2. 上海市静安区疾病预防控制中心
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烷基酚聚氧乙烯醚(alkylphenol ethoxylates，APEOs)作为非离子表面活性剂广泛地应用于工业和日常生活。该类表面活性剂本身除了表面活性剂外其他毒性很小，但它在环境中的降解物—烷基酚(AP，主要包括壬基酚NP和辛基酚OP)、短链烷基酚聚氧乙烯醚(主要包括壬基酚一氧乙烯醚NP1EO、壬基酚二氧乙烯醚NP2EO、辛基酚一氧乙烯醚OP1EO和辛基酚二氧乙烯醚OP2EO)和烷基酚聚乙氧基羧酸(NPECs)等，均具有潜在的内分泌干扰作用[1-2]。另外，与母体相比，这些降解物特别是烷基酚还具有亲脂性高、降解难、毒性大、持久地存在于环境中等特点。对于水生生物，AP比APEO具有更大的毒性[2]。AP除了是APEOs的降解物外，也同另外一个内分泌干扰物(EDCs)——双酚A(BPA)一样，属于塑料工业的重要原料之一。BPA及其APEOs的降解物主要通过水体进入环境，人体通过饮用暴露该类EDCs的饮用水，会对人体健康构成潜在威胁[2-4]。因此，建立一种高效的检测方法，并运用此方法对环境中该类物质进行监测显得尤为重要。
目前，有关该类化合物检测的标准方法包括美国国际材料试验协会(ASTM)《环境水中壬基苯酚、双酚A、对特辛基苯酚、壬基苯酚一乙氧醚和壬基苯酚二乙氧醚的气相色谱质谱测定标准方法》(D 7065-06) [5]和《水质—测定选定的烷基酚第2部分：气相色谱质谱联用法测定经固态萃取和衍生化后无过滤样本中的烷基苯酚、烷基苯酚乙氧基化物和双酚A》(ISO 18857-2: 2009)[6]。D 7065-06方法采用液液萃取和GC-MS检测，检测限为0.9~1.8 μg/L，主要用于工业废水的监测。ISO 18857-2: 2009方法采用固相萃取和衍生化处理后GC-MS检测，检测限为5~50 ng/L，但该方法仍然不能满足于饮用水中平均浓度水平低于10 ng/L分析物(4-n-OP、OP1EO和OP2EO)的检测，以及实验室本底污染物(主要是烷基酚类及双酚A)的干扰消除，本研究采用微液液萃取(micro-LLE)和硅烷化[N, O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，BSTFA]处理，然后采用GC-MS进行检测分析。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂GC-MS(岛津QP-2010)，配有自动进样器(岛津AOC-20i)和GC-MS控制和数据分析软件GCMS solution (2.50 SU3版本)；氮吹浓缩仪(PIERCE Reacti-Therm Ⅲ)和烘箱(Heraeus)。
标准品包括壬基酚(NP)、4-壬基酚一氧乙烯醚(NP1EO)、4-壬基酚二氧乙烯醚(NP2EO)、4-n-辛基酚(OP)、4-辛基酚一氧乙烯醚(OP1EO)、4-辛基酚二氧乙烯醚(OP2EO)和双酚A(BPA)，均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH；内标包括4-壬基酚(4-NP)、4-壬基酚一氧乙烯醚(NP1EO)购自百灵威(AccuStandard, Inc.)；标准品和内标的纯度均不低于99.5%。衍生化试剂(BSTFATMCS=99 :1) 购自Supelco。有机溶剂包括正己烷、二氯甲烷(DCM)和丙酮均为农残级，购自Merck和Tedia；用于样品提取的DCM需要重蒸处理。浓盐酸(HCl，36%~38%优级纯)和氯化钠(NaCl，分析纯)分别购自上海实验试剂有限公司和上海凌峰化学试剂有限公司。NaCl在使用前要用先经重蒸的二氯甲烷(DCM)浸洗(体积比为1 :2)，然后放入马弗炉在450℃烘焙5 h。
1.2 样品前处理 1.2.1 微液液萃取取未加硫酸保存的新鲜水样品10.0 mL，加入6.0 mol/L的HCl溶液调节水样，使pH值小于2，然后加入NaCl 3 g，震荡溶解后加入DCM 6.0 mL，震荡摇匀，静置分层，收集有机相。重复以上萃取步骤一次，合并DCM于40 mL玻璃瓶。用氮吹浓缩仪(40℃加热)将萃取液浓缩至小于2 mL，转移至棕色进样瓶中，继续用N2吹至近干。
1.2.2 衍生化处理在加入50.0 μL衍生化试剂BSTFA后，超声波处理10 s后置于70℃烘箱中衍生60 min。衍生化完毕冷却至室温后，加入正己烷定容至100 μL。按照1.3.1进行GC-MS分析。
1.2.3 标准曲线的制作分别称取适量的标准品，用丙酮溶解，定容为10 μg/mL的单标储备液。然后通过逐步稀释配制成进样浓度范围从10~200 μg/mL的标准点(内标浓度为50 μg/L)。按照1.2和1.3.1进行衍生化和仪器分析。数据处理采用GC-MS软件进行定性和内标法定量。
1.3 实验方法色谱柱为DB-5 MS(30 m×0.25 mm I.D.，膜厚0.25 μm)，进样量1 μL，采用不分流进样；载气为He气(99.999%)，其总流量和柱流量分别为50.0 mL/min和1.2 mL/min；柱温采用程序升温，初始温度为65℃，维持2 min后，以14℃/min的速度升温到160℃，然后以5℃/min的速度升温到240℃，接着以10℃/min的速度升温到290℃，最后在该温度下维持10 min；接口和离子源温度分别为280℃和220℃；溶剂延迟时间为4.5 min；扫描方式为单离子检测模式(SIM)，SIM检测参数见表 1，标准图谱见图 1。
| 名称 | 扫描时间(min) | 定量离子(m/z) | 参考离子Ⅰ(m/z) | 参考离子Ⅱ(m/z) |
| NP | 13.81~15.43 | 221 | 207 | 263 |
| 4-n-OP | 15.43~16.97 | 278 | 263 | 179 |
| n-NP | 16.97~17.90 | 179 | 73 | 292 |
| OP1EO | 17.90~19.00 | 251 | 252 | 322 |
| NP1EO | 19.00~20.83 | 251 | 252 | 336 |
| BPA | 22.55~22.93 | 357 | 358 | 372 |
| n-NP1EO | 23.93~23.55 | 336 | 179 | 292 |
| OP2EO | 22.93~23.55 | 295 | 296 | 366 |
| NP2EO | 23.55~28.00 | 295 | 296 | 309 |
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| 图 1 BPA和APEOs降解物标准谱图(200 μg/L) |
1.4 统计学方法
正交试验的数据采用SPSS 16.0(美国SPSS公司)进行了极差分析和方差分析, 其他数据均采用Excel 2007(美国微软公司)统计计算。
2 结果与讨论 2.1 质谱特征分析烷基酚(AP)、APnEO(n=1~2) 和BPA的硅烷化产物EI电离后会形成强度较小的奇电子分子离子M·+，通过其烷基链断裂形成一个偶电子离子系列，APnEO(n=1~2) 的基峰为3 C烷基链的偶电子离子，如NP1EO和OP1EO的m/z 251以及NP2EO和OP2EO的m/z 295；BPA烷基链失去一个甲基形成偶电子离子基峰m/z 357。偶电子离子稳定性和强度一般随着断裂烷基链长度的增大而增强，如NP所形成的碎片离子的强度顺序为m/z 207(-C6H13)大于m/z 221(-C5H11)大于m/z 263(-C2H5)(图 2)。
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| 图 2 NP的质谱图及其解析 |
2.2 样品前处理优化
在micro-LLE中，样品酸化pH值小于2和加入NaCl 3 g分别能使分析物分子化和样品基质离子化。在该条件下，实验发现100 ng/L加标水样的前两次提取6 mL DCM回收率分别为80%和5%以上，而第3次提取小于5%，所以本方法液液提取的次数确定为2次。另外所使用的DCM要进行重蒸，NaCl要进行溶剂洗涤后高温烘烤处理，特别是在测定NP时，经过处理后DCM和NaCl中的残留NP分别降低8倍和180倍，满足本方法检测限(MDL)的要求。
在样品衍生优化条件研究中，分别对衍生温度25、70和90℃、衍生时间1、2和4 h和衍生化溶剂无辅助溶剂、乙酸乙酯、丙酮进行L18 2×34正交试验，所得数据采用SPSS 16.0软件进行极差分析和方差分析，其分析结果显示除NP(衍生时间大于衍生化溶剂大于衍生温度)外，其他化合物的影响因素次序为衍生化溶剂大于衍生时间大于衍生温度(表 2)。综合各分析物的最佳条件为：在无辅助溶解下70℃衍生化1 h。
| 分析物 | 最佳衍生条件 | 分析物 | 最佳衍生条件 |
| NP | 1 h，丙酮，25℃ | BPA | 无辅助溶剂，1 h，70℃ |
| 4-n-OP | 无辅助溶剂，1 h，70℃ | OP2EO | 无辅助溶剂，1 h，70℃ |
| OP1EO | 无辅助溶剂，1 h，70℃ | NP2EO | 无辅助溶剂，1 h，25℃ |
| NP1EO | 无辅助溶剂，1 h，25℃ | / | / |
2.3 方法检测限(MDL)
根据仪器信噪比(S/N)进行2组空白水样的平行加标测试(n=7)，然后进行样品前处理和GC-MS分析，计算标准偏差(SA和SB)，对2次标准偏差进行F分布计算检验MDL的合理性，若F大于F0.95(6，6)=4.28，则需重新执行MDL测定，直至F小于3.05；反之，计算共同标准偏差(Pooled standard deviation，Spooled)：
| $ {S_{pooled}} = {\left[{\frac{{6S_A^2 + 6S_B^2}}{{12}}} \right]^{\frac{{\rm{1}}}{{\rm{2}}}}} $ | (1) |
按下述公式计算MDL值：
| $ {\rm{MDL = 2}}{\rm{.681}} \times {{\rm{S}}_{{\rm{pooled}}}} $ | (2) |
式中：t(12，1-α=0.99)=2.681
表 3中列出了两次加标的MDL测定SA、SB及F值，各F值均小于F0.95(6，6)=4.28，表示该MDL合理可靠。另外该方法的各个分析物的MDL均低于10 ng/L，能满足饮用水中烷基酚聚氧乙烯醚降解物的痕量检测要求。
| 目标分析物 | 第一次测定标准偏差 | 第二次测定标准偏差 | F值 | MDL(ng/L) |
| NP | 1.9825 | 1.8796 | 1.1125 | 5.18 |
| 4-n-OP | 1.1908 | 1.2103 | 1.0331 | 3.22 |
| OP1EO | 0.5342 | 0.5037 | 1.1244 | 1.39 |
| NP1EO | 1.7860 | 2.0342 | 1.2973 | 5.13 |
| BPA | 0.8769 | 1.1916 | 1.8467 | 2.80 |
| OP2EO | 0.6489 | 0.5807 | 1.2487 | 1.65 |
| NP2EO | 2.2105 | 1.7469 | 1.6012 | 5.34 |
2.4 准确度、精密度、重现性和方法不确定度
对水样进行高低浓度(20 ng/L和100 ng/L)加标，每个浓度5个平行样，连续测定5 d。表 4是连续5 d的准确度和精密度实验结果，从表中可以看出目标分析物的回收率在76%~106%之间，相对标准偏差(RSD)均小于等于10%，表明该方法准确度和稳定性较好。另外方法的日间平均回收率为85%~102%，RSD小于6%，表明该方法具有很好的重现性。
| 名称 | 浓度水平 | 日內回收率/RSD(%) | 日间回收率/RSD(%) | ||||
| 第1 d | 第2 d | 第3 d | 第4 d | 第5 d | |||
| NP | 低 | 76/5 | 88/10 | 83/6 | 89/2 | 90/4 | 85/6 |
| 高 | 91/4 | 98/2 | 95/4 | 95/2 | 98/3 | 95/3 | |
| 4-n-OP | 低 | 90/2 | 106/2 | 99/6 | 103/3 | 100/1 | 99/5 |
| 高 | 79/1 | 95/2 | 92/4 | 91/1 | 91/1 | 90/6 | |
| OP1EO | 低 | 95/6 | 103/10 | 95/1 | 95/4 | 94/7 | 96/3 |
| 高 | 106/4 | 98/5 | 94/7 | 97/3 | 93/4 | 97/5 | |
| NP1EO | 低 | 80/9 | 85/13 | 91/9 | 82/3 | 81/6 | 84/5 |
| 高 | 97/2 | 94/5 | 94/5 | 90/2 | 88/2 | 92/4 | |
| BPA | 低 | 90/4 | 95/5 | 87/6 | 88/3 | 88/7 | 90/3 |
| 高 | 92/3 | 86/4 | 96/4 | 90/2 | 94/4 | 92/4 | |
| OP2EO | 低 | 103/6 | 106/5 | 104/2 | 101/3 | 97/2 | 102/3 |
| 高 | 104/3 | 100/5 | 101/5 | 103/1 | 101/2 | 102/1 | |
| NP2EO | 低 | 94/3 | 94/7 | 98/7 | 94/2 | 96/3 | 95/2 |
| 高 | 99/2 | 100/6 | 103/3 | 97/1 | 100/4 | 100/2 | |
参照标准《化学分析测量不确定度评定》(JJF 1335-2005)[7]，采用本方法对20 ng/L的加标样品进行测定，计算各个分析物的合成标准不确定度(表 5)，各个化合物不确定度小于2.7 ng/L。
| 名称 | 合成不确定度Ucrel | 扩展不确定度 U=K×Ucrel(K=2) |
测量值W0(ng/L) | 合成标准不确定度 Uc=W0×U (ng/L) |
| NP | 0.06675 | 0.13 | 20.17 | 2.69 |
| 4-n-OP | 0.04360 | 0.09 | 19.73 | 1.72 |
| OP1EO | 0.04705 | 0.09 | 22.12 | 2.08 |
| NP1EO | 0.05447 | 0.11 | 22.10 | 2.41 |
| BPA | 0.06299 | 0.13 | 20.68 | 2.60 |
| OP2EO | 0.02502 | 0.05 | 21.28 | 1.07 |
| NP2EO | 0.03498 | 0.07 | 23.63 | 1.65 |
| 注：合成标准不确定度Uc=W0×U，W0为测量值，U为扩展不确定度，其中U=K×Ucrel(K=2)，Ucrel为合成不确定度 | ||||
2.5 实际样品检测
采用本方法对4家水厂的水源水和出厂水中烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)降解物(NP、OP、NP1EO、NP2EO、OP1EO和OP2EO)和双酚A(BPA)等进行为期2个月的监测(图 3)。水源水中OP、OP1EO和OP2EO均小于10 ng/L，NP、NP1EO、NP2EO和BPA绝大部分位于20~50 ng/L水平，另外前后两个月数据稳定，主要由于采样的两个月均为枯水期。同时在出厂水中，所监测的烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)降解物和双酚A均有不同程度的下降，其中次月份中NP、OP1EO、NP1EO、BPA、OP2EO和NP2EO几个分析物的平均去除率分别为38%、62%、64%、72%、51%和25%。
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| 图 3 2个月水样检测结果的比较 |
目前国内对APEOs的系列代谢物研究还不全面，检测对象主要集中于广泛存在于自然水体且已证实对人类具有危害的NP等，如有研究嘉陵江和长江重庆段水体中NP浓度范围为0.02~6.85 μg/L，浓度在丰水期高于平水期[8]；沈阳市自来水中N P和BPA的浓度范围分别为212.1~2791.6 ng/L和14.7~161.0 ng/L[9]。与这些数据比较，本次监测的自来水中EDCs的浓度明显要低，污染水平与日本相近，高于欧美一些发达国家，如德国的Schleswig Holstein自来水中NP的浓度为1~2 ng/L[10]。
3 结论本方法采用微液液萃取(micro-LLE)、衍生化处理和GC-MS分离检测，建立一种水中APEOa环境降解物(NP、OP、NP1EO、NP2EO、OP1EO和OP2EO)和BPA的痕量检测方法。该方法在检测水平上低于国际标准方法(ASTM D 7065-06和ISO 18857-2: 2009)，能满足正常饮用水中该类EDCs的检测；在方法学的验证上能满足国际、国内标准定性和定量的要求。该方法在相关饮用水监测中予以应用，EDCs检出率为100%，各个分析物的浓度水平为0.5~90 ng/L。该方法还具有操作简单和成本较低等特点，适合在常规实验室条件下进行该类EDCs的分析要求。
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