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邻苯二甲酸酯(phthalates，PAEs)是人工合成的有机物，是聚氯乙烯材料增塑剂，因其与塑料基质之间不形成共价键，而是以氢键和范德华力连接，故易从塑料中溶出而污染环境。在种类繁多的PAEs中，邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)用量最大。DEHP作为一种环境内分泌干扰物，进入人体后对健康造成多方面的影响，可引起肝、肾、肺、心、生殖系统等脏器毒性损害，其对女性生殖系统的毒性损害已得到广泛的关注。卵巢是DEHP毒性作用的靶器官，但其作用机制尚不清楚。颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，它的增殖与分化影响卵巢的功能。本研究通过观察DEHP对体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及半胱氨酸、天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease，Caspase)凋亡通路的作用，探讨DEHP对雌性生殖系统的毒性作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物与主要试剂25~29日龄雌性Wister大鼠，体重(80 ± 20) g，清洁级(天津医科大学实验动物中心)。DMEM培养基(Gibico公司)，DEHP(Sigma公司)，FITC/PI-annexin V凋亡试剂盒(Invitrogen公司)，孕马血清(北京海德公司)，Real-time PCR Master Mix(TaKa-Ra公司)，Bax和Bcl-2兔抗鼠抗体(Santa cruz公司)，寡核苷酸引物(上海生工生物工程有限公司合成)。
1.2 颗粒细胞的分离与培养大鼠一次性腹腔注射孕马血清50 IU/只，48 h后脱颈处死，无菌条件下取出双侧卵巢，剪破有腔卵泡，轻压使卵母细胞及周围的卵丘细胞、颗粒细胞同时逸出，反复吹打使颗粒细胞释放进入预冷的DMEM增养液中，细胞悬液经200目钢筛过滤，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液重悬细胞，0.4%台盼蓝染色，检测细胞活力，检测结果颗粒细胞活力＞95%。调整细胞密度为1.0 × 105/mL，接种于培养皿中，于37℃、50 mL/L CO2饱和湿度条件下预培养48 h。细胞贴壁后更换不含血清的DMEM培养液，继续培养24 h，更换含DEHP的培养液进行相关实验。
1.3 DEHP对颗粒细胞的毒性实验将颗粒细胞接种于24孔培养板内，培养24 h后，换含DEHP的培养液，终浓度分别分10、50、100 nmol/L，以只加DMSO的细胞作为对照组，分别命名为DMSO组、DEHP低剂量组、DMHP中剂量组、DEHP高剂量组，细胞继续培养细胞24 h。
1.4 荧光定量PCR法检测Caspase-3和Caspase-9基因mRNA总RNA提取与cDNA合成按试剂盒说明书进行，cDNA产物置-20℃保存。采用7700全定量PCR仪(Applied Biosystems)，以β-actin为内参照进行PCR检测。Caspase-3基因引物序列，上游: 5' -TAGCGGATGGGTGCTATTGT-3';下游: 5'-CG GATACACAGCCACAGGTA-3'; Caspase-9引物序列，上游: 5'-TAACAGGCAAGCAGCAAAGT-3'，下游: 5'-CATGCTCAGGATGTAAGCCA-3'; β-actin引物序列，上游: 5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'，下游: 5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'。反应条件: 95℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s、72℃ 45 s，共40个循环。计算目的基因相对表达量(RQ值)。
1.5 免疫蛋白印迹检测Caspase-3和Caspase-9蛋白裂解缓冲液提取细胞总蛋白，经Bradford法定量后进行SDS-PAGE电泳，蛋白量为30 μg，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶封闭，分别加Caspase-3或Caspase-9兔抗鼠抗体，4℃过夜，TBST洗3次，每次15 min。再加入HRP标记羊抗兔IgG，室温下反应1.5 h，0.1% TBST洗膜，ECL发光压片显色，应用Bandscan软件分析每个条带的灰度值。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率操作按FITC/PI-annexin V凋亡试剂盒说明书进行。各组细胞用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，250 μL结合缓冲液重悬细胞，调整浓度为5 × 106/mL。取100 μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5μL FITC/PI-annexin V，室温下避光孵育15 min，离心弃上清液，加入300 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测凋亡率，计数104个细胞。
1.7 统计学方法实验重复3次，数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件分析数据，多组间差异分析采用方差分析，采用LSD法两组间进行比较。
2 结果 2.1 Caspase-3或Caspase-9基因mRNA表达检测结果颗粒细胞Caspase-3或Caspase-9基因mRNA定量PCR检测见图 1，表达结果见表 1。大鼠卵巢颗粒细胞经不同浓度DEHP处理24 h后，Caspase-3基因mRNA表达随DEHP剂量增加，表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05); Caspase-9基因mRNA表达随DEHP剂量增加，表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| A:溶解曲线; B: Caspase-3基因扩增曲线; C: Caspase-9基因扩增曲线 图 1 Caspase-3和Caspase-9基因定量PCR检测图 |
2.2 Caspase-3或Caspase-9蛋白表达检测结果
颗粒细胞Caspase-3或Caspase-9蛋白免疫印迹检测见图 2，检测表达结果见表 1。大鼠卵巢颗粒细胞经不同浓度DEHP处理24 h后，Caspase-3蛋白表达随DEHP剂量增加，表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05); Caspase-9蛋白表达也随DEHP剂量增加，表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| 1: DMSO组; 2: EHP低剂量组; 3: DEHP中剂量组; 4: DEHP高剂量组 图 2 颗粒细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白Western blot检测图 |
2.3 卵巢颗粒细胞凋亡检测结果
各组细胞增殖率检测结果见表 1。大鼠卵巢颗粒细胞经不同浓度DEHP处理24 h后，随DEHP剂量增加，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨论本研究应用未成熟的雌性Wister大鼠的卵巢颗粒细胞体外培养模型，观察DEHP对原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡作用。结果发现，经DEHP作用24 h后，卵巢颗粒细胞凋亡率随DEHP浓度增加而增加，结果说明DEHP在体外可直接诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡，对卵巢颗粒细胞产生毒性作用。
DEHP已对人们生活的环境造成严重的污染，已成为世界范围内威胁人类生存和健康的一大公害[1]。DEHP作为一种脂溶性的环境雌激素，能引起雄性生殖系统的损害。动物实验表明，暴露于DEHP孕鼠，其雄性子代发生肛门生殖器距离缩短、乳头残留、睾丸下降不全、尿道下裂等机率增加。暴露于DEHP的雄性幼鼠，其睾丸发育差，体内雄激素水平降低。暴露于DEHP的雄性成年鼠，精液量少，精子数降低[2-4]。由于女性的生活习惯和职业特点，DEHP暴露的机会明显高于男性，因此DEHP对雌性生殖的损害也赿来赿受到重视。动物实验发现，DEHP可降低雌性大鼠雌二醇水平，抑制排卵，大鼠卵泡体积减小，颗粒细胞体积减小，出现多囊卵巢[5]。DEHP在体外可促进大鼠卵巢颗粒细胞增值，与DEHP作用时间有关[6]。
凋亡是在基因控制下的一种细胞自我消亡形式，在胚胎发生、器官发育、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着重要的作用。Caspase是一类蛋白水解酶，与细胞凋亡密切相关，它的激活可使细胞发生不可逆的凋亡[7]。Caspase家族成员以无活性的酶原形式存在于细胞内，Caspase活化途径有线粒通路、死亡受体通路、内质网通路。Caspase-9是线粒体通路的关键蛋白，处于Caspase“瀑布式”激活的顶端，它的活化对整个内源性凋亡通路的激活尤为重要。细胞色素C从线粒体释放后，它会与凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activa-ting factor-1，Apaf-1) 结合，在脱氧三磷酸腺苷存在的情况下，激活Apaf-1。活化的Apaf-1结合在Caspase-9酶原而将之切割和活化，活化的Caspase-9切割Caspase-3酶原并产生活化的Caspase-3四聚体，最终引起细胞凋亡[8]。卵泡闭锁是卵巢正常的生理功能，在卵泡发育后期，有腔卵泡及排卵前卵泡的闭锁，主要是由于卵泡中颗粒细胞发生凋亡引起的[9]。卵巢中颗粒细胞的过度损伤，可造成卵泡过度闭锁。本研究还发现，经DEHP作用后，卵巢颗粒细胞Caspase-3和Caspase-9基因表达增加，同时卵巢颗粒细胞凋亡增加。结果说明DEHP对凋亡Caspase通路的激活是介导卵巢颗粒细胞凋亡的机制，是细胞发生凋亡的早期事件。颗粒细胞凋亡增加将导致卵泡的过度闭锁，影响卵巢的功能。
综上所述，DEHP可通过激活颗粒细胞Caspase凋亡途径而诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，最终导致卵巢功能的障碍。
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