要机制之一。

关键词: 苯并[a]芘 Morris水迷宫学习记忆障碍 DNA甲基转移酶

The Change of DNA Methyltransferase in Mice with Spatial Learning and Memory Impairment Induced by Benzo[a]pyrene

CAO Jingjing, HAO Zhongsuo, LIU Aixiang, LI Huan, ZHANG Zhihong, ZHANG Hongmei

Abstract: Objectives To investigate the change of DNA methyltransferase (DNMT) mRNA levels and their kinase activities in ICR mice with learning and memory impairment induced by benzo[a]pyrene(B[a]P). Methods Forty-eight adult male ICR mice were categorized randomly into 4 groups based on body weight, one solvent control group and three B[a]P-treated groups at the dosage of 0.5 mg/kg (low-dose), 2 mg/kg (mid-dose) and 10 mg/kg (high-dose). B[a]P-treated mice were intra-peritoneally injected with B[a]P once every two days for 30 times of administration. At the end of 30^th administration, Morris water maze test was used to determine the spatial learning and memory ability of mice. The change of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b mRNA levels were detected by using a real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction (qPCR), and the DNMT1, DNMT3a and DNMT3b kinase activity were determined by using an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) at the end of 10^th, 20^th and 30^th administration. Results Morris water maze test showed an increase of average escape latency time with the dose of B[a]P injected in mice, the escape latency time was significantly longer in the high-dose group than that in the solvent control group (P < 0.05). The frequency of crossing platform and the swimming distance in the target quadrant were gradually decreased with the dose of B[a]Ps, which were both significantly increased in the high-dose group as compared to the solvent control group (P < 0.05). Compared with the solvent control group, DNMT1, DNMT3a and DNMT3b mRNA levels and their kinase activities were significantly increased in cerebral cortex in B[a]P-treated groups (P < 0.05), and were significantly dependent on the duration and the dose of B[a]P administration (P < 0.05). Conclusions B[a]P administration could result in the increase of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b mRNA levels and their kinase activities in cerebral cortex in mice, which might be the potential critical mechanism of learning and memory deficits induced by B[a]P.

Key words: Benzo[a]pyrene Morriswater maze learning and memory impairment DNA methyltransferase

苯并[a]芘(B[a]P)是一种广泛存在于环境中的多环芳烃类化合物，主要来源于工业生产生活中煤炭、石油、天然气燃烧和机动车辆排出产生的废气，加工橡胶、熏制食品以及纸烟与烟草的烟气等，可通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体，是国际公认的化学致癌物^[1]。B[a]P具有亲脂性，可通过血脑屏障进入中枢神经系统，引起中枢神经系统的毒性损伤，但是其主要机制尚不明确。

DNA甲基化是重要的表观遗传机制，是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶，进而调控基因的转录和表达^[2]。DNA甲基转移酶(DNMTs)是调控DNA甲基化的关键酶，哺乳动物中已经发现并鉴定了三种DNMTs，分别为DNMT1、DNMT3a和DNMT3b^[3]，在海马中学习记忆的形成以及突触可塑性中是必需的^[4-5]。本研究拟探讨DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因表达和蛋白激酶活力在B[a]P致小鼠学习记忆功能障碍中的可能作用，为研究B[a]P神经毒性机制的研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康雄性ICR小鼠48只(5周龄，体重为18~20 g)，购自北京海淀兴旺实验动物养殖场，动物合格证号：SCXK(京)2014-0013。

1.2 试剂与仪器

B[a]P(纯度＞97%)，Sigma公司；ELISA试剂盒(生工生物工程有限公司)；RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimerScript RT Master Mix、PCR引物、SYBR^®Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa)。Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)，Line Gene 9600荧光定量PCR仪(杭州博日科技有限公司)，酶标仪(美国伯乐)。

B[a]P溶液的配置：准确称取B[a]P粉剂170 mg，溶于34 mL压榨花生油(金龙鱼牌)中，配制成5 mg/mL的B[a]P储备液，超声振荡至全部溶解，室温避光储存备用。使用前用花生油稀释到相应的使用浓度。

1.3 动物的分组和染毒

SPF级雄性ICR小鼠48只，在动物房(自然节律采光，室温为18℃~23℃，湿度为40%~70%)适应性喂养1周后，按体重随机分为4组(每组12只)，分别为溶剂(花生油)对照组，低、中和高剂量B[a]P染毒组。染毒组腹腔注射0.5，2.0和10.0 mg/kg B[a]P，溶剂对照组注射等体积的花生油，隔天染毒1次，连续染毒30次。染毒时间固定在上午9:00。隔天肌肉注射青霉素(2万单位/只)以防感染。每天记录动物的饮水和饮食量以及生活状态，每周称量1次体重。

1.4 样本采集

染毒结束后，将小鼠用水合氯醛麻醉，颈椎脱臼处死，迅速取出大脑组织并在冰皿上分离出大脑皮质，放于EP管中，-80℃冻存。

1.5 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验(Morris water maze test)：为时6 d，前5天为定位航行实验，第6天为空间探索实验。定位航行实验是将小鼠放入水中，利用小鼠天生会游泳但是怕水的特点，迫使小鼠找到平台逃离水中，小鼠通过固定训练，逐渐会在大脑中形成认知和记忆，实验前1天让小鼠适应性游2 min。设置水温20±1℃，平台直径约为6.5 cm，高度为28 cm, 水面高出平台1.5 cm，平台位于NE象限。将小鼠头朝池壁放入水中，记录小鼠找到平台的时间，如果时间超过60秒，则通过简单引导让小鼠到平台上，等待10秒，潜伏期记60秒，接着将小鼠移出水面，简单擦拭。每天训练4回，训练的间隔为15 min，训练天数5 d。空间探索实验：撤掉平台，将小鼠由原平台所在象限的相对象限(SW象限)入水，记录小鼠在目标象限所花的时间和进入该象限的次数，同时利用图像分析采集系统(Smart v3.0)记录小鼠的游泳路径，游泳时间等。

1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)测定DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的表达量

称取50 mg小鼠大脑皮质组织，按照TaKaRa试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA的纯度和浓度，纯度在1.8~2.2之间认为合格，可用于后续实验。按50 ng/μL的浓度将其反转录为cDNA，进行qPCR扩增，引物由TaKaRa公司设计并合成(表 1)。

表 1 小鼠皮质相应基因所用的引物信息

引物名称	引物序列(5’→ 3’方向)	退火温度/(Tm，℃)	扩增产物/bp
Mus Dnmt1-F	CTTCGGCAACATCCTGGACA	60	103
Mus Dnmt1-R	ACTGGACAGCAGGCAGAGCTTA	60	103
Mus DNMT3a-F	TGCGCCAGAAGTGCAGAAAC	60	141
Mus DNMT3a-R	CGTCATACTGGTAAGCACACTCCAA	60	141
Mus DNMT3b-F	GAATGCGCTGGGTACAGTGG	60	100
Mus DNMT3b-R	GCCAGATTAAAGTGCTGGCTGAA	60	100
Mus actin-F	CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC	60	171

表选项

PCR反应体系包括：2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下引物各1 μL，cDNA 10 ng，ddH₂O补足体积至25 μL。扩增程序如下：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。反应结束后确认qPCR的扩增曲线和熔解曲线，采用2-△△Ct法计算实验组相对于对照组目的mRNA表达的变化倍数[△△Ct=(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。

1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测DNMTs激酶活性的变化

称取50 mg的小鼠大脑皮质样本，加入450 μL PBS，充分匀浆，离心20 min(2 000~3 000 r/min)，仔细收集上清。BCA蛋白定量，将所有样本稀释到同一浓度。具体实验操作按试剂盒说明书进行。

1.8 统计学分析

实验结果用x ± s来表示，用SPSS 22.0软件进行统计学分析，多组间比较用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)。进一步组间两两比较，方差齐时，采用LSD检验；方差不齐时，用Dunnet-t法检验，双侧P < 0.05认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠的一般情况

染毒期间，溶剂对照组和低剂量组小鼠进食、饮水情况基本接近，而中、高剂量组小鼠进食、饮水明显减少，尤以高剂量组最为明显。与溶剂对照组相比，低剂量组小鼠有中枢神经功能轻度兴奋的表现，主要为易激惹，好斗、打架次数明显增多。而中、高剂量组小鼠明显受抑制，精神萎靡、情绪低落、活动减少、反应迟钝，毛发光泽度降低、干枯易脱落等现象。

2.2 小鼠的体重变化

从图 1可以看出，随着染毒过程的进行，与溶剂对照组相比，低剂量组小鼠体重变化无明显差异，中剂量和高剂量组体重增重逐渐减少，高剂量组体重明显低于溶剂对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。染毒结束后，与溶剂对照组相比，低、中剂量组小鼠体重没有显著变化，但高剂量组小鼠体重降低了约7 g左右，并且中、高剂量组部分小鼠出现腹部隆起，体态笨重，活动减少，解剖后发现有不同程度的腹水。

注：^*表示与0 mg/kgB[a]P组比较，差异有统计学意义(P < 0.05) 图 1 小鼠体重随时间的变化(n=12)

图选项

2.3 水迷宫结果

各染毒组与对照组小鼠的平均游泳速度几乎相当(P>0.05)(图 2A)，提示各组小鼠的体力是均衡可比的。随着染毒剂量的增加，小鼠到达平台的潜伏期逐渐延长，高剂量组潜伏期显著高于溶剂对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)(图 2B)；小鼠进入目标象限的总次数和在目标象限的游泳路程逐渐减少，高剂量组显著低于溶剂对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)(图 2C和图 2D)。

A小鼠平均游泳速度；B到达平台潜伏期；C进入目标象限总次数；D目标象限游泳路程
注：^a为与0 mg/kgB[a]P组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)；^b为与0.5 mg/kgB[a]P比较，差异有统计学意义(P < 0.05) 图 2 水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力的结果(n=6)

图选项

2.4 小鼠皮质中DNMTs基因表达量和蛋白激酶活力的改变

B[a]P染毒第10次、第20次、第30次后，各染毒组小鼠大脑皮质中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因表达量和蛋白激酶活力均逐渐增高，与相应的溶剂对照组相比，差异均具有统计学意义(P < 0.05)(表 2)；随着染毒剂量的增加和时间的延长，小鼠大脑皮质DNMT1基因和蛋白激酶活力在中、高剂量组增加最为明显；小鼠大脑皮质DNMT3a基因和蛋白激酶活力在B[a]P染毒第20次和第30次后中、高剂量组增加最为显著；而DNMT3b基因和蛋白激酶活力随着染毒剂量的增加亦逐渐增加，但增加幅度较为缓慢，但仍维持在较高的水平。

表 2 小鼠大脑皮质中DNMTs基因表达量和激酶活力的改变(x ± s)

染毒次数	组别	DNMTs基因表达的改变			DNMTs蛋白激酶活力的改变
染毒次数	组别	DNMT1	DNMT3a	DNMT3b	DNMT1/(ng/L)	DNMT3a/(ng/L)	DNMT3b/(ng/L)
第10次 (n=3)	0 mg/kgB[a]P	1.01±0.14	1.01±0.14	1.01±0.14	97.56±6.55	105.02±19.47	48.14±4.05
	0.5 mg/kgB[a]P	1.54±0.12^a	1.19±0.01	1.17±0.07	96.47±14.15	87.21±4.18	57.44±3.76^a
	2 mg/kgB[a]P	1.59±0.13^a	1.37±0.10^a	1.39±0.15^a	142.34±4.70^ab	120.70±9.33	65.45±5.16^ab
	10 mg/kgB[a]P	1.73±0.05^ab	1.66±0.14^ab	1.64±0.07^abc	151.04±1.87^ab	326.53±46.19^abc	74.41±3.11^abc
第20次 (n=3)	0 mg/kgB[a]P	1.00±0.08	1.01±0.18	1.01±0.18	98.81±3.23	113.93±25.00	53.34±9.96
	0.5 mg/kgB[a]P	1.03±0.07	1.42±0.10^a	1.32±0.10^a	95.07±15.16	118.23±26.10	60.73±3.58
	2 mg/kgB[a]P	1.39±0.05^ab	1.54±0.06^a	1.35±0.16^a	148.56±16.72^ab	263.55±7.60^ab	72.42±5.86^ab
	10 mg/kgB[a]P	1.55±0.15^abc	1.88±0.07^abc	1.75±0.19^abc	154.78±21.19^ab	490.97±33.02^abc	78.37±2.55^ab
第30次 (n=6)	0 mg/kgB[a]P	0.95±0.138	1.01±0.130	1.01±0.146	96.01±6.19	83.52±7.60	48.14±5.27
	0.5 mg/kgB[a]P	1.04±0.087	1.16±0.166^a	1.14±0.098	96.94±13.88	80.45±18.51	54.43±2.51^a
	2 mg/kgB[a]P	1.25±0.095^ab	1.28±0.171^a	1.38±0.074^ab	142.96±3.88^ab	99.49±9.43^b	61.76±2.79^ab
	10 mg/kgB[a]P	1.38±0.067^abc	1.66±0.290^abc	1.44±0.070^ab	157.26±9.20^ab	260.48±9.90^abc	71.94±1.71^abc
注：^a为与0 mg/kgB[a]P组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)；^b为与0.5 mg/kgB[a]P组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)；^c为与2 mg/kgB[a]P组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)

表选项

3 讨论

B[a]P由于其高亲脂性而容易通过血脑屏障存在于中枢神经系统，与学习和记忆密切相关。本课题组率先发现，长期职业暴露B[a]P的人群，认知功能和自主神经调节功能显著下降，其严重程度与B[a]P的高暴露密切相关^[6-7]；并通过脑室注射B[a]P复制了B[a]P引起SD大鼠学习记忆能力损伤的动物模型^[8]，但脑室注射的染毒途径与人群实际暴露途径之间有较大的差异。本次研究采用腹腔注射染毒B[a]P，具有给药剂量准确，吸收效率高、操作方便的特点，复制了通过消化道接触B[a]P致ICR小鼠学习记忆功能障碍的动物模型。但B[a]P致学习记忆功能损害的机制尚不清楚。

本研究发现，随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长，小鼠大脑皮质中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因表达量和蛋白激酶的活性均显著增强，并维持在较高的水平。提示DNMTs可能参与B[a]P所致小鼠学习记忆功能损伤的作用过程。

表观遗传学是指DNA序列没有发生变化，其他机制引起的可遗传改变^[9]。DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰之一, 大量研究表明，DNA甲基化可以导致染色质结构、DNA构象的改变，也可以影响DNA的稳定性和DNA与蛋白质之间的相互作用，进而影响基因的表达^[10-11]。DNA甲基化主要是在DNMTs的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将其甲基转移到胞嘧啶5位碳原子上的过程。DNMTs是DNA甲基化过程的关键酶，哺乳动物中目前发现的与DNA关系密切的DNMTs有3种^[12]，维持机体现存的甲基化的DNMT1^[13]和从头合成新的甲基化的DNMT3a、DNMT3b^[14]。目前还没有关于B[a]P致神经细胞损伤中，大脑皮质中DNMTs变化的相关报道。在本研究中，随着B[a]P染毒剂量的增加和时间的延长，小鼠大脑皮质的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因和酶活力均显著提高。Leonardo等^[15]研究发现，DNMT1基因敲除小鼠出现学习记忆缺陷。庞伟等^[16]研究发现，缺锌处理神经细胞24 h后，DNMT1 mRNA表达增加，DNMT3a mRNA表达降低，而DNMT3b mRNA的表达无明显变化。虽同样是引起神经损伤，但是DNMTs的变化有一些出入，可能是因为庞伟等的研究对象是神经细胞，且短时间染毒可能出现一过性的改变。居玲莎等^[17]研究表明七氟烷致新生大鼠远期认知功能损伤的模型中，海马区DNMT3a和DNMT3b的mRNA和蛋白水平随作用时间的延长显著增加，该结果与本研究结果一致。Subbanna等^[18]研究发现，给出生7天的小鼠摄入酒精后，成年时小鼠记忆能力下降，海马内DNMT3a蛋白含量显著增加。一项动物研究显示^[19]，早期母婴分离可导致小鼠成年后探索行为受损并伴随DNMTs水平的增加。本研究结果显示，随着B[a]P染毒剂量的增加和时间的延长，小鼠大脑皮质的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因和酶活力均显著提高，尤其以DNMT3a的变化最为显著，提示B[a]P致小鼠认知功能损伤过程中，大脑皮质的DNA甲基化模式正在发生改变，有新的甲基化过程在进行。但具体发生了什么样的甲基化模式改变，以及发生甲基化的基因有哪些，将是下一步研究的核心内容。本研究结果，为后续从甲基化模式改变方面探讨B[a]P致学习记忆损伤的作用机制提供了明确的科学线索，也为B[a]P神经毒性的防治提供了一定的作用靶点。

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DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2018.01.001
中国疾病预防控制中心主办。

曹晶晶, 郝忠锁, 刘爱香, 李欢, 张志红, 张红梅

CAO Jingjing, HAO Zhongsuo, LIU Aixiang, LI Huan, ZHANG Zhihong, ZHANG Hongmei

DNA甲基转移酶在苯并[a]芘致小鼠空间学习记忆功能障碍中的改变

The Change of DNA Methyltransferase in Mice with Spatial Learning and Memory Impairment Induced by Benzo[a]pyrene

环境卫生学杂志, 2018, 8(1): 1-6

Journal of Environmental Hygiene, 2018, 8(1): 1-6

DOI: 10.13421/j.cnki.hjwsxzz.2018.01.001

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