微囊藻毒素(MC)是一种环状七肽物质，由古老的原核生物蓝藻代谢释放产生，有80种异构体，对动物和人有强烈的肝毒性^[1-1]，其中最常见的MC有MC-LR、MC-RR和MC-YR。目前研究显示水体含量最高，毒性最大的是MC-LR，能诱发肝癌，近期研究还发现低剂量的MC-LR即能损伤神经细胞、生殖细胞^[3-3]。在淡水水体富营养化的今天，蓝藻爆发事件时有发生，MC污染对人类的健康造成了严重威胁^[7-7]。

检测MC-LR的方法主要有物理和化学方法，物理方法主要用于定性和定量测定毒素，依靠的精密仪器，一般价格昂贵、操作繁琐，尚不能国产化；化学方法主要用于监测水体和食物链中MC-LR的水平，可操作性强^[9-9]。本研究着眼于MC-LR的快速、灵敏、定量检测，从反应条件、方法性能等方面评估添加酶联免疫(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和纳米均相时间分辨荧光免疫分析法(NH-TRFIA)这三种免疫分析的特点。

1 材料与方法 1.1 试剂

MC-LR标准品、MC-LR-BSA抗原、MC-LR抗体(无锡市疾控中心提供)。铕标记试剂盒、NH-TRFIA发光微球、NH-TRFIA链霉亲和素—感光微球(美国PE公司)。羊抗兔IgG、生物素—羊抗兔(上海神航公司)。氰基硼氢化钠、2-(N-)吗啉—乙磺酸(MES)和羧基甲氧基半盐酸盐(CMO，美国Sigma-Aldrich公司)。Tween-20、碳酸钠、碳酸氢钠和戊二醛均为分析纯(国药沪试)。

1.2 仪器

酶标仪(3550-UV，美国BIO-RAD公司)；全自动TRFIA检测仪(Auto DELFIA1235，美国PE公司)；NH-TRFIA免疫检测仪(Lica HT，上海博阳生物科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA

HRP抗体的标记：采用戊二醛两步法，将抗体与HRP酶按照1 ∶2(w ∶w)反应，获得HRP-MC-LR抗体^[12]。包被板的制备：100 μL MC-LR-BSA抗原用0.05 mol/L碳酸盐(pH 9.6)稀释后，包板过夜；次日弃去包被液，用含有2 % BSA的缓冲液封闭2 h，随后弃去，真空抽干，-20 ℃保存。检测方法：向包被板中加入50 μL标准品或样品，50 μL抗体溶液，37℃反应1 h，洗涤板孔3次；再加入100 μL 酶标二抗，37℃反应1 h，洗涤3次；加入100 μL显色液，避光反应15 min；然后加50 μL终止液，于酶标仪450 nm波长读数。

1.3.2 TRFIA

包被板的制备：方法同MC-LR ELISA包被板的制备。铕标羊抗兔的制备：用铕标记试剂盒进行标记^[13]，随后测定标记物洗脱液的荧光值，根据荧光值强弱，合并对应的第一洗脱峰，获得铕标抗体溶液。检测步骤：在包被板上，加入50 μL MC-LR标准品或样品，以及50 μL已稀释的抗体，37℃震荡1 h，洗板4次，拍干；再加入100 μL 反应缓冲液稀释的铕标羊抗兔，37℃震荡0.5 h，洗板6次；最后加入100 μL增强液，震荡5 min后直接测量板孔荧光计数。

1.3.3 NH-TRFIA

发光微球的制备：首先将1 mg发光微球、0.05 mg MC-LR-BSA、12.5 μL的1% Tween-20溶液，以及10 μL的25 g/L的氰基硼氢化钠混合在离心管中，然后用0.01 mol/L的MES溶液(pH 6.0)补充到200 μL体积，令上述溶液充分混合后37℃反应过夜。次日加入10 μL 0.3 mol/L CMO溶液(pH 5.0)终止连接反应，37℃孵育1 h。之后将连有MC-LR-BSA的发光微球离心去上清，再超声混匀，重复上述步骤两次。最后将微球溶于含有0.1 % Proclin-300的PBS (pH 7.4)缓冲液中，2 ～8 ℃保存。检测步骤：取包被有MC-LR的发光微粒、标准品或处理好的样品、一定浓度的抗MC-LR抗体和生物素—羊抗免共四种试剂，每种各20 μL，加入白色不透明微孔板，37 ℃反应；随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃反应；在Lica HT检测仪上检测光信号，从标准曲线测算出样品中的MC-LR含量。

1.4 统计学分析

本研究数据以均数和标准差描述，用SPSS 19.0软件进行统计学分析，组间比较采用配对样本t检验进行，P <0.05认为有显著性差异。

2 结果与讨论 2.1 反应条件

本研究基于ELISA、TRFIA和NH-TRFIA，定量分析了MC-LR含量，由于三种技术的检测原理不同，造成反应参数的差异。在此，比较了三种模式的反应条件(表 1)。

2.1.1 反应微孔板

上述方法对环境均没有放射性污染，基于微孔孔板，ELISA和TRFIA采用了透明聚苯乙烯包被板，NH-TRFIA采用了白色不透明微孔板。

2.1.2 反应步骤

ELISA方法手工操作，反应时间最长，而TRFIA和NH-TRFIA可以全自动仪器检测，其中NH-TRFIA反应时间最短，小于1 h。因为反应原理不同，ELISA和TRFIA技术都需要洗涤，分离固定相和游离相，进而增加了反应步骤和干扰因素；而同为竞争型反应的NH-TRFIA技术，整个反应在液体中发生，不要洗涤，构成均相系统，因此反应步骤少，耗时短。

2.1.3 信号系统

ELISA采用酶促底物放大信号，检测物质的量与酶结合物量直接相关，酶催化速度决定信号放大时间，一般需要15 min得到稳定的颜色参数。常见的发光系统，即应用辣根过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺后，检测波长630 nm，加入强酸后显色稳定，波长为450 nm^[14]。

TRFIA发光技术基于稀土离子的解离与增强，用专用试剂增强液将稀土离子从免疫复合物上解离下来，被检测物的含量与稀土离子的量相关，解离速度决定获得稳定荧光信号时间，一般5 min后可以检测荧光信号。利用时间分辨荧光测定仪中的时间门电路，在340 nm激发光照射待测物后，延缓测量时间，待短寿命的自然本底荧光衰变后，得到稀土离子铕(在TRFIA中最常用)的615 nm放射光，排除了非特异荧光信号的干扰，提高了检测灵敏度；又因激发光与放射光位移较长，能排除其他荧光物质的影响，保证了检测的特异性^[15-15]。

均相的NH-TRFIA通过免疫复合物的形成，构成光信号的理化通路，即体系受到红光(波长680 nm)照射后，感光微球能生成单线态氧，并发出高能级的发射光，最终被仪器所检测到。若没有免疫复合物形成，感光微球生成的氧能量则会迅速猝灭，即发光微球在200 nm范围之内接收不到单线态氧，因此无法发光，仪器测不到光信号^[17-17]。

TRFIA荧光信号强，非常稳定，容易保持；ELISA和NH-TRFIA均需要避光反应，前者的显色底物不稳定，长时间放置容易分解，影响荧光值的准确性；后者接触可见光则影响信号传递，因此也需要避光，但因采用了稀土金属离子为发光剂，信号相对稳定。

2.1.4 试剂用量

ELISA试剂消耗量大，抗体用量最多；TRFIA具有高灵敏特点，试剂消耗量较少；NH-TRFIA对样本的需求量最低，抗体用量更为节省。

2.2 方法学性能

以ELISA、TRFIA和NH-TRFIA技术建立的MC-LR检测方法，基于竞争型反应原理。灵敏度、精密度、准确度等反映了方法学的性能参数。在不同浓度的MC-LR标准品和抗体作用下，本文比较了上述三种免疫反应的性能指标。灵敏度由重复10次测定空白样本获得，将空白样本的荧光值(均值-2×标准差)带入MC-LR标准曲线计算得到对应浓度值。经双孔测定MC-LR标准品，对每个标准品的相对标准差(RH=标准差/均值)取平均后得到方法的精密度。方法的准确度通过检测特定样品获得，向空白水样分别添加0.1，0.5，1 ng/mL的MC-LR纯品，三次重复检测其浓度值，其测定值与添加值的比值为回收率。

NH-TRFIA获得了最佳的灵敏度和特异性(表 2)，其次是TRFIA，ELISA相对较差，这与之前的文献报道一致^[20]。TRFIA和NH-TRFIA的平均RH 小于10 %，ELISA因受到方法学局限RH控制在15 %以内，都达到了较好的精密度。从样品的添加回收率指标分析，三种检测方法波动均在80%～120%之间，可以提供准确的检测结果。

2.3 相关性比较

高效液相色谱(HPLC)检测MC-LR是目前采用最多、较为经典的手段，其检测结果重复性好、相对准确。表 3对照了HPLC，分析三种检测方法对同一份水样的检测结果，每份样品重复测量3次获得的平均值与HPLC的结果相比，P >0.05，表示方法间无明显差异，检测结果可靠，三种免疫学检测均可用于MC-LR样本的初筛。

3 结论

MC-LR是蓝藻产生最多的一种毒素，主要在江河湖水中存在，因具有强烈的肝毒性，国家将其列为生活饮水的检测指标。目前的检测方法有HPLC、质谱、色谱法等，因仪器成本高、操作复杂，不利于普及。

本研究比较了几种免疫化学分析法发现，ELISA操作便利性欠佳，反应需要多次孵育和洗涤，耗时长，操作繁琐，发光信号不够稳定，性能指标相对优势不明显。TRFIA以金属离子铕示踪，集合同位素与酶标记优点，信号稳定，灵敏度高。NH-TRFIA采用了光化学发光原理，应用金属铕的特殊波长，反应快捷、省时，操作更为简便。因此，NH-TRFA和TRFIA适合高通量的MC-LR检测，具有推广应用优势。