雾霾天气多发于寒冷的秋冬季节，其所含的PM_2.5具有强烈的富集性，容易停留于终末细支气管和肺泡，影响肺部气体交换功能，导致或诱发气管—支气管炎、肺炎、哮喘等多种呼吸道疾病。前期的研究结果表明^[1]，PM_2.5对Wistar大鼠肺损伤组织中HMGB1、TNF-α、IL-6的表达具有一定的影响，为进一步探讨中医方药对雾霾天气下肺脏的保护作用，本实验模拟秋季气候环境，选用中医经典方剂杏苏散、桑杏汤，分别对雾霾天气下PM_2.5致Wistar大鼠肺损伤组织炎症因子的表达进行干预，为探求中医防治雾霾伤肺的有效方药提供客观依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

选用SPF级健康雄性Wistar大鼠32只，许可证号：SCXK (鄂)2008—0004，体重为200~250g(武汉大学实验动物中心提供)。购买后在湖北中医药大学动物实验中心 (许可证号：SYXK (鄂)2012—0067) SPF级实验动物房适应性饲养7 d。

1.2 仪器设备与试剂

Mini Vol PM_2.5便携式PM_2.5采样器、47 mm玻璃纤维滤膜 (美国Air Metrics公司)，Alpha2-4型冷冻干燥机 (德国Christ公司)，染毒箱由LRH-250人工智能气候箱 (广东医疗器械厂) 改良成人工智能气候染毒箱。HMGB1兔单克隆抗体 (美国epitomics公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗 (美国santa cruz)，β肌动蛋白 (β-actin) 小鼠单克隆抗体、总蛋白提取试剂盒、钠盐 (BCA) 蛋白定量试剂盒、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 (北京博奥森)，TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒 (达科为生物科技有限公司)。

1.3 PM_2.5的收集与制备

用Mini Vol PM_2.5便携式采样器和称重的47 mm玻璃纤维滤膜采集PM_2.5样品。雾霾天气时，在武汉市工业区每天24 h采样，采样流量为6~8 L/min。将采样后的滤膜剪成1 cm×1 cm大小，浸泡在去离子水中。超声震荡20 min后，用多层纱布过滤震荡液。将过滤液在1 000 r/min，4℃的条件下离心，收集底层的颗粒物，真空冷冻干燥，-20℃保存。染毒前用生理盐水配制成所需的PM_2.5混悬液，浓度为10 mg/mL。

1.4 实验药物的制备

杏苏散、桑杏汤均按原方配制，所用中药均购自湖北省中医院门诊药房。药液制备方法：取1剂药物加3倍纯净水浸泡1 h后，微火煎至100 mL，煎3次后将所有药液混合，过滤后取药液，恒温水浴浓缩至100 mL，杏苏散及桑杏汤的生药量分别为0.72和0.255 g/mL。

1.5 动物模型的建立与处理

1.5.1 动物分组

32只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、PM_2.5组、杏苏散组、桑杏汤组，每组8只，分别饲养于4个染毒气候箱中，每天5 h，其他时间常规饲养。

1.5.2 染毒箱气候参数

染毒气候箱主要用于模拟秋季气候特征。根据武汉市气象学数据，平均气温15℃，相对湿度 (70±2)%为秋季的常温常湿气候，将其作为空白对照组的染毒箱气候参数。

根据近几年武汉地区秋季雾霾天气的气候特点，参照丁建中等^[2]研究结果将染毒箱气候参数设置为：气温 (8±2)℃，相对湿度 (33±2)%，风速定为2.5 m/s，以模拟秋季雾霾天气的气候特征。各组染毒箱“温度—相对湿度—风速”处理条件见表 1。

1.5.3 动物染毒方式

PM_2.5组、杏苏散、桑杏汤组分别于造模第1、8、15和22 d，经气管滴注10 mg/kg ·bw PM_2.5颗粒物混悬液，空白对照组于实验第1、8、15和22 d，经气管滴注等容积的生理盐水。

1.5.4 给药方法

参照前期研究进行造模^[1]，造模成功后，对4组实验大鼠进行实验处理：杏苏散组从实验第1 d起，根据临床成人服用剂量换算后，按9 g/kg ·bw生药量给予大鼠杏苏散药液灌胃处理，每日8：00灌胃1次，连用4周。桑杏汤组从实验第1 d起，根据临床成人服用剂量换算后，按3 g/kg ·bw生药量给予大鼠桑杏汤药液灌胃处理，每日8：00灌胃1次，连用4周。空白对照组、PM_2.5组从实验第1 d起，灌以等容积的生理盐水，每天8：00灌胃1次，连续灌服4周。

1.5.5 指标检测

4周后处死4组动物，收集左侧肺和一定量的肺泡灌洗液，分离大鼠肺组织，收集并提取总蛋白。采用Western blot方法检测HMGB1，计算相对表达量，以HMGB1/β-actin比值作为相对表达水平，ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-6。

1.6 统计分析方法

实验数据用Mean±SD表示，采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析。对各组实验数据先采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，Levene法进行方差齐性检验，若符合正态性和方差齐性，则采用ANOVA对多组数据进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验。若数据不满足正态性或方差齐性，进行数据变换后，行多组方差检验及组间LSD-t检验。若数据变换后仍不满足正态性或方差齐性，则多组比较行Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较行Nemenyi-Wilcoxon-Wilcox秩和检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

杏苏散组、桑杏汤组大鼠HMGB1表达水平显著低于PM_2.5组 (表 2)，比较差异具有统计学意义 (P < 0.05)，与空白对照组比较差异无统计学意义 (P > 0.05)；杏苏散组、桑杏汤组大鼠TNF-α表达水平均与空白对照组TNF-α表达水平较为接近，且均低于PM_2.5组，比较差异具有统计学意义 (P < 0.05；表 3)；杏苏散组、桑杏汤组IL-6表达水平与PM_2.5组比较差异均具有统计学意义 (P < 0.05)，与空白对照组比较差异无统计学意义 (P > 0.05；表 4)。上述研究结果提示杏苏散、桑杏汤组可降低Wistar大鼠肺损伤组织中HMGB1、TNF-α、IL-6的表达水平。

3 讨论

雾霾所含的PM_2.5当量直径小，物质成分复杂，形状不规则，富集效应强，比表面积大，极易通过呼吸途径到达终末细支气管和肺泡^[3]。大气颗粒物PM_2.5可引起实验性中毒大鼠呼吸系统显著的免疫损伤，损伤涉及特异性免疫、非特异性免疫及免疫细胞因子^[4]。高迁移率蛋白 (HMGB1) 是哺乳动物细胞核内的非组蛋白，HMGB1与晚期糖基化终末产物受体 (receptor of advanced glycationend-product，RAGE) 结合后，可激活固有免疫及获得性免疫系统^[5]。IL-6是急性炎症反应的主要标志之一，具有调节免疫应答，参与机体炎症反应和抗感染防御作用。TNF-α是炎症反应中重要的启动因子，可调节IL-6释放，导致肺组织损伤。

雾霾进入人体，能激活非特异性免疫及特异性免疫系统，免疫系统的激活与肺的卫外功能失调密切相关。HMGB1、IL-6、TNF-α等炎症因子可作用于肺泡毛细血管，使其通透性发生障碍，终致肺主气司呼吸、通调水道功能失常。炎性因子不能速去，可以通过各种信号转导途径，使炎症反应逐级放大和加剧，导致气道结构和功能发生改变，以致雾霾伤肺情况进一步加重，出现咽干鼻燥，干咳痰粘，咯吐不爽，甚则痰中带血，气逆而喘，胸满胁痛等症状。前期的研究结果表明^[1]，不同的PM_2.5浓度对大鼠肺组织中炎症因子HMGB1、IL-6、TNF-α的表达均有显著影响，且存在着一定的剂量—效应关系。

杏苏散、桑杏汤为中医治疗秋燥的经典名方，其中杏苏散轻宣凉燥、理肺化痰，用于治疗外感凉燥症；桑杏汤清宣温燥，润肺止咳，用于治疗外感温燥症。本实验模拟秋季PM_2.5气候环境，结合气管滴注PM_2.5混悬液，制作雾霾伤肺动物模型，并选用杏苏散、桑杏汤对模型动物肺损伤组织炎症因子进行干预。结果表明，杏苏散组、桑杏汤组与PM_2.5组比较，差异均具有统计学意义 (P < 0.05)，两组与空白对照组比较，差异均无统计学意义 (P > 0.05)。提示杏苏散、桑杏汤均可以降低Wistar大鼠肺损伤组织中HMGB1、TNF-α、IL-6的表达水平，抑制Wistar大鼠肺损伤组织中的炎症反应，对肺脏具有显著的保护作用。从3种指标表达水平来看，杏苏散、桑杏汤与空白对照组均较为接近。表明杏苏散及桑杏汤有望成为中医防治雾霾伤肺的有效方剂，但其具体的作用机制有待我们在后期的实验中进一步研究。本实验仅以秋季雾霾伤肺的中医药防治作为研究重点，其他季节雾霾致病的特征以及防治有待在今后的研究中逐步开展。