随着我国工业化和城市化进程的不断加快，雾霾天气日益严重，不仅影响了生态环境，也对人类健康造成了很大的伤害。据报道，2014年1月我国74个城市空气质量超标天数比例为62.4%，中度以上污染的比例为35.6%。其中，以污染物PM2.5的超标天数最多，约为92.0%。中国社会科学院与中国气象局联合发布的《气候变化绿皮书：应对气候变化报告》指出，雾霾天气可加剧慢性病症的发展，提高死亡率，导致呼吸系统疾病恶化等。雾霾的主要成分是PM2.5，其当量直径小，包含的物质成份复杂，形状不规则，有强烈的富集作用，比表面积大，容易由呼吸途径到达终末细支气管和肺泡[1]。PM2.5作为雾霾天气的主要控制指标，可影响肺部的气体交换，导致或诱发肺炎、哮喘、支气管炎等疾病。为探索雾霾伤肺的分子机制，寻求雾霾伤肺的生物学指标，为进一步探求中医防治雾霾伤肺的有效方药提供客观依据，本实验采集武汉市区大气中的PM2.5，将其调制成不同质量浓度的生理盐水颗粒物混悬液分别作用于Wistar大鼠，研究不同质量浓度PM2.5对Wistar大鼠肺组织中HMGB1、TNF-α和IL-6表达的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级健康雄性Wistar大鼠40只，体重为200~250g(武汉大学实验动物中心提供)。购买后在SPF级动物房适应性饲养7 d，维持温度(15±2)℃、湿度70%±2%，昼夜节律交替的时间为12 h。
1.2 试剂与仪器Mini Vol PM2.5便携式PM2.5采样器、47 mm玻璃纤维滤膜(美国Air Metrics公司)，Alpha2-4型冷冻干燥机(德国Christ公司)，染毒箱由LRH-250人工智能气候箱(广东医疗器械厂)改良成人工智能气候染毒箱，HMGB1兔单克隆抗体(美国epitomics公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(美国santa cruz)，β肌动蛋白(β-actin)小鼠单克隆抗体、总蛋白提取试剂盒、钠盐(BCA)蛋白定量试剂盒、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(北京博奥森)，TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(达科为生物科技有限公司)。
1.3 PM2.5的收集与制备总悬浮颗粒物(total suspended particulates，TSP)用Mini Vol PM2.5便携式采样器和称重的47 mm玻璃纤维滤膜采样。依据武汉市环保局公布的空气质量指数及PM2.5监测数据，选择PM2.5严重超标，空气质量指数达到五级及五级以上的雾霾天气，在武汉市工业区每日24 h采样，采样流量为6~8 L/min，采样3 d。将采样滤膜剪成1 cm × 1 cm大小，浸泡在去离子水中，超声震荡20 min后，用多层纱布过滤震荡液。将过滤液在1 000 r/min，4℃条件下离心，收集底层的颗粒物，真空冷冻干燥，-20℃保存。染毒前用生理盐水配制成所需的PM2.5混悬液质量浓度，低、中、高浓度分别为1、3、10 mg/mL。
1.4 动物模型的建立与处理40只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为空白组、生理盐水组、PM2.5低、中、高浓度组，每组8只。动物造模采用人工智能气候染毒箱，控制温度为(15±2)℃、湿度为33%±2%、风速为(1.0±0.3) m/s。PM2.5低、中、高浓度组分别于实验第1、8、15、21 d经气管滴注1、3、10 mg/mL PM2.5混悬液，气管每次滴注量为2 mL/kg BW，空白组不做任何处理，生理盐水组气管滴注等容积的生理盐水。4周后处死动物，收集左侧肺和一定量的肺泡灌洗液，分离大鼠肺组织，收集并提取总蛋白。采用Western blot方法检测HMGB1，计算相对表达量，以HMGB1/β-actin比值作为相对表达水平，ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-6。
1.5 统计分析方法实验数据用x±s表示，数据处理采用SPSS 19.0统计软件进行分析。对各组实验数据先采用Shapiro-Wilk法及Levene法进行正态性检验和方差齐性检验，若符合正态性和方差齐性，则采用ANOVA对多组数据进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验。若数据不满足正态性或方差齐性，则多组比较行Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较行Nemenyi-Wilcoxon-Wilcox秩和检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果本次研究结果表明：空白组与生理盐水组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。PM2.5低、中、高浓度组与空白组和生理盐水组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示不同浓度PM2.5对Wistar大鼠肺组织中HMGB1、TNF-α、IL-6的表达均有影响。
在HMGB1的表达方面，方差分析F=148.395，P＜0.01；进一步经LSD-t检验，PM2.5低、中浓度组组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；PM2.5低、中浓度组与PM2.5高浓度组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05；表 1)。
| 组别 | n(只) | HMGB1/β-actin |
| 空白组 | 8 | 0.542±0.123 |
| 生理盐水组 | 8 | 0.548±0.142 |
| PM2.5低浓度组 | 8 | 1.299±0.208* |
| PM 2.5中浓度组 | 8 | 1.498±0.241*△ |
| PM2.5高浓度组 | 8 | 2.763±0.295*◆ |
| 注：*与正常组和对照组比较，P＜0.01；△与PM2.5低浓度组比较，P＞0.05；◆与PM2.5低、中浓度组间比较，P＜0.05 | ||
在TNF-α表达方面，方差分析F=148.395，P＜0.01；进一步经LSD-t检验，PM2.5低、中浓度组组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；PM2.5低、中浓度组与PM2.5高浓度组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05；表 2)。
| 组别 | n(只) | TNF-α |
| 空白组 | 8 | 216.57±21.55 |
| 生理盐水组 | 8 | 217.70±21.12 |
| PM2.5低浓度组 | 8 | 264.65±29.61* |
| PM2.5中浓度组 | 8 | 297.07±45.25*△ |
| PM2.5高浓度组 | 8 | 335.34±44.70*△□ |
| 注：*与正常组和对照组比较，P＜0.01；△与PM2.5低浓度组比较，P＞0.05；□与PM2.5低、中浓度组比较，P＜0.05 | ||
在IL-6表达方面，方差分析F=148.395，P＜0.01；进一步经LSD-t检验，PM2.5中、高浓度两组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，PM2.5中、高浓度组与PM2.5低浓度组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05；表 3)。
| 组别 | n(只) | IL-6 |
| 空白组 | 8 | 91.57±16.34 |
| 生理盐水组 | 8 | 92.12±13.78 |
| PM 2.5低浓度组 | 8 | 116.65±21.61* |
| PM 2.5中浓度组 | 8 | 140.32±29.73*▽ |
| PM2.5高浓度组 | 8 | 142.34±22.63*▽# |
| 注：*与正常组和对照组比较P＜0.05；▽与PM2.5低浓度组比较，P＜0.05；#与PM2.5中浓度组比较P＞0.05 | ||
3 讨论
PM2.5是指空气动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物，它可进入肺泡，对人体的健康影响最大[2]。PM2.5首先作用的器官是肺，PM2.5被人体吸入后，可以直接到达肺泡内部，在支气管、肺部及其间质中沉积，难以排出体外。PM2.5进入人体，可引起气道上皮发生炎症反应，产生多种炎症物质(HMGBl、TNF-α、IL-6等)，作用于肺泡毛细血管，使其通透性发生障碍, 并通过各种信号转导途径，使炎症反应逐级放大和加剧，导致气道结构和功能发生改变，从而产生更为严重的肺脏损伤。
HMGB1通常存在于哺乳动物细胞核内, 属于核内的非组蛋白, 可与早期炎症因子相互作用形成正反馈。其途径有：① 受损细胞或坏死细胞释放的HMGB1激活单核/巨噬细胞，导致NF-KB核移位，引起促炎递质释放；② 活化的单核/巨噬细胞释放HMGB1，HMGB1结合晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycationend-product, RAGE)促使NF-KB活化，使得促炎递质释放。释放的促炎递质又可使活化的单核/巨噬细胞释放HMGB1，促进TNF-a，IL-6等促炎性细胞因子等的释放，从而形成正反馈[3]。近年来，科研人员开始关注HMGB1与呼吸系统疾病的关系，已证实HMGB1与机械通气相关性肺损伤、非小细胞肺癌、肺纤维化等疾病密切相关[4-6]。本次研究结果表明：在染毒大鼠肺组织HMGB1的表达影响方面，PM2.5低、中、高浓度组与正常组和对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)；PM2.5浓度低、中两组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；PM2.5低、中浓度组与PM2.5高浓度组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。PM2.5亚急性染毒大鼠时，随着PM2.5浓度的增加，大鼠肺组织中HMGB1含量随之增加，且存在剂量—效应反应关系，提示HMGB1与雾霾伤肺有着极其紧密的联系，HMGB1参与了雾霾致肺组织损伤的发生与发展过程。
TNF-α、IL-6都是由单核巨噬细胞、自然杀伤细胞等分泌的细胞因子，是介导炎症反应的重要介质。TNF-α是炎症中重要的启动因子，并能调节IL-1，IL-6等其它细胞炎症因子的释放，导致组织损伤。IL-6是急性炎症反应的主要标志之一，也是一种多细胞来源并具有复杂生物学功能的细胞因子，具有调节免疫应答、参与机体炎症反应和抗感染的作用。TNF-α可以促进IL-6的产生，其原因主要是在IL-6基因的增强启动区域内含有对TNF-α的功能反应成分。研究表明，巨噬细胞吞噬进入肺内的细颗粒物后，会释放出一系列细胞因子和前炎症因子(TNF-α、NF-KB等)。前炎症因子和肺内沉积的颗粒物进一步作用于肺上皮细胞、内皮细胞、成纤维母细胞，使其分泌黏附分子及细胞因子(如IL-6、IL-8等)，这些黏附分子和细胞因子使各种免疫细胞(如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等)聚集，从而引起炎症发生[7]。从表 2、表 3研究结果可以看出，PM2.5低、中、高浓度组与正常组和对照组比较，在染毒大鼠TNF-α、IL-6表达水平的影响方面，差异均有统计学意义(P＜0.01)，且随着PM2.5浓度的增加，大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6表达水平有明显的上升趋势，提示雾霾天气时，大鼠肺组织可产生炎性刺激效应。
本次实验结果表明，不同的PM2.5浓度对大鼠肺组织中炎症因子HMGB1、IL-6、TNF-α的表达均有显著影响，且存在着一定的剂量—效应反应关系，HMGB1、IL-6、TNF-α可以作为雾霾致大鼠肺损伤的生物学指标，但其具体的信号转导机制尚未完全明确，有待我们在后期的研究中进一步阐明。
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