1 引言(Introduction)

近年来, 工业印染废水中残余的重金属离子和有机染料所造成的环境水体污染已经发展成了一个全球密切关注的问题.工业印染废水中通常含有镉、铬、铅等重金属离子和它们的络合物作为染料的稳定剂和着色剂, 它们被进入环境后是很难被自然界自行降解, 这些重金属离子也会通过食物链的传递积累在生物体内, 其中许多重金属是公认的致癌物质.Cd²⁺作为一种工业印染废水中典型的重金属离子, 其及它的化合物作为添加剂均有一定的毒性, 虽然在人体内不易被肠道等消化系统吸收, 但是可经呼吸系统被人体吸收, 积存于肝脏、肾脏等器官, 尤以对肾脏损害最为明显, 对人体的机能造成潜伏的危害, Cd²⁺在人体器官内的积累还可能导致人体骨质疏松和软化等多种症状(Shabid et al., 2014; 李群, 2017). 因此, 本课题组致力于寻求简单而有效的方法来去除印染废水中的Cd²⁺.此外, 印染废水中残存大量的含有芳香烃官能团的偶氮染料, 这些有机染料的合成来源具有多样性和复杂性, 大多数易电离且它们复杂的分子结构也使其难以通过自然界的微生物自行降解去除(胡浩光等, 2016; 龚珞军等, 2019).孔雀石绿(MG, malachite green)是工业印染废水中典型的偶氮染料残余污染物之一, 其作为一种人工合成的三苯基甲烷有机物具有价格低廉, 易着色, 杀菌效果好等特点, 常用于纺织品的染色和鱼类微生物感染的治疗.但是该染料会干扰可见光在水中的渗透率, 导致水体环境中水生植物的光合作用效率降低, 含氧量随之降低, 从而抑制水体中生物的活性(Tkaczyk et al., 2020).同时MG对人体具有“三致”性(致癌性、致畸性、致突变性), MG的三苯甲基官能团是典型的致癌性官能团, 其中与苯环相连的亚甲基和次甲基易受到苯环的影响从而具有较高的反应活性, 可生成有机致癌物质三苯甲基, 它能抑制人体内谷胱甘肽-S-转移酶的活性, 这种情况能造成人体内器官组织氧压的改变和脂质的过氧化, 使细胞发生凋亡, 诱发肿瘤(Wang et al., 2017).现今, 对于这两种污染物的联合修复通常会采用传统的物理及化学手段, 例如物理吸附法去除电镀废水中的铬、锡、铜等重金属离子(于春光等, 2015), 化学试剂沉淀法通过调整水体中pH使金属离子转化为不溶的固体(杨杰, 2007), 膜过滤法在处理重金属废水时, 根据保留颗粒的尺寸大小可选择超滤、纳米过滤以及反渗透法等不同的过滤方法去除水体中的金属离子(杨杰, 2007; 于春光等, 2015), 超声电化学法降解水环境中的有机污染苯酚(Jain et al., 2018)和甲基橙(高俊侠, 2013).然而, 这些去除污染物的过程中存在着许多的限制因素如处理成本较高、能耗较大, 会产生大量含毒的污泥, 并且在处理完污染物后所用材料不易回收, 会产生二次污染等(Nguyen et al., 2013).

氧化石墨烯(GO, graphene oxide)技术在环境修复领域中已经得到了广泛的认可和应用, 但是这种技术在实际的环境修复过程中还存在其自身的局限性, 例如GO合成工艺中的还原过程需要运用到大量的有毒有害化学试剂, 这些化学试剂会对人体健康和环境造成大量危害；GO在溶剂中的相容性差, 不易分散的性质严重限制了实际应用的效果等(Li et al., 2017).在工业印染过程中产生的废水其中的污染物多有伴生性和多样性的特点, 因此重金属和染料的复合污染是我们修复环境时所亟需面临的重要挑战(Chanzu et al., 2019).由以往的研究和文献中可以知道绿色合成还原氧化石墨烯去除污染物的机理主要都是以化学吸附为主, 物理吸附、单项吸附和多项吸附共存的表面控制反应, 并且缺少选择性等问题(Jin et al., 2018).而传统微生物降解技术中的游离菌在未固定化前易受到微生物量不足, 保留时间短以及降解效果波动性大等因素的影响, 对污染物的降解效果稳定性不理想(Wang et al., 2015).因此, 为了克服上述技术发展的限制, 需要研制一种新型生物纳米材料可同时去除印染废水中的重金属和有机染料残余, 而将绿色还原氧化石墨烯技术与微生物降解技术相结合则是目前环境修复领域较为热点的研究之一.

在本研究中制备一种新型生物复合纳米材料, 以甘蔗渣为还原剂绿色合成还原氧化石墨烯(B-RGO, bagasse reduce graphene oxide), 并负载具有可降解染料污染物MG能力的伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)制备生物纳米材料(MNMs, Microbial nano-materials)(Li et al., 2018).将制备的MNMs用于同时去除含有Cd²⁺和MG的复合污染水溶液.利用扫描电子显微镜-X射线能谱仪(SEM-EDS)和拉曼光谱仪(Raman)分析B-RGO的合成特征以及MNMs在吸附降解复合污染物过程中的形貌变化.同时采用气相色谱-质谱(GC-MS)分析MNMs对MG的降解产物, 并利用动力学模型初步揭示MNMs对印染废水中典型重金属离子Cd(Ⅱ)和孔雀石绿的去除机制.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料与仪器

MG分子式为C₂₃H₂₅N₂, 分子结构式见图 1.为AR级, 购自国药集团化学试剂有限公司.

其他主要试剂：六水合硝酸镉、氯化铁、硫酸镁、氯化钠、无水乙醇、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、葡萄糖、蛋白胨均为AR级, 购自国药集团化学试剂有限公司；伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)购自上海北诺生物科技有限公司；甘蔗渣购自福州柏物产食品有限公司.

实验仪器：数显控温磁力搅拌器HJ-4A, 购自华城润华仪器厂；原子吸收光谱仪240AA, 购自安捷伦科技有限公司；紫外可见光谱仪UV1902, 购自上海凤凰城；气相质谱联用仪MSD5977, 购自安捷伦科技有限公司；真空干燥箱DZF-6020, 购自上海精宏实验设备有限公司.

2.2 实验方法 2.2.1 伯克霍尔德菌的培养

取适量伯克霍尔德菌在培养温度为30 ℃, 摇床转速为150 r·min^-1的培养环境下连续培养16 h以上, 然后取20 mL样品在离心转速为4000 r·min^-1条件下离心10 min, 去除上层清液, 收集下层沉淀的生物质, 用磷酸盐缓冲液将其稀释为OD₆₀₀=0.7的细胞悬浮液.

2.2.2 甘蔗渣还原液的制备

将收集的甘蔗渣用去离子水洗涤3次, 在烘箱中60 ℃条件下干燥24 h并粉碎, 过150目筛收集细腻且均匀的甘蔗渣粉末.再将甘蔗渣粉末(4.0 g)加入去离子水(400 mL)中, 并滴加H₂SO₄(300 μL), 随后在水浴60 ℃条件下持续加热5 h, 冷却至室温后放置于4 ℃冰箱中备用.

2.2.3 MNMs制备

将上述甘蔗渣还原液加入到GO悬浮液(400 mL)中, 并滴加氨水(600 μL), 然后在水浴95 ℃条件下搅拌12 h后, 再将混合物以6000 r·min^-1离心20 min收集下层沉淀并进行真空冷冻干燥48 h后获得载体材料B-RGO.

取上述获得的伯克霍尔德菌悬浮液(4 mL)与B-RGO颗粒(1.0 g)混合置于锥形瓶中, 并加入矿物盐培养基(25 mL), 放置在培养箱中持续培养18 h以上(150 r·min^-1 30 ℃), 待伯克霍尔德菌被负载在B-RGO的表面上后采用布氏漏斗过滤收集MNMs.

2.2.4 影响因素实验

考察MNMs分别在不同的反应温度(298、308、318 K)、pH(6.5、7.0、7.5)、MNMs投加量(0.5、1.0、1.5 g·L^-1)以及污染物的初浓度(50、70、90 mg·L^-1)条件下对去除水溶液中Cd²⁺和MG复合污染的效果.并通过分析实验结果, 获得最佳去除条件并初步分析去除机制.

2.3 拟合方程

采用伪一级吸附动力学和伪二级吸附动力学对MNMs吸附Cd²⁺和MG的过程进行拟合, 其动力学模型的线性方程可表示为：

(1)

(2)

式中, t为反应时间(min^-1), q_t为t时刻的MNMs吸附Cd²⁺和MG的吸附量(mg·g^-1), q_e为吸附平衡时MNMs吸附Cd²⁺和MG的吸附量(mg·g^-1), k₁为伪一级吸附动力学反应常数(min^-1), k₂为伪二级吸附动力学反应常数(g·mg^-1·min^-1).

采用伪一级降解动力学和伪二级降解动力学对MNMs降解MG的过程进行拟合, 其动力学模型的线性方程可表示为：

(3)

(4)

式中, t为反应时间(min^-1), c₀为降解前MG的浓度(mg·L^-1), c_t为t时刻MG的浓度(mg·L^-1), k₃为伪一级降解动力学的反应常数(min^-1), k₄为伪二级降解动力学的反应常数(min^-1)(Gan et al., 2019).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 SEM-EDS-Mapping分析

采用SEM-EDS观察MNMs的表面形貌并对微区进行元素成分分析.如图 2a所示, MNMs在去除污染物前其表面不平滑, 存在着大量的褶皱和卷曲.图 2b中可以看到, 在MNMs去除污染物后表面的卷曲和褶皱有所舒展和平滑, 并且发现有明显的孔洞结构, 这可能是大量的伯克霍尔德菌在MNMs的表面生长并被固定在B-RGO的孔洞中, 这样即提高了微生物的生存环境水平又增加了生存空间(Balarak et al., 2015).EDS分析提供了碳氧含量的比值(C/O)和MNMs表面元素含量, 在图 2c和2d中计算出碳氧(C/O)比为2.26和2.06, 去除污染物前后碳氧(C/O)比值相差不大, 说明MNMs中的大部分含氧官能团并没有被除去.而在图 2d的EDS图中可以看到Cd²⁺含量有明显的增加.该变化说明MNMs有吸附Cd²⁺的能力(Balarak et al., 2015).Mapping图像显示, 此生物纳米材料具有良好的吸附污染物的能力, 反应后Cd²⁺元素基本呈现均匀分布的状态.

3.2 Raman分析

一般来说, D峰和G峰的强度比(I_D/I_G)可以用来判断含碳结构的sp³结构和sp²结构的结构域大小.在图 3中可以看到生物纳米材料MNMs在1353 cm^-1附近有一个D峰, 在1575 cm^-1附近有一个G峰.去除污染物前后MNMs的D峰与G峰的强度比(I_D/I_G)分别为0.924和0.983, 比值都小于1说明MNMs在去除污染物后并没有被氧化, 并且生物纳米材料MNMs去除污染物前后的D峰和G峰的强度比(I_D/I_G)比值没有明显变化, 表明伯克霍尔德菌的生长并没有影响B-RGO的碳基结构(Zhang et al., 2019).

3.3 GC-MS分析

采用GC-MS对MG及降解后的产物进行分析, 使用NIST数据库进行鉴定.如图 4可知, 当保留时间为25.5 min经鉴定为MG的峰, 经过60 h的微生物降解后, 在保留时间为6.5 min时出现一个新峰, 在保留时间为21.5 min时也出现了一个新峰, 对比NIST数据库被证实降解产物是N, N-二甲基苯胺(m/z 136；主要片段：136、121、94、65、39)和4-(二甲基氨基)二苯丙酮(m/z 225；主要片段：225、148、132、105、77).其可能的降解途径如图 5所示, 其中MG的中央CC键共轭显色基团结构可能被O^2-裂解从而产生氨基苯衍生物, 生成了N, N-二甲基苯胺(C₈H₁₁N)和4-(二甲基氨基)二苯甲酮(C₁₅H₁₅NO)(Hsieh et al., 2008).

3.4 影响因素研究 3.4.1 Cd²⁺去除的影响因素

为了探究MNMs对复合污染中Cd²⁺吸附的效果, 在温度分别为298、303、318 K, pH为6.5、7.0、7.5, MNMs初始投加量为0.5、1.0、1.5 g·L^-1, Cd²⁺初始浓度为10、20、30 mg·L^-1的条件下探究了不同条件因素对Cd²⁺吸附效果的影响.首先根据实验设计称取适量的Cd²⁺与MG同时投加到1.0 L的无机盐培养基溶液中, 超声分散30 min使其混合均匀, 然后分装在250 mL的锥形瓶中并按照上述实验条件分别投入适量的生物纳米材料MNMs, 随后放入转速为150 r·min^-1的恒温摇床中进行相同时间的振荡, 分别在5、10、15、20、25、55、85和115 min取样, 每个样品均通过0.45 mm有机滤膜过滤, 使用原子吸收光谱法对样品中Cd²⁺含量进行测定.

在图 6a中可得知随着温度的升高MNMs对Cd²⁺的吸附效果也增强, 在前25 min内, MNMs对Cd²⁺的吸附速率快速升高, 去除率可达到78.4%, 当吸附过程进行到85 min时达到平衡, 去除率可达到86.4%左右, 说明MNMs的温度适用范围比较宽；而体系pH对Cd²⁺吸附的影响较为明显, 当pH值升高, 溶液为弱碱性时MNMs对Cd²⁺吸附效果显著高于弱酸性和中性溶液(图 6b), 其原因由于Cd²⁺金属离子键配体数量的增加所致(Okuda et al., 2018).随着pH值的增加, H⁺的数量增加, 更多的可交换阳离子可用于Cd²⁺金属的结合能力, 而且Cd²⁺在水溶液中还有正电, MNMs可以通过静电作用吸附Cd²⁺, 此外MNMs的表面存在大量的含氧官能团, 它们与Cd²⁺发生了络合反应形成了络合物(Lv et al. 2013; Afroze et al. 2015a)；在图 6c中可知MNMs的投加量与吸附效果呈正相关关系, 是由于反应体系内的单位吸附位点提高, 使得Cd²⁺有更多的机会和MNMs接触从而提高了去除率；图 6d显示了Cd²⁺的不同初始浓度对吸附效果的影响, 在25 min前吸附效果相差不多, 但是在85 min平衡时Cd²⁺初始浓度为10 mg·L^-1的条件下去除率最高达到了83.2%, 是由于减少了Cd²⁺浓度的同时使得MNMs的吸附饱和能力提升(Afroze et al., 2016).

3.4.2 MG去除的影响因素

为了探究MNMs在不同影响因素下对复合污染中MG吸附和降解的效果, 设计初始条件为温度分别是298、303、318 K, pH为6.5、7.0、7.5, MNMs初始投加量为0.5、1.0、1.5 g·L^-1, MG初始浓度为50、70、90 mg·L^-1的条件下考察不同实验条件对MG吸附降解效果的影响.首先按照实验设计称取适量的Cd²⁺与MG同时投加到1.0 L无机盐培养基溶液中, 超声分散30 min使其混合均匀, 然后分装在250 mL的锥形瓶中并按照上述条件分别投入适量的生物纳米材料MNMs, 放入转速为150 r·min^-1的恒温摇床中进行相同时间的振荡, 分别在2、4、6、8、10、12、24、36、48以及60 h取样, 每个样品均通过0.45 mm有机滤膜过滤, 随后使用紫外分光光度计在618 nm波长下测量样品中MG溶液的吸光度, 计算MG被MNMs的去除效率.

由图 7a可得知在12 h前MNMs对MG的去除效率较快, 说明MNMs具有良好的吸附效率, 但是当吸附时间从12 h延伸至24 h时, MNMs对MG的去除速率由快速变为平缓, 在24 h后MNMs对MG的去除效率逐渐提升, 直到60 h时达到平衡, 去除效率达到87.9%.在此阶段中MNMs对MG的去除过程整体呈先快后慢的趋势, 其原因可能是MNMs的吸附逐渐达到饱和状态, 后期主要是依靠固定在生物纳米材料上面的伯克霍尔德菌对污染物进行降解作用.由于伯克霍尔德菌在308 K附近有较高的活性, 所以在此温度下MNMs对MG的降解效果最好；在图 7b中可知当环境pH达到7.5为弱碱性时, MNMs对MG的吸附降解效果有明显提升, 这是因为MG是带阳离子的染料, 随着溶液pH值的增加, 吸附剂的负电荷量也随之增多, 这样就导致吸附剂的静电力增大, 所以在pH值较高的环境下, 生物纳米材料对MG的去除率效率也较高(Zhao et al., 2011)；图 7c显示在12 h前同等浓度MG情况下当增加MNMs的投加量时, 吸附降解效果有明显提升, 是因为提高MNMs的投加量就提供了更多的吸附位点可以更好的吸附MG, 随后由于MNMs的投加量增多相应的固定的伯克霍尔德菌含量也增多, 在之后对MG的降解效率也有所提升；在图 7d中分析出MG的不同初始浓度对吸附效果也存在明显的影响, 在12 h前吸附效果已有明显差异, 在12~24 h阶段MG初始浓度为50 mg·L^-1时去除效率相比较其他两个初始浓度下的去除效率较高, 是由于污染物在低浓度下更容易与吸附位点相结合, 60 h平衡时MG初始浓度为50 mg·L^-1的条件下去除效率最高达到了87.9%(Mellefont et al., 2008).上述结果证实MNMs可以同时去除水体内的Cd²⁺和MG复合污染(Zhao et al., 2011; Afroze et al., 2016).

3.4.3 动力学分析

对于MNMs吸附Cd²⁺的吸附动力学拟合参数见表 1, 其中伪二级吸附动力学模型的R²高于伪一级吸附动力学模型的R², 并且都达到0.999, 证明MNMs对Cd²⁺的吸附过程符合伪二级吸附动力学.当温度从298 K上升至308 K, 反应速率从0.009 g·mg^-1·min^-1下降到0.004 g·mg^-1·min^-1, 平衡吸附量从84.034 mg·g^-1下降到81.976 mg·g^-1.该结果与此前温度条件实验结果相符, 表明MNMs对Cd²⁺的吸附为化学吸附(程迎等, 2012), 并且随着反应体系的温度上升, Cd²⁺对活性吸附位点的竞争减弱, 吸附速率变慢(Afroze et al., 2015b).

在表 2拟合数据中可以看出, MNMs吸附MG的过程伪二级动力学的R²(R²>0.99)均大于伪一级动力学的R², 所以MNMs对MG的吸附过程更偏向于伪二级吸附动力学.而当温度从298 K上升到303 K时, 理论平衡吸附量从41.322 mg·g^-1上升至45.249 mg·g^-1, 当温度继续上升理论吸附量下降到40.485 mg·g^-1.此结果与前期探索的单因素温度条件实验结果一致, 说明MNMs对MG的吸附主要为化学吸附, 该反应过程在一定的温度范围内为吸热反应(Liu et al., 2012).

从表 3中的动力学模型拟合数据可以看出伪一级降解动力学的R²更接近于1, 说明MNMs对MG的降解过程更符合伪一级降解动力学模型.随着温度从298 K升高到303 K, MNMs对MG的降解速率也从0.078 mg·L^-1·h^-1提高到0.118 mg·L^-1·h^-1, 之后温度继续升高至308 K降解速率下降到0.088 mg·L^-1·h^-1, 表明MNMs中的伯克霍尔德菌在303 K温度下活性最高, 对MG的降解效果最好(Li et al., 2011).

4 结论(Conclusions)

本研究以甘蔗渣还原液为绿色还原剂制备了B-RGO并固定伯克霍尔德菌的生物纳米材料在同时去除水溶液中MG和重金属Cd²⁺中起到显著效果.这是由于甘蔗渣还原液含有丰富的营养物质, 同时可以提供微生物生长繁殖所需要的碳源和氮源；其次, 分散的B-RGO具有良好的韧性和生物相容性, 能为微生物的负载提供稳定的表面载体支撑；另外, 甘蔗渣也是一种良好的天然生物质, 具有很好的生物相容性, 对微生物无害无毒.这些优势即可解决了目前生物修复技术中所亟需解决的微生物量不足, 保留时间短的问题.结果显示：

1) 在反应体系温度为303 K, pH为7.5, MNMs投加量为1.5 g·L^-1, MG和Cd²⁺初始浓度分别为50 mg·L^-1和10 mg·L^-1时, 在85 min和48 h后吸附-降解反应达到反应平衡, 水溶液中95.1%的MG和83.2%的Cd²⁺被MNMs吸附.

2) SEM-EDS图谱证明MNMs具有吸附Cd²⁺的能力, GC-MS分析证实MG最后被伯克霍尔德菌降解为N, N-二甲基苯胺(C₈H₁₁N)和4-(二甲基氨基)二苯甲酮(C₁₅H₁₅NO), 其降解途径可能是共轭显色基团结构裂解产生的氨基苯的衍生物.这些结果说明MNMs的孔洞结构和静电作用的功能性吸附并联合菌体的降解功能在去除污染物中起到关键作用.

3) MNMs对Cd²⁺和MG的吸附过程符合伪二级吸附动力学, 相关系数R²>0.99.MNMs对MG的降解过程符合伪一级降解动力学, 相关系数R²>0.99.说明MNMs对污染物的吸附主要为化学吸附.

本研究证实绿色还原氧化石墨烯负载伯克霍尔德菌所制备的生物纳米材料是一种具有去除染料废水中污染物和重金属良好效果的功能性复合纳米材料.该复合纳米材料制备过程简便, 经济性好, 去除效果显著的特点使其未来在工业印染废水处理工程中具有广阔的应用前景.