沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)是目前广为采用的体外致突变性快速测定方法之一^[1-2]。增/溶剂的选取是Ames试验过程中经常碰到的问题，如果选取不当就会影响测试结果的准确性。本研究结合化妆品安全性评价特点，对8种增/溶剂影响Ames试验结果进行观察分析，为今后该试验中合理选用增/溶剂提供参考。

1 材料与方法 1.1 主要材料和仪器

TA97、TA98、TA100和TA102试验菌株(本实验室留存)。2，4，7-三硝基-9-芴酮(Fluba Chemie CH-9470 Buche); 叠氮化钠(Serva FeinBiochemica AG，CH-9470 Buche); 丝裂霉素C (Boehringer Mannheim Corp，Indiannapolie，IN USA); 2-氨基芴(Fluba Chemie AG，CH-9470 Buche)，1，8-二羟基蒽醌(Sigma); 琼脂粉(北京化学试剂公司); 辅酶Ⅱ (NADP，Sigma公司); 6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，Sigma); S9(汇智泰康(北京)医药技术有限公司); 隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司); 振荡水浴摇床(哈尔滨东联电子技术开发有限公司); 菌落计数器(Synoptics); 生物安全柜(Thermo)。95%乙醇、甲醇、丙酮、吐温-20、吐温-60、吐温-80、DMSO和乙酸乙酯(均为国产分析纯)。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制

阳性物配制: 2，4，7-三硝基-9 -芴酮、2-氨基芴用无菌DMSO配制成0.002 mg/mL和1 mg/mL应用液; 叠氮化钠、丝裂霉素C用无菌蒸馏水配制成2 500 μg/mL和400 μg/mL应用液; 1，8-二羟基蒽醌用丙酮配制成10 mg/mL应用液。受试物均以无菌蒸馏水配制。试验所需培养基和其余试剂配制按照《化妆品卫生规范》(2007) ^[3]中进行。

1.2.2 试验菌株鉴定

菌株鉴定及其判断标准依照《化妆品卫生规范》 (2007) ^[3]进行。

1.2.3 毒性测定及剂量设定

采用平板掺入法进行毒性测定，根据受试物对细菌的毒性及其溶解度、回变菌落数及试验平板上的细菌背景菌苔来判定受试物的毒性剂量。以最低抑菌浓度作为受试物试验最高剂量，若向下按比例稀释成4个剂量设定用于Ames试验:吐温-20试验剂量分别为0.5、1.0、2.5和5.0 mg/皿(TA97)，1.0、2.5、5.0和10.0 mg/皿(TA98)，10、25、50和100 mg/皿(TA100)，以及10、25、50和100 mg/皿(TA102)，95%乙醇、甲醇、丙酮、吐温-60、吐温-80、DMSO和乙酸乙酯对TA97、TA98、TA100和TA102菌株试验剂量均为10、25、50和100 mg/皿。2，4，7-三硝基-0-9 -芴酮、叠氮化钠、丝裂霉素C、2-氨基芴和1，8-二羟基蒽醌试验剂量分别为: 0.2、2.5、4.0、10.0和50.0 μg/皿。

1.2.4 Ames试验

采用平板掺入法进行试验:增菌培养后，将顶层琼脂培养基用玻璃试管分装并于45℃水浴中保温。向上述试管中加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试物溶液和0.5mL S9混合液(代谢活化组)，混匀后倒入底层培养基平板上。根据毒性测定及剂量设定添加受试物，同时设自发回变对照、阳性突变剂对照和溶剂对照，每个剂量3个平行皿。在37℃下培养48 h后，记数每皿回变菌落数。

1.2.5 数据处理

试验细菌回复突变菌落数以x±s表示，当回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并呈剂量-反应关系时，该受试物判定为致突变阳性。

2 结果

经鉴定，试验菌株TA97、TA98、TA100和TA102均为组氨酸缺陷型，都具有rfa突变和对氨苄青霉素有抗性阳性，自发回变率在《化妆品卫生规范》 (2007) ^[3]界定范围之内。

8种增/溶剂中，吐温-20在10.0 mg/皿剂量下对TA97菌株和在25.0 mg/皿剂量下对TA98菌株均产生明显毒性抑制现象，对TA100和TA102在最高100.0 mg/皿剂量下均未见毒性效应; 其余增/溶剂在最高剂量100.0 mg/皿情况均未见对细菌毒性现象。

在10.0、25.0、50.0和100.0 mg/皿剂量下，95%乙醇、甲醇、丙酮、吐温-60、吐温-80、DMSO和乙酸乙酯对TA97、TA98、TA100和TA102菌株的回变菌落数均不高于溶剂对照组回变菌落的2倍。吐温-20对试验菌株的回变结果见表 1。

3 讨论

Ames试验是经典的化学物致突变性检测方法^[4]。为解决样品难溶而引入的增/溶剂可能会带来新的问题，那就是引入的增/溶剂自身可能会对Ames试验结果产生影响，从而产生对测试样品的误判。增/溶剂的种类繁多，如何进行合理选用，鲜有文献报道^[5]。化妆品安全性检测所倚重的《化妆品卫生规范》 (2007) ^[3]中规定，除水以外，可以选用DMSO、丙酮、95%乙醇等溶剂以增强样品的分散，要求是溶剂必须是对试验菌株毒性低且无致突变性。本研究特设对8种增/溶剂能否具有Ames试验致突变性的检出性进行观察，目的为合理选用增/溶剂提供参考。

本研究选用的8种增/溶剂中，包括95%乙醇、甲醇、丙酮、DMSO和乙酸乙酯5种溶剂，和3种非离子型增溶剂:吐温-20、吐温-60和吐温-80。增溶剂是通过降低难溶物表面张力，增加其溶解度并形成溶液的表面活性剂。根据以往检测实践，有些化妆品特别是化妆品原料物质在应用诸如吐温类增溶剂的分散效果比较好。考虑到将来可能选用增溶剂来处理某些难溶待测物的检测实践需要，故将上述3种吐温类增溶剂亦纳入观察之列。

在根据毒性测试结果设定剂量前提下，各增/溶剂均未表现出Ames致突变性测试阳性。以此推断，除吐温-20外的95%乙醇、甲醇、丙酮、吐温-60、吐温-80、DMSO和乙酸乙酯7种增/溶剂可以以最大使用剂量100.0 mg/皿作为增/溶剂引入Ames试验中使用。鉴于吐温-20在10.0 mg/皿剂量下对TA97菌株和在25.0 mg/皿剂量下对TA98菌株均产生明显毒性抑制现象，为保守起见，建议吐温-20的使用剂量以小于10.0 mg/皿为佳。

该研究基于化妆品检测实践，主要以《化妆品卫生规范》 (2007) ^[3]为依据得到上述结论。在化妆品安全性评价中可以参考以上进行相应增/溶剂的选择使用。由于Ames试验其本身迄今仍存在结果判定上的种种不确定性，上述阴性结果的得出，不能绝对上判定8种增/溶剂是否具有致突变性。然而，根据以上结论，却可以在一定程度上方便进行Ames测试提供参考。