苯并(a)芘(Benzo (a) pyrene)是多环芳烃(PAHs)中最具有代表性的化学物，主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的热解和不完全燃烧，以及烟草烟雾、烹调油烟等，可以通过空气、食物和饮用水等途径进入体内。苯并(a)芘具有致癌性、免疫毒性、神经毒性等。此外，苯并(a)芘也可通过胎盘进入胎儿体内在肝脏进行生物转化，由于胎儿各项机能尚不完善，对毒物损害的修复能力较弱，因此孕期苯并(a)芘暴露可能对胎儿的肝脏等组织产生不良影响。利用基因芯片技术对孕期苯并(a)芘暴露的仔鼠肝细胞基因表达进行研究，发现一些与苯并(a)芘毒性相关的细胞信号通路，其中与细胞凋亡有关的Bcl-xl为重要的核心调控基因之一，进一步采用Western blot方法，在蛋白水平上检测仔鼠肝脏组织凋亡相关蛋白Bcl-xl及其同家族的Bax基因的表达情况，探讨孕期苯并(a)芘暴露对子代的毒性机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

苯并(a)芘(98%，Sigma公司生产); 丙烯酰胺混合液(40%，Fisher Scientific公司生产); Tris-碱、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、过硫酸铵、甘氨酸、Tween-20、蛋白酶抑制剂(Sigma公司生产); 4 ×上样缓冲液(美国Expedeon公司生产); N，N，N'，N' -四甲基乙二胺、蛋白marker (美国BIO-RAD公司生产); Bcl-xl及Bax兔多克隆抗体(Cell Signalling公司生产); 鼠单克隆抗体β-actin (Proteintech公司生产); IRDye700标记的荧光二抗(美国Rockland Immunochemicals公司生产)。

分析天平(美国Denver Instrument公司生产); Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司生产); 电源、电泳槽、电泳转移仪(半干转和湿转) (美国BIO-RAD公司生产)。

1.2 动物分组和染毒

雌性SD大鼠体重220~250 g，北京维通利华公司提供(大鼠批号: SCXK(京) 2011-0011)，中国疾病预防控制中心职业卫生所清洁级动物房饲养。适应1周后，雌鼠与雄鼠1 : l合笼12 h，次日晨检查雌鼠有阴栓确定为受孕，检出日为孕期第0 d。受孕后随机分为溶剂组(玉米油)和苯并(a)芘处理组(0.75 mg/kg、1.5 mg/kg和3 mg/kg，玉米油配制)，每组8只，喂饲普通饲料，自由饮水和进食。孕鼠从妊娠第3 d开始，1次/d经胃灌注苯并(a)芘到妊娠第17 d结束，灌胃量为0.4 mL/100 g，单笼饲养待其自然分娩。

1.3 生长发育指标的检测

在妊娠第0、4、7、14、19 d称量母鼠体重。在仔鼠出生当日，测量仔鼠体重、体长和尾长(测量时轻拉仔鼠尾，让其自然伸直身体)。为了消除各窝仔鼠数量差异所带来的偏倚，进行统计学分析时，剔除了每窝仔鼠数量少于8只和大于15只的样本，保证各组内窝仔鼠数构成比接近，降低实验分析结果的误差。

1.4 Western blot检测仔鼠肝脏凋亡相关蛋白Bcl-xl和Bax表达水平的变化

将自然分娩后24 h内的仔鼠肝脏取出，置入细胞裂解液中，低温匀浆，4℃震荡作用30 min后，12 000转，4℃离心20 min，取上清液，-80℃保存备用。Bradford法蛋白定量，然后加入4倍体积样本缓冲液，95℃变性5 min。取20 μg样品在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，电转至硝酸纤维素膜，依分子质量大小切取条带，取相应条带分别加入Bcl-xl多克隆抗体(1 : 400)、Bax多克隆抗体(1: 300)，并加入用作内参的β-actin单克隆抗体(1: 1 000)，4℃孵育过夜。PBST洗膜3次，加入IRDye700标记羊抗小鼠二抗(1 : 10 000)，室温轻摇1 h，PBST洗膜3次，随后用Odyssey红外成像系统对膜进行扫描、测定条带灰度值。

1.4 统计分析

所有数据均以平均值±标准差(Mean±SD)的形式表示。统计学分析采用StatView软件。两组数据间差异采用Student's-t检验; 多组数据间差异用单因素方差分析(ANOVA)，并继之以Fisher's post-hoc检验。以P＜0.05作为在统计学差异的界限。

2 结果 2.1 孕鼠及仔鼠一般情况

染毒期间孕鼠饮食正常、活动自如、各组大鼠在处理过程中均未出现死亡，能够正常分娩。各组中出生24 h内的仔鼠活动自如，头、尾、四肢等无异常改变。

结果显示，各组孕鼠的体重均随着受孕时间的延长而增加。在孕期相应天数(第0、4、7、14、19 d)，各染毒组孕鼠体重增加幅度均低于对照组孕鼠体重的增加幅度，且随着染毒剂量的增加，体重增加的幅度降低，但各组之间比较差异无显著性(P＞0. 05，表 1)。

各染毒组仔鼠的体重、身长及尾长均低于对照组，且随着染毒剂量的增加，体重、身长和尾长的降低更为明显，但与对照组相比，各染毒组的体重、身长和尾长的差异均无显著性(P＞0. 05，表 2)。

2.2 仔鼠肝脏中Bcl-xl和Bax蛋白的表达水平

Western blot结果显示，随着染毒剂量的增加，Bcl-xl的表达水平也随着降低。但是低剂量组Bcl-xl的平均灰度值与对照组相比没有显著性差异(P＞0.05)，中、高剂量组Bcl-xl的平均灰度值与对照组相比显著增高，差异具有统计学意义(分别为P＜0.05和P＜0.01)。而Bax蛋白表达水平的变化与Bcl-xl相反。随着染毒剂量的增加，Bax的表达水平也随着升高，但是低剂量组Bax的平均灰度值与对照组相比没有显著性差异(P＞0. 05)，中、高剂量组Bax的平均灰度值与对照组相比显著增高，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01，表 3、图 1)。与对照组相比，低、中、高剂量组Bcl-xl/Bax的比值均降低，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01，表 3)。

3 讨论

近年来，苯并(a)芘对胎儿及新生儿的健康影响引起了越来越多的关注。流行病学及动物实验研究显示，苯并(a)芘及其代谢产物可以干扰正常妊娠并导致流产率增高^[1]，使新生儿出生体重减轻，身长、头围减少以及增加新生儿和幼儿患呼吸道疾病的几率^[2]，还可引起幼儿认知发育迟缓，影响学习能力^[3-5]，关于苯并(a)芘对子代的健康影响及具体生物学作用机制还有待进一步明确。目前对于苯并(a)芘生殖毒性或胚胎毒性等研究中，建立的动物模型大多为高剂量暴露模型，可出现流产、死胎等明显的效应终点。本研究的目的是在不影响母体正常生育能力，不出现明显不良出生结局的情况下，观察孕期苯并(a)芘暴露对子代的影响及其可能的毒性机制。从实验结果来看，染毒后母体活动自如，无异常反应，保持了正常的生育能力，能够顺利分娩，没有出现早产、流产及胚胎死亡情况。染毒期间观察到了各组孕鼠体重增加幅度、出生24 h内的仔鼠体重、身长及尾长等随暴露水平增加有下降趋势，但各组间差异均无显著性，提示本研究建立的是一种孕期较低水平的苯并(a)芘暴露模型，虽然对子代的生长发育产生了一定的影响，但未出现明显的不良出生结局。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序死亡过程。已有文献报道，苯并(a)芘可以引起多种细胞，如小鼠肝细胞^[6]、神经细胞^[7]等发生凋亡，但是对孕期苯并(a)芘暴露是否能引起仔鼠肝细胞凋亡的报道较少。在前期研究中，利用基因芯片技术，发现与细胞凋亡有关的Bcl-xl是孕期苯并(a)芘暴露后，参与仔鼠肝细胞毒性效应的重要核心调控基因之一。基因芯片结果显示孕期苯并(a)芘暴露可使仔鼠肝脏中Bcl-xl基因的表达水平显著降低，其介导的信号通路在仔鼠肝细胞整体基因网络中处于核心位置，提示凋亡可能参与苯并(a)芘导致的子代肝脏毒性。因此，本研究进一步采用Western blot的方法检测孕期苯并(a)芘暴露后仔鼠肝脏中凋亡相关蛋白Bcl-xl和Bax表达水平，探讨其可能的分子机制。

细胞凋亡是由多基因控制的细胞主动死亡过程，是促凋亡基因和抑凋亡基因的协同调控的结果。而Bcl-2家族是细胞凋亡调控因子中最受关注的因子之一。Bcl-xl和Bax都是Bcl-2基因家族的成员^[8]，参与细胞凋亡的调控过程。其中，Bax可通过诱导线粒体膜渗透性转换孔(Permeability Transition Pore，PTP)的开放，促进细胞色素C自线粒体的释放，从而诱导细胞凋亡; 而Bcl-xl参与多种蛋白质-蛋白质相互作用发挥其抑制凋亡功能。例如，在外源性凋亡途径中，Bcl-xl通过干扰死亡诱导信号复合体(death-inducing signing complex，DISC)的组装，抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase-8的活性; 在内源性凋亡途径中，Bcl-xl能够阻断Bax对线粒体外膜的破坏，抑制细胞色素C的释放，从而发挥抗凋亡作用^[9]。Bcl-xl/Bax的比值显示细胞增殖和凋亡的平衡，比值越高表明细胞存活率越高，反之，细胞的凋亡率就越高^[10-11]。本研究发现随着苯并(a)芘染毒剂量的增加，Bcl-xl蛋白的含量逐渐减少，Bax蛋白的含量逐渐加强，Bcl-xl/Bax的比值呈下降趋势，提示孕期苯并(a)芘暴露可引起仔鼠肝细胞凋亡比例的增加，凋亡途径可能是孕期苯并(a)芘暴露对新生儿肝脏毒性作用的机制之一。

4 结论

孕期苯并(a)芘暴露可引起新生仔鼠肝脏的凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平下降、Bax蛋白表达水平升高，Bcl-xl/Bax比值显著下降，提示凋亡可能在孕期苯并(a)芘暴露对子代的肝脏毒性中发挥作用。