生物指示剂在灭菌监测中的作用正日益为人们所重视，广泛应用于医疗保健产品、卫生检疫、制药企业、医院制剂生产、食品生产等行业，对各种无菌生产工艺、无菌产品、无菌包装材料等灭菌效果进行评估、验证。目前使用的生物指示剂有载片或条带状指示剂、孢子悬液指示剂和自含式生物指示剂。作为灭菌器、灭菌过程及灭菌物品是否达到灭菌效果的监测和验证手段，生物指示剂中的指示微生物对相应的灭菌模式必须有高度抵抗性，其死亡状况可真实、可靠地反映灭菌状况。本文重点论述生物指示剂中指示微生物的研究概况、选择依据、监测应用以及发展展望，为生物指示剂得到更好地应用、发展提供参考。

1 生物指示剂的概念

生物指示剂(Biological Indicators)，《中国药典》(2010版)^[1]规定：系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。《消毒技术规范》(2002年版)^[2]指：将适当载体染以一定量的特定微生物，用于指示消毒或灭菌效果的制品。《美国药典》^[3]规定：一类特定微生物经过确定制备方法制造的生物试剂，对于某种灭菌工艺具有特定的耐受性。以上提出的灭菌指杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理，消毒指杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。综述所述，生物指示剂是对特定灭菌处理有确定的抗力，并装在内层包装中可供使用的染菌载体，用以确认灭菌设备的性能，灭菌程序的验证及生产过程灭菌效果的监控等。

2 指示微生物的选择标准

结合《中国药典》(2010版)^[1]、《美国药典》^[3]对制备灭菌生物指示剂所选用的微生物要求，指示微生物的选择标准规定如下：

2.1 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性

常见的灭菌方法可以杀死待灭菌产品中所有可能的污染菌。对热灭菌而言，微生物的耐热性从高到低为：细菌芽孢＞革兰阳性细菌＞革兰阴性细菌＞病毒。细菌芽孢具有稳定及耐不良环境的能力，使其不但抗热，还对紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。因此，许多芽孢杆菌作为产芽孢菌，可作为湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、气体灭菌等灭菌过程中生物指示剂的理想指示微生物。

此外，针对某一特定的灭菌处理，须筛选出具有特定抗性的菌株作为指示微生物。如对干热灭菌或湿热灭菌而言，须选择耐高温的菌株作为指示生物。绝大多数细菌的营养细胞在45℃以上就无法生长，80℃~100℃就可被迅速杀灭，但是，某些细菌可在80℃甚至更高的高温中生存，如嗜热脂肪芽孢杆菌、厌氧杆菌属等，这类菌之所以耐高温，是因为它们可以产生高温蛋白酶^[4]，这种酶的最适作用温度通常在60℃以上^[5]，使细菌在较高温度下保持生物活性，不至于因酶变性而死亡。所以，高温蛋白酶可为热灭菌处理指示菌的筛选提供参考。

2.2 菌种无致病性

生物界的微生物达几万种，有一少部分能致病。考虑安全问题，灭菌验证过程中，尽量选取非致病菌作为指示微生物。就芽孢杆菌而言，枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌等为非致病菌，而炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等致病性较强，不适合做灭菌指示微生物。消毒验证过程以杀灭病原微生物为目标，在指示剂选择中，将低致病菌如白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等作为生物指示菌，但是在使用过程中及使用后须防止外加污染和二次污染。

2.3 菌种稳定且易于保存

考虑到实际培养、应用便捷性及稳定性，选取的指示微生物要求生长培养不易受外界环境影响，遗传性状不易发生变异，存活期长。适合用液体石蜡覆盖保存、冷冻保存、载体保存、冷冻干燥保存等简便的保存方法。

2.4 易于培养

若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。考虑到市场对生物指示剂的广泛需求，制作生物指示剂的微生物最好是培养容易，操作简单的菌株。若是芽孢杆菌，制作指示剂孢子的纯度、浓度须达到规定范围才可保证监测效果。

综上可见，指示微生物的选择关系到生物指示剂的直接效用。每种指示微生物的确定必须结合微生物特性、灭菌形式、使用场所和使用目的等因素来综合确定，再以多次验证实验进行确认。目前，国内外广泛使用的生物指示剂有枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、生孢梭菌等细菌芽孢，以及缺陷假单胞菌等细菌。

3 主要指示微生物及应用介绍 3.1 枯草芽孢杆菌及其亚种

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状革兰阳性菌，在工业酶生产、生物防治、水产养殖、环境保护、医药卫生等领域有广泛的应用。在消毒灭菌方面，因枯草芽孢杆菌可产抗性较强的芽孢得到广泛应用。如枯草芽孢杆菌ATCC 5230，用于低于121℃蒸汽灭菌(105℃蒸汽灭菌)。

枯草芽孢杆菌ATCC 9372，也称枯草芽孢杆菌黑色变种，国际上将其列为萎缩芽孢杆菌属，由NAKAMURA^[6]率先发现和提出，非致病菌，主要分布于土壤，最高生长温度50℃~55℃。Raif Maeller等^[7]研究发现，枯草芽孢杆菌黑色变种在UV-A下的失活常数为(3.38±0.17)×10^-6 m²/J，相比DSM7264的(3.72±0.18)×10^-5m²/J和DSM 5611(6.81±0.34)×10^-5 m²/J，其抗性强十倍左右，因此可作为紫外灭菌的生物指示剂。英国、瑞士等国标准协会在健康产品相关的标准或与医疗器械相关的标准中将萎缩芽孢杆菌ATCC 9372作为环氧乙烷灭菌、干热灭菌和其它液体化学消毒剂的指示剂。美国药典、欧洲药典、日本药典等将该菌收录为灭菌生物指示剂。我国卫生部颁布的《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB 15981-1995)^[8]、《消毒技术规范》(2002年版)^[2]、《高致病性病原微生物实验室污染物排放标准》(二次征求意见稿)^[9]、《病原微生物实验室污染物排放标准》^[10]收录有萎缩芽孢杆菌ATCC 9372的应用。

3.2 嗜热脂肪芽孢杆菌

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，广泛分布于土壤、温泉、海洋沉积物^[11]。于1917年由Smith等^[12]最早在实验室分离得到，随后渐渐被认识和研究。该菌营养细胞呈长杆状，多数为单生，少数成对或链状排列，细胞宽0.6~1.0 μm、长2.0~3.5 μm，硬壁菌门属，热抗稳定，细菌繁殖体革兰氏染色阴性，细菌芽孢为孔雀绿着色，所产芽孢无致病性、无热原、无毒，对压力蒸汽的抵抗力在大多数微生物中较强^[13]。《消毒技术规范》(2002年版)^[2]中明确规定嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC 7953) 芽孢灭菌生物指示剂在121℃±0.5℃条件下的抗力指标：存活时间≥3.9 min，杀灭时间≤19 min，D值为1.3 min~1.9 min。陈金秋等^[14]对生物指示剂监测压力蒸汽灭菌效果进行研究，结果表明枯草杆菌黑色变种芽孢、金黄色葡萄球菌或是HBsAg，对湿热的耐受力均不及嗜热脂肪杆菌芽孢，故嗜热脂肪芽孢杆菌更适合作为压力蒸汽灭菌的指示微生物；邵守峰等^[15]用嗜热脂肪杆菌芽胞(ATCC 7953) 生物指示剂与化学指示卡监测压力蒸汽灭菌效果，研究发现两者差别无显著性，符合情况良好，故嗜热脂肪杆菌芽孢是较理想的、科学的、实用的一种压力蒸汽灭菌效果监测的方法；Albert等^[16]认为，嗜热脂肪芽孢杆菌的强抗性和动力学上的持续失活力，可作为蒸汽灭菌的指示微生物。

实际应用上，美国药典、欧洲药典、日本药典等将这类菌收录为热力灭菌生物指示剂；我国卫生部颁布的《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》(GB 15981-1995)^[8]、《消毒技术规范》(2002年版)^[2]将其作为压力蒸汽灭菌效果评价的标准检测菌株；国家质量监督检验检疫总局将其作为湿热灭菌用生物指示物列入《医疗保健产品灭菌生物指示物》(GB 18281.3-2000)^[17]标准中。综上所述，嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬液可用于湿热灭菌、甲醛灭菌、过氧化氢蒸汽灭菌等灭菌效果的验证和评价。其中ATCC 12980、ATCC 7953用于121℃蒸汽或甲醛低温蒸汽60℃灭菌，ATCC 10149用于甲醛低温蒸汽60℃灭菌。

3.3 短小芽孢杆菌

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为芽孢杆菌属，菌体细杆状，革兰阳性菌。因其抗电离辐射较强，常作为检测电离辐射灭菌效果的指示菌。我国1991年初步确定将短小芽孢杆菌E 601(ATCC 27142) 作为检测电离辐照灭菌效果的指示菌。任少珍等^[18]研究发现，薄膜型短小芽胞杆菌对γ射线和β射线D值分别为2.9 kGy和2.3 kGy，与丹麦样本的D值基本一致, 可作为辐射灭菌生物指示剂。王勇等^[19]以短小杆菌E₆₀₁及炭疽杆菌芽孢为检测对象，灭菌D₁₀值为依据进行灭菌试验。结果表明，电子束与γ射线对短小杆菌E 601及炭疽杆菌芽孢灭菌性能较为接近，应用于邮件灭菌，可完全保证其灭菌安全性。而炭疽杆菌作为致病菌，会对人或周围环境造成危害，故短小芽孢杆菌更适合做辐射灭菌生物指示剂。目前，中国药典和美国药典规定用短小芽孢杆菌(NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142) 孢子作为辐射灭菌的生物指示剂，其中孢子数10⁷~10⁸个/片，置放于26 kGy条件下，D值约3 kGy。但是灭菌产品中负载的微生物可能比短小芽孢杆菌芽孢更耐辐射，故短小芽孢杆菌孢子主要用于辐射灭菌过程监控，不能用于灭菌辐射剂量的建立。

3.4 生孢梭菌

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)，由英国和荷兰科学家在土壤中率先发现，是一种产孢子，革兰染色阳性，以周生鞭运动，严格厌氧的梭菌^[20]。熊海元等^[21]对生孢梭菌在同一温度下的不同介质中进行研究，发现残存孢子的对数值与暴热时间呈较好的线性关系，相关系数均大于0.97，且在相同介质和温度下，D值间的差异小且重现性好，耐热性稳定，因此，其孢子可用于湿热灭菌工艺的微生物学验证。中国药典规定生孢梭菌孢子可作为湿热灭菌的指示微生物，代表菌株为NCIMB 8053、NCTC 8594、ATCC 7955。{JP

3.5 其他

缺陷性假单胞杆菌直径与与除菌滤芯的0.2±0.02 μm的孔径非常接近，可作为过滤除菌的生物指示剂；粘质沙雷菌又称灵杆菌，菌体0.5×0.5~1.0 μm，广泛分布于水、土壤和植物中^[22]，长期以来作为测定孔径为0.45±0.02 μm规格的微孔滤膜过滤除菌指示微生物。但近年来发现其可致人体感染，包括泌尿道、呼吸道、脑膜和伤口感染，引起菌血症、内毒素休克和心内膜炎。因此，粘质沙雷菌作为生物指示剂尚已不合适。

目前，市面上生物指示剂还有凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等菌株芽孢制成的灭菌生物指示剂。相信随着科技不断发展，更多菌株的性能会被发现，使生物指示剂的微生物种类不断增加与完善。

4 生物指示剂的选择分析及发展展望 4.1 生物指示剂的选择

国内广泛使用的生物指示剂为通用型生物指示剂，即根据芽孢复苏后指示菌种新陈代谢引起培养液pH值改变，通过酸碱指示剂变色来进行判读，时间一般在24 h或48 h，甚至一周。该法效果可靠，但耗时较长，达不到生产检测快速的要求。另一种快速型生物指示剂，根据芽孢复苏后的酶促反应，通过荧光进行判读，时间一般为3~4 h。但需要判读仪器，对设备要求和费用相对通用型较高。

针对不同的灭菌工艺，需选取合适的生物指示剂产品进行灭菌监控。生物指示剂对灭菌工艺的耐受性不仅与其本身有关，也与灭菌所处环境条件有关，如pH、粘度、金属离子浓度等。为了确保生物指示剂的有效使用，综合考虑灭菌产品污染菌的耐热性控制要求、待验证工艺的灭菌条件(温度、时间及F0值)及生物指示剂的实际耐热参数来选择确定生物指示剂，可以使灭菌工艺的效果验证更加具有针对性。现有标准中灭菌工艺与指示微生物的参考如表 1。

4.2 发展展望

生物指示剂的使用为保证整个灭菌过程达到“无菌保证水平”(SAL)提供了强有力的保障。

生物指示剂今后发展的方向是如何使其应用更为便捷、快速和稳定。而要做到这一点，必须强化对指示微生物本身生理化特性的研究。微生物作为生物指示剂的主要成分，必须严格确定其菌株与菌落形态，了解其代谢及其他特性，为微生物的快速检测提供有力保障。此外，面对我国生物指示剂自主生产力弱、价格高、未有规范化的统一检验标准等问题，今后需加强科研投入，强化对微生物的研究与探索，筛选更高效菌株；完善目前生物指示剂的生产体系，强化生产设备性能确认、研发和建立；制定完整、规范的生物指示剂应用标准，使生产、应用更加规范化。相信综合科研、技术、制度、操作等各个方面，生物指示剂监测消毒灭菌将更加完善、安全性更高。