2. 天津医学大学公共卫生学院;
3. 华中科技大学同济医学院公共卫生学院
我国是地方性氟中毒危害最严重的国家之一，过量氟除损伤骨骼、牙齿等骨相系统外，同时还伴随着对泌尿系统、神经系统、消化系统、生殖系统、内分泌系统等非骨相系统的损害[1-2]。过量氟对甲状腺的影响一直存在着争议，相关流行病学调查及动物实验研究结果也不一致，且氟对甲状腺影响机制尚不明确[3-4]。为此，本实验选用大鼠为研究对象，模拟人群的暴露方式，通过饮水途径复制慢性氟中毒动物模型，探讨不同染毒时间、不同剂量氟化钠(NaF)对甲状腺形态及功能的影响。
1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂5804R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；Ckx41型倒置显微镜(日本Olympus公司)；γ计数器(上海上立检测仪器厂)；NaF(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；甲状腺激素放射免疫检测试剂盒(中国北方生物技术研究所)。
1.2 动物分组及处理选择断乳1个月体重110 ~ 130 g的SPF级Wistar大鼠120只，由湖北省实验动物研究中心提供，动物许可证号为SCXK(鄂)2008-0005，雌雄各半。动物饲养室温度为22 ~ 24℃，相对湿度为40% ~ 60%。实验期间，大鼠自由摄食、饮水。适应性饲养1周后随机分为4组，分别为：对照组、低氟组、中氟组和高氟组，每组30只，雌雄各半。对照组饮用自来水(氟离子浓度为0.344 mg/L)，氟染毒组分别饮用含NaF浓度为5、10、20 mg/L的自来水。分别在染毒2、4、8个月末，每组随机抽取10只大鼠(雌雄各5只)，称重后处死。
1.3 标本的采集与处理眼球取血，1 000 g/min离心15 min，分离血清后于-20℃冰箱中保存，用于甲状腺激素的测定。分离甲状腺，生理盐水冲洗、滤纸吸干后称重，然后将甲状腺置于4%的多聚甲醛中固定，计算甲状腺脏器系数(甲状腺重量/大鼠体重×100%)。
1.4 甲状腺组织形态学观察固定于多聚甲醛中的甲状腺常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片，HE染色后于光学显微镜下观察甲状腺组织形态。
1.5 血清中甲状腺激素的测定采用放射免疫法测定血清中促甲状腺激素(TSH)、总四碘甲腺原氨酸(TT4)、游离四碘甲腺原氨酸(FT4)、总三碘甲腺原氨酸(TT3)和游离三碘甲腺原氨酸(FT3)水平。
1.6 数据统计与分析采用SPSS 16.0统计软件处理数据，所有实验数据均以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步多重比较采用LSD法检验，以P小于0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NaF对大鼠甲状腺重量及脏器系数的影响表 1结果显示，不同时间点各剂量染毒组大鼠甲状腺重量及脏器系数与对照组比较未见显著性差异(P大于0.05)，不同剂量染毒组间大鼠甲状腺重量及脏器系数亦未见显著性差异(P大于0.05)。
| NaF (mg/L) |
甲状腺重量(mg) | 甲状腺脏器系数(mg/100 g) | |||||
| 2月 | 4月 | 8月 | 2月 | 4月 | 8月 | ||
| 对照组 | 31.67±9.03 | 36.27±7.48 | 41.63±8.53 | 9.89±3.28 | 11.19±1.81 | 10.61±1.92 | |
| 5 | 30.00±7.84 | 32.60±5.20 | 42.56±10.78 | 9.71±1.17 | 9.59±2.03 | 9.73±2.07 | |
| 10 | 31.75±6.76 | 34.74±6.67 | 39.27±7.03 | 9.70±2.13 | 9.84±2.11 | 9.87±1.93 | |
| 20 | 31.70±7.70 | 30.63±6.89 | 39.64±8.49 | 9.50±1.62 | 9.98±2.86 | 9.51±1.51 | |
| F值 | 0.105 | 1.067 | 0.318 | 0.051 | 0.733 | 0.506 | |
| P值 | 0.957 | 0.380 | 0.812 | 0.985 | 0.540 | 0.681 | |
2.2 NaF对大鼠血清甲状腺激素水平的影响
染毒2个月末，各浓度染毒组大鼠TSH水平与对照组相比无明显变化(P大于0.05)；染毒4个月末，大鼠TSH水平呈降低趋势，且高氟组与对照组及低氟组比较差异有统计学意义(P小于0.05)；8月末，TSH随染毒剂量明显降低，中、高氟组与对照组及低氟组相比差异有统计学意义(P小于0.05，表 2)。氟染毒组大鼠血清中TT4和FT4水平在染毒2个月末较对照组明显升高，其中中氟组和高氟组大鼠TT4水平与对照组比较差异有统计学意义(P小于0.05)，低、中、高氟组FT4与对照组比较差异有统计学意义(P小于0.05)；8个月末，大鼠TT4和FT4水平有降低趋势，但与对照组比较差异不具有显著性(P大于0.05;表 3)。染毒过程中，染毒组大鼠TT3及FT3水平有降低趋势，但与对照组比较均无统计学意义(P大于0.05;表 4)。
| NaF(mg/L) | 2月 | 4月 | 8月 |
| 对照组 | 0.59±0.24 | 0.38±0.22e | 0.84±0.21i |
| 5 | 0.59±0.12 | 0.34±0.15f | 0.74±0.28j |
| 10 | 0.52±0.12 | 0.24±0.07 | 0.51±0.14k |
| 20 | 0.50±0.07 | 0.17±0.08h | 0.46±0.13l |
| F值 | 0.799 | 3.077 | 8.153 |
| P值 | 0.507 | 0.018 | ＜0.001 |
| 注：h与e比较，t等于2.988，P等于0.006；h与f比较，t等于2.715，P等于0.011；k与i比较，t等于3.628，P等于0.001；k与j比较，t等于2.552，P等于0.015；l与i比较，t等于4.223，P小于0.001；l与j比较，t等于3.152，P等于0.003 | |||
| NaF (mg/L) |
TT4 | FT4 | |||||
| 2月 | 4月 | 8月 | 2月 | 4月 | 8月 | ||
| 对照组 | 43.56±8.01a | 56.66±16.28 | 47.03±5.13 | 6.58±0.86m | 12.93±0.58 | 9.14±1.33 | |
| 5 | 49.89±10.04 | 57.93±13.63 | 47.79±6.91 | 8.39±1.70n | 11.17±1.70 | 8.27±1.79 | |
| 10 | 55.11±9.75c | 61.34±11.23 | 46.69±9.60 | 8.63±1.86o | 11.49±2.73 | 7.87±2.08 | |
| 20 | 55.08±9.83d | 70.23±6.38 | 42.78±13.78 | 8.67±1.22p | 11.82±2.98 | 7.75±2.83 | |
| F值 | 3.179 | 1.989 | 0.515 | 3.835 | 0.586 | 0.777 | |
| P值 | 0.037 | 0.136 | 0.675 | 0.018 | 0.630 | 0.515 | |
| 注：c与a比较，t等于2.588，P等于0.014；d与a比较，t等于2.665，P等于0.012；n与m比较，t等于2.520，P等于0.017；o与m比较，t等于2.914，P等于0.006；p与m比较，t等于2.975，P等于0.005 | |||||||
| NaF(mg/L) | TT3 | FT3 | |||||
| 2月 | 4月 | 8月 | 2月 | 4月 | 8月 | ||
| 对照组 | 0.61±0.17 | 0.85±0.14 | 0.82±0.22 | 2.13±0.60 | 2.18±0.61 | 2.94±0.69 | |
| 5 | 0.50±0.09 | 0.72±0.16 | 0.79±0.13 | 1.92±0.32 | 1.73±0.52 | 2.67±0.53 | |
| 10 | 0.62±0.13 | 0.79±0.23 | 0.77±0.22 | 2.44±0.70 | 2.00±0.37 | 2.62±0.71 | |
| 20 | 0.54±0.06 | 0.67±0.22 | 0.72±0.09 | 2.02±0.26 | 1.84±0.80 | 2.71±0.65 | |
| F值 | 1.566 | 1.088 | 0.527 | 1.315 | 0.758 | 0.412 | |
| P值 | 0.221 | 0.371 | 0.667 | 1.315 | 0.758 | 0.412 | |
2.3 NaF对甲状腺组织形态的影响
对照组大鼠甲状腺滤泡呈较均匀的中等大小，上皮细胞呈立方状，滤泡腔内胶质丰富，清晰均匀(图 1-a)；但氟染毒组大鼠甲状腺滤泡却出现多形性变化，既有部分滤泡增生活跃，滤泡腔变小，胶质减少，又有少数滤泡增大，滤泡腔内胶质充盈；随染毒时间的延长，甲状腺滤泡增生更加明显，滤泡腔变小，甚至出现无腔细胞团(图 1-b、1-d)，同时可见部分滤泡明显增大，出现融合大滤泡，滤泡上皮细胞明显扁平，滤泡腔内胶质蓄积(图 1-c、1-d)。
|
| a：对照组b：低氟组c：中氟组d：高氟组 图 1 NaF对甲状腺组织形态的影响(×200) |
3 讨论
氟是一种对机体非常重要的微量元素，对机体健康呈“U”型效应，过低或过高都会危害人体健康，而氟对甲状腺的损伤一直存在较大的争议。在现有的研究中，因实验周期、氟染毒剂量、动物种属等因素的不同，所得结论也不完全一致，且人群调查结果也不尽相同[5-8]。
在生理状况下，甲状腺受自身和下丘脑—腺垂体—甲状腺轴两种机制的调节。T4是甲状腺合成的主要激素，但其生物活性远低于T3，T3主要通过T4在外周组织经脱碘作用转化而来。T3和T4释放进入血液后以游离状态和结合状态两种形式存在，两者之间相互转化，维持动态平衡，且只有游离型的T3、T4才具有生物活性。刘国艳等[6]给予SD大鼠200 mg/L的NaF 150 d后发现血清中FT4水平降低、TSH水平增加；而Hosur等[9]在对氟斑牙患者的调查中却发现患者血清中FT3、FT4、TSH水平未发现明显变化。氟是TSH的类似物，氟过量极有可能对下丘脑—腺垂体—甲状腺轴造成损害，进而对TSH的合成及分泌造成影响[10-11]。本实验中各浓度氟染毒组大鼠血清中TSH水平在染毒2个月末无明显变化，但随着染毒时间的延长，中氟组及高氟组TSH水平明显降低。TT4及FT4水平在染毒2个月末明显增加，之后随染毒时间的延长有降低趋势，表明氟在染毒早期可以使甲状腺激素的分泌代偿性增加，这种兴奋效应随着染毒时间的延长转为抑制，可能与TSH水平在染毒后期降低有关。TT3及FT3水平并未随TT4及FT4的变化而变化，可能与氟对脱碘酶的抑制作用有关[11-12]。
甲状腺滤泡是甲状腺基本的结构和功能单位，滤泡的形态变化可作为甲状腺功能状态的形态学指标。本研究显示，染毒大鼠甲状腺重量及脏器系数未发生明显变化，但甲状腺组织形态却发生明显的变化，染毒2个月末即可见部分滤泡增生活跃，滤泡腔内胶质减少，说明甲状腺功能相对活跃，这与TT4水平在实验早期明显增加相吻合。随染毒时间的延长，氟染毒组小滤泡增生更加明显，甚至出现无腔细胞团，还可见融合巨滤泡，滤泡腔内胶质充盈，这些组织形态学改变说明氟化钠对甲状腺组织产生了损伤作用。
综上所述，长时间暴露于过量氟可损伤大鼠甲状腺，血清中甲状腺激素水平随染毒时间的变化，提示暴露时间可能在氟所导致的甲状腺功能异常中扮演着重要角色。氟对甲状腺毒性的作用机理比较复杂，目前还不是十分清楚，有研究表明氟化钠对甲状腺过氧化酶活性具有抑制作用[13]，氟还可通过损伤自由基代谢和抗氧化系统功能对甲状腺产生毒性[14]，氟对甲状腺影响的具体机制，还有待进一步研究。为克服现有实验研究中存在染毒剂量高、实验周期短的缺点，因而本研究尽量模拟人群氟暴露方式及暴露水平[15-16]，以较长的实验周期观察了过量氟对大鼠甲状腺的影响，为氟对人群甲状腺损害的研究提供了基础。
| [1] | Barbier O, Arreola-Mendoza L, Del RL. Molecular mechanisms of fluoride toxicity[J]. Chem Biol Interact, 2010, 188(2): 319–333. doi: 10.1016/j.cbi.2010.07.011 |
| [2] | Zhang S, Jiang C, Liu H, et al. Fluoride-elicited developmental testicular toxicity in rats:Roles of endoplasmic reticulum stress and inflammatory response[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2013, 271(2): 206–215. doi: 10.1016/j.taap.2013.04.033 |
| [3] | Doull J, Boekelheide K, Farishian BG, et al. Fluoride in drinking water:a scientific review of EPA's standards, committee on fluoride in drinking water, board on environmental studies and toxicology, division on earth and life sciences, national research council of the national academies[Z]. National Academies Press, Washington, DC, 2006. |
| [4] | Ozsvath DL. Fluoride and environmental health:a review[J]. Rev Environ Sci Biotechnol, 2009, 8(1): 59–79. doi: 10.1007/s11157-008-9136-9 |
| [5] | Wang H, Yang Z, Zhou B, et al. Fluoride-induced thyroid dysfunction in rats:roles of dietary protein and calcium level[J]. Toxicol Ind Health, 2009, 25(1): 49–57. doi: 10.1177/0748233709102720 |
| [6] | 刘国艳, 张维东, 顾金辉, 等. 氟对大鼠甲状腺结构和功能的影响[J]. 上海交通大学学报(农业科学版), 2008, 26(6): 537–539. |
| [7] | Singla S, Shashi A. Thyroid peroxidase activity as toxicity target for fluoride in patients with thyroiddysfunction[J]. Cur Res Microbiol Biotechnol, 2013, 1(2): 53–57. |
| [8] | Basha PM, Rai P, Begum S. Fluoride toxicity and status of serum thyroid hormones, brain histopathology, and learning memory in rats:a multigenerational assessment[J]. Biol Trace Elem Res, 2011, 144(1-3): 1083–1094. doi: 10.1007/s12011-011-9137-3 |
| [9] | Hosur MB, Puranik RS, Vanaki S, et al. Study of thyroid hormones free triiodothyronine (FT3), free thyroxine(FT4) and thyroid stimulating hormone (TSH) in subjects with dental fluorosis[J]. Eur J Dent, 2012, 6(2): 184–190. |
| [10] | 郭晓尉, 骆效宏. 高氟饮水对居民垂体-甲状腺功能的影响[J]. 中国地方病学杂志, 1994, 13(6): 378–379. |
| [11] | Ge Y, Ning H, Gu X, et al. Effects of high fluoride and low iodine on thyroid function in offspring rats[J]. J Integr Agr, 2013, 12(3): 502–508. doi: 10.1016/S2095-3119(13)60251-8 |
| [12] | 刘国艳, 柴春彦, 康世良. 氟化物对鸡肝脏脱碘酶代谢的影响[J]. 中国兽医杂志, 2003, 39(5): 14–15. |
| [13] | 李红, 高明涛, 许珂玉, 等. 原代培养猪甲状腺细胞及甲状腺过氧化物酶活性与氟化钠的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(37): 7425–7428. doi: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.37.033 |
| [14] | 孙玉富. 自由基与氧化应激及其在地方性氟中毒发病中的作用[J]. 中国地方病防治杂志, 2003, 18(1): 37–40. |
| [15] | 云中杰, 陈培忠, 边建朝, 等. 山东省地方性氟中毒病区村水氟检测结果分析[J]. 中国地方病学杂志, 2005, 24(5): 83–85. |
| [16] | 闫凤冬. 天津市地下水氟含量分布规律及形成机理研究[J]. 中国化工贸易, 2011, 3(7): 202–204. |