军团病是由军团菌引起的临床综合症，以肺炎为主要表现伴多系统损害，病死率在5%~40%间^[1-2]。人们通常是由于呼吸了含有军团菌的气溶胶而感染军团病，主要致病菌为嗜肺军团菌。军团菌病爆发的流行病学研究显示，冷却水、淋浴水是军团菌的主要污染源，然而大部分的军团菌病为散发病例，其环境来源广泛且在地区之间存在差异，日本土壤中军团菌的污染最为常见，美国以水环境为主，澳大利亚则以集中空调的冷却水为主要污染源，而欧洲半数以上的军团菌病为旅行相关型^{[1, 3]}。我国的冷却水、洗浴水、喷泉水、环境土壤、集中空调风管内壁积尘中嗜肺军团菌的检出率在20%~90%之间，提示军团菌环境污染状况严重^[4-6]。由于我国尚无军团菌病常规监测系统，使得我国军团菌病发病情况不明，亦缺乏人群嗜肺军团菌感染的系统数据，限制了军团菌病流行病学调查研究的进一步开展。为了解我国肺炎病人血清中嗜肺军团菌抗体水平，本研究采用间接酶联免疫吸附法对北京、江苏和深圳3个地区7家综合性医院的住院肺炎病人血清中嗜肺军团菌1—6血清型的IgG/IgA/IgM联合抗体进行调查，并初步探讨影响检测结果的相关因素。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

3-18K型冷冻离心机(德国SIGMA公司)，Varioskan Flash全波长扫描式多功能酶标仪(Thermo SCIENTIFIC公司)，WELLWASH 4 MK 2洗板机(Thermo公司)，军团菌IgG/IgM/IgA试剂盒(Cortez公司)。

1.2 研究对象

2012年6月—2013年6月，随机选择北京市丰台区、江苏省常州市和无锡市、广东省深圳市的7家综合性医院为调查现场，已确诊为肺炎的新入院病人为调查对象。

1.3 流行病学调查

根据美国疾病预防控制中心军团菌病例报告表设计统一的信息调查表，由培训后的医护人员在病人住院当天进行一对一面访，调查内容包括医院基本信息、病人一般情况、既往病史、确诊疾病、入院前是否服用抗生素类药物等。

1.4 生物样品收集

分别在肺炎病人入院当天和住院2周后(住院不满两周者在出院前1 d)采集静脉血标本3 mL，置于37℃温箱60 min后，3 000 r/min离心10 min分离血清，-70℃保存，1周内检测。

1.5 血清嗜肺军团菌抗体检测

采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)，定性检测人体血清样本中嗜肺军团菌1—6血清型的IgG/IgA/IgM总抗体。

测量孔的光密度(OD)比≤0.90为阴性样品，OD比介于0.91~1.09之间的为疑似样品(需要进行复测)，OD比≥1.10为阳性样品。(OD比=样品OD值/OD截断值，截断OD值=校准剂OD均值× 0.25)

1.6 质量控制

按照试剂盒说明书的方法，每次检测设置校准3孔，空白对照、阳性和阴性控制各1孔。校准孔OD均值、阳性和阴性控制孔OD值应同时符合如下规则：① 阴性控制OD值≤0.250；② 校准孔OD均值≥0.300；③ 阳性控制OD值0.500；④ 阴性控制OD值/校准孔OD均值≤0.9；⑤ 阳性控制OD值/校准孔OD均值≥1.25，否则此次检测视为无效。

1.7 统计分析方法

采用Epi Info 3.5.1软件进行数据库录入，连续变量使用t检验判断两组之间差异，因分类资料总例数 < 40，采用Fisher确切概率(Fisher probabilities in 2×2 table)法进行检验，所有分析均用SAS 9.2软件进行分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况

共调查7家综合性医院的35例肺炎病人，北京市丰台区9例、江苏省常州市5例，江苏省无锡市9例，广东省深圳市12例。调查对象年龄在17 ~89岁之间。每位调查对象收集入院当天和入院两周后的血清样本共计70份。

2.2 血清嗜肺军团菌抗体检测结果

70份血清样本的检测结果见表 1，调查的35例肺炎病人入院当天和入院两周后血清嗜肺军团菌抗体阳性率分别为20%(7/35) 和20%(7/35)，其中5例病人入院当天和入院两周后血清均为阳性，2例病人入院当天血清嗜肺军团菌抗体阳性而入院两周后阴性，2例病人入院当天血清嗜肺军团菌抗体阴性而入院两周后阳性性。经配对卡方检验，综合性医院肺炎病人入院当天和入院两周后血清中嗜肺军团菌抗体阳性率差异有统计学意义(P=0.0012)。

2.3 肺炎病人嗜肺军团菌感染相关因素分析

35例病人中9例病人的血清中检测到嗜肺军团菌，感染率为25.7%(9/35)。

按照性别、年龄、地区和抗生素使用情况进行分组后，综合性医院肺炎住院病人嗜肺军团菌抗体阳性情况见表 2。通过卡方检验分析，肺炎病人不同性别、年龄、地区、抗生素使用情况的嗜肺军团菌血清抗体阳性率差异均无统计学意义。

3 讨论

军团菌病是1976年美国费城召开退伍军人大会时暴发流行而得名^[7]。随后美国、英国、加拿大等不同国家和地区也相继报道了军团菌病例，1982年在南京我国首次报道了军团菌病例^[8]。目前除西藏外我国的所有地区都有过军团菌病暴发或散发流行的报道。1985—2005年间，国内正式报道13起不同规模的军团菌病暴发流行。除暴发流行外，散发的军团菌病例亦为多见，近几年该病的发病率明显呈上升趋势^[9]，受到各国政府以及卫生部门的高度重视。

目前，欧美等国均已建立了完善的军团菌病常规监测系统，国欧洲军团菌感染工作组(europea working group for legionella infections，EWGLI)是国际上较早开展的军团菌监测的机构，1986年该工作组成立，1987年建立起欧洲旅游相关的军团菌病监测网络(european surveillance scheme for travel associated legionnaires’disease, EWGLINET)，后并入欧洲疾病预防控制中心。该监测网络已有36个国家参加，参与国每年都要报告和交流本国军团菌病的流行病学及微生物学的信息资料。

我国尚未建立军团菌病监测网络，缺乏全国性的军团菌病流行及病原学资料^[10]。2012年原卫生部重新修订了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》、《公共场所集中空调通风系统清洗消毒规范》和《公共场所集中空调通风系统卫生学评价规范》，再次明确了公共场所军团菌污染的监测、控制方法等。但由于缺乏军团菌病发病等资料，在军团菌污染的卫生管理和风险预警等方面缺乏针对性，使得军团菌病的管理措施、预防控制体系上仍需要进一步规范和完善^[9]。

军团菌广泛存在于自然(如湖泊、河流、小溪等)和人工(如冷却塔、冷热水管、喷泉等)水环境中, 易感人群可通过吸入含有军团菌的气溶胶而致病。快速、准确地确定病原体并采取针对性有效措施是控制该病的关键。军团菌病实验室检测方法主要包括培养法、血清抗体检测、尿抗原检测以及核酸检测。军团菌分离培养法是确定军团菌感染的“金标准”，特异性为100%，但敏感性较低，仅为25%~75%^[11-12]，培养法的结果受实验室技术影响较大，操作繁琐，费时较长。目前常用的ELISA法检测嗜肺军团菌血清抗体, 其结果判定相对客观、精确，由于IgG抗体出现时间较晚，因此不能用于疾病的早期诊断，且单份血清中抗体滴度常难以断定是现症还是既往感染。尿抗原检测具有标本容易获得、操作简便快速、灵敏度高和对病人无创伤等优点，是军团病早期快速诊断的主要方法之一，但现有方法多局限于检测Lp1。基于PCR技术发展起来的各种检测方法具有较高的敏感性和特异性, 可检测所有种群的军团菌，但不能区分军团菌的死活, 并易受检测样品中PCR抑制剂的影响，不同的样品前处理、核酸扩增过程、引物和探针的选择对检测结果具有很大的影响^[13]。

军团菌感染1周左右可检测出血清中军团菌特异性IgM抗体，2周左右可检测到特异性IgG抗体，且IgG抗体可在体内持续较长时间甚至数年。近些年，我国不同地不同人群开展的嗜肺军团菌抗体水平的调查较多，不同研究中嗜肺军团菌抗体阳性率差异较大，由于所选检测方法多样，不同结果的可比性较差。杨小华等^[14]选取≥65岁的下呼吸道感染患者606例，男365例，女241例，年龄65~110岁，用间接免疫荧光法(IFA)检测其血清中嗜肺军团菌1型IgM(Lpl—IgM)抗体，阳性率17%，其中男阳性率15.8%，女性阳性率18.7%。许文炯等^[15]选择南京市肺科患者572人，采用微量凝集试验检测军团菌抗体，阳性率46.3%，Lp1型阳性率最高(14.2%)，其次为Lp6型(8.9%)，Lp10型最低(0.17%)。王洪波等^[16]选取14岁以下社区获得性肺炎患儿386例，应用ELISA检测其血清Lp1~6型IgG抗体，IgG阳性14例，阳性率为3.63%，本次研究选择综合医院肺炎病人为调查对象，35例肺炎病人入院当天和入院两周后血清嗜肺军团菌抗体阳性率分别为20%(7/35) 和20%(7/35)，高于王洪波等的研究结果，主要原因是本次研究选择1~6型的联合抗体进行检测。

血清军团菌抗体检测的常见方法有酶联免疫吸附法、免疫荧光法、微量凝集等方法，酶联免疫吸附法具有操作简便、快速、结果判定客观等特点，本研究采用酶联免疫吸附法检测肺炎病人入院当天和住院两周后的双份血清中LP1-6型IgG/IgM/IgA总抗体，初步调查我国肺炎病人的军团菌感染现况。本次研究以单份血清嗜肺军团菌抗体阳性，即判定为感染过军团菌。检测结果表明，调查的35例肺炎病人中，军团菌感染9例，感染率26%，由于各地区军团菌抗体检测使用的方法、涉及的人群以及检测的抗体型别不同，尚不能对此次研究得到的感染率的高低做出判断。本次研究中，入院当天和入院两周后血清均为阳性的病人5例，阳性率为14%，仅1份血清抗体阳性的病人4例，阳性率11%。由此可见，单纯的检测1份血清，无论是入院血清或者两周后血清，均会有漏检的情况发生。且入院当天和入院两周血清抗体阳性率差异有统计学意义，通过本次研究尚不能确定对嗜肺军团菌感染情况的调查是采集入院当天血清还是采集两周后血清更为合理，在肺炎病人嗜肺军团菌抗体检测或流行病学调查中，通过采集双份血清能够提高血清嗜肺军团菌抗体阳性检出率，较采取一份血清，更合理，更不容易漏检。

本次研究的病人中2例病人入院当天血清阳性而在入院两周后血清转阴，2例病人入院当天血清阴性而在入院两周后血清阳性。此次调查患者为肺炎病人但不确定为军团菌感染所引起的肺炎，患者入院当天血清抗体为阳性只能说明患者曾感染过军团菌，入院2周后血清抗体转为阴性，可能是受到抗生素使用的影响；也有可能是军团菌感染发生在一段时间之前，本次检测处于患者体内血清抗体衰减期间，以致入院2周后血清抗体低于试剂盒检出限。患者在入院当天血清为阴性，有可能是因为抽血时患者体内的血清抗体未能达到试剂盒的检出限，两周后患者体内的血清抗体上升到了检出限之上。

本研究中入院前抗生素使用情况对嗜肺军团菌感染的影响没有统计学意义，可能是由于此次送检样本中入院前使用抗生素情况的构成比偏差较大的原因造成的(入院前使用抗生素的患者30人，未使用的患者5人)。有研究报道33%的病人在发病2年后仍可检出军团菌抗体^[17]，为避免院内感染造成的抗体呈阳性，本研究视入院血清抗体阳性者为军团菌感染；若确诊需依据诊断标准，即病人恢复期血清军团菌抗体较急性期增高4倍^[18]。因测定单份血清中抗体滴度难以断定是现症还是既往感染，进一步对肺炎患者的急性期及恢复期双份血清抗体进行定量检测，能够对军团菌病的确诊更有意义。