1 引言(Introduction)

4-氯-3-甲基苯酚(4-Chloro-3-methylphenol, PCMC)作为一种抗菌活性物质, 因具有高效、广谱、易获取等特点在个人护理品(Pharmaceuticals and Personal Care Product, PPCP)和纺织品的防腐中被广泛应用(Frasch et al., 2010；魏海峰等, 2018).随着PPCPs使用量的逐年递增(安婧等, 2009), 氯酚类防腐杀菌类活性物质经生活、医疗和工业用水等途径进入环境水体, 逐渐显现出对水生生态系统的影响, 如对鱼类造成肝毒性和生殖毒性等(孙胜香等, 2019).人群调查和队列研究证实该类物质可对人体造成较为显著的内分泌干扰作用(Yoon et al., 2014).因此, 美国食品药品监督管理局(FDA)于2016年逐步禁止了部分酚类抗菌活性物质在医药品和日化品中的添加(吴芳等, 2016).目前, 人们已在中国长江沿岸某化工园区土壤和底泥检出PCMC, 平均检出浓度分别为3.31 mg·kg^-1和3.92 mg·kg^-1(陈洁霞等, 2014)；在意大利湖泊地表水样中PCMC的检出浓度为12~33 ng·L^-1(Marchese et al., 2004).因此, 对尚在使用的氯酚类抗菌活性物质进行毒理学研究具有重要意义.

代谢组学是研究生物体内源性代谢物整体及其随内因和外因变化的科学(耿柠波等, 2016).通过监测内源性代谢物的变化可灵敏地指示和确证外来干扰物对有机体造成的毒性效应, 某些特定代谢物产生量的升高或降低可能标志着某些代谢通路的缺陷或某些信号转导途径的激活(付金等, 2019).因此, 代谢物的动态变化可以作为毒性效应的评价指标, 将其应用于污染物的毒性评价在技术上是可行的.高分辨质谱技术具有重复性好、分辨率高和覆盖范围广等优势, 已成为代谢组学研究的主流分析技术之一(Cao et al., 2018；殷丽蓉等, 2020).本研究拟采用超高效液相色谱三重飞行时间质谱(UHPLC-Triple-TOF-MS)技术结合XCMS、mzCloud和HMDB等数据库, 以及Metaboanalyst 4.0和SIMCA 14.1等软件获取有效且准确的内源小分子代谢物信息, 对PCMC毒性产生的机制进行分析.

斑马鱼(Danio rerio)作为水生脊椎动物, 具有与哺乳动物相似的心血管、造血、神经、代谢等系统, 在遗传、生理和生化方面与人类存在高度相似性, 目前已广泛应用于环境毒理学、食品科学和遗传学等领域(Garcia et al., 2016).因此, 本研究以斑马鱼为代谢组学研究的模式生物, 探讨PCMC对水生生物的毒性效应, 以期为多组学技术在毒理学方面的应用及抗菌活性物质的安全生产和使用提供支持和指导.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 仪器与试剂

仪器: 超高效液相色谱高分辨质谱采用UHPLC-Triple-TOF-MS系统, 其中, 超高效液相色谱系统(日本岛津)配有二元泵(LC-30AD)、柱温箱(CTO-30A)和自动进样器(SIL-30AC)；高分辨质谱为Triple TOF 5600+三重四级杆-飞行时间质谱仪(美国AB SCIEX), 采用Duospray离子源；UPLC ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)(美国Waters)；Milli-Q Advantage A10超纯水净化系统(美国Millipore)；离心机(上海Sigma)；涡旋混合器(美国Scientific Industries)；恒温振荡器(上海AISET)；BP211D型电子分析天平(德国Sartorius).

试剂: 乙腈和甲醇(色谱纯)购自美国Thermo Fisher Scientific公司, 甲酸(色谱纯)购自北京迪马科技有限公司, PCMC(纯度≥98%)、2-氯苯丙氨酸(纯度≥99%)均购自美国Sigma-Aldrich公司.

2.2 动物实验方法

成年3月龄AB系斑马鱼, 由河北医科大学实验动物中心提供.养殖水温为(28±1) ℃, pH为6.0~8.5, 光暗周期为14 h∶10 h, 保持氧气24 h不间断供给, 每日喂饲孵化新鲜的丰年虫卵1次, 及时清除排泄物, 保持水体清洁.试验前, 斑马鱼按以上条件驯化一周.

斑马鱼PCMC急性毒性试验: 参考GBT13267-1991采用半静水式进行试验.染毒开始前1 d停止喂食, 根据预实验结果在5 L纯水中设置6个PCMC暴露组, 浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·L^-1, 设3个平行, 共18组, 每组10条斑马鱼.每24 h更换一次PCMC溶液, 于24、48、72和96 h观察鱼的中毒症状并及时将死鱼捞出, 记录鱼的死亡数.采用直线内插法计算96 h半数致死浓度LC₅₀.

斑马鱼PCMC暴露的代谢组学试验: 参考水生生物毒性试验方法(周永欣等, 1989), 以LC₅₀的1/10作为实验浓度.选取3月龄健康斑马鱼60条随机分到6个鱼缸中, 每缸10条, 分别为空白对照组和PCMC浓度为0.114 mg·L^-1的暴露组, 每个浓度3个重复, 实验为期60 d.每次喂食2 h之后换新染毒液, 期间及时清除死亡斑马鱼.暴露结束后, 每组随机获取18条斑马鱼, 每两条作为一个样本进行处理分析.斑马鱼经冰上麻醉和漂洗后用滤纸吸干体表水分, 于液氮中速冻研磨转移至离心管中, 加入预冷的20 μL 0.1 mg·mL^-1 2-氯苯丙氨酸作为内标和500 μL甲醇-水(60∶40, V/V)提取液.涡旋1 min, 冰水浴超声2 min, 振荡萃取20 min使代谢物充分溶出.4 ℃、14000 r·min^-1下离心5 min, 取上清液过0.22 μm滤膜后上机检测, 每个样本取50 μL混合制成质量控制样品(pooled QC).

2.3 检测条件

色谱条件: 流动相为0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B), 流速为0.26 mL·min ^-1；样品室温度为16 ℃, 柱温箱为40 ℃, 进样体积为5 μL.梯度洗脱程序如下: 0~1.0 min, 0 B；1.1~7.0 min, 0~40% B；7.1~9.0 min, 40%~85% B；9.1~14.0 min, 85%~100% B；14.1~17.0 min, 100% B；17.0~17.1 min, 100%~0 B；17.1~20 min, 0 B以修复平衡色谱柱.

质谱条件: 采用UHPLC-Triple-TOF-MS系统, 在正、负离子模式下分别进行扫描, 母离子和子离子的扫描范围分别为50~1500 Da和30~1200 Da.相关优化的质谱参数见表 1.

2.4 数据处理

采用XCMS软件对数据进行归一化和峰值采集后, 经SIMCA 14.1软件进行无监督的主成分分析(PCA), 观察空白对照组和暴露组斑马鱼样本是否明显分离.以p < 0.05, log₂(Fold change)>1.5或 < -1.0作为潜在差异代谢物的筛选条件.通过有监督的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对数据标度化和中心化处理, 差异代谢物以相关系数>0.5和VIP值(Variable importance in the projection)>1.0进一步筛选.将差异物的一级和二级质谱及离子强度等信息导入mzCloud和HMDB 4.0中进行鉴定.将确定的潜在差异代谢物导入MetaboAnalyst 4.0进行层次聚类分析(HCA)和通路分析.

3 结果(Results) 3.1 PCMC暴露对斑马鱼的急性毒性和半数致死浓度

预实验结果显示, 暴露96 h后, PCMC浓度大于5.0 mg·L^-1时斑马鱼全部死亡；PCMC浓度为2.0 mg·L^-1时, 斑马鱼在24、48、72和96 h的平均死亡率分别36.7%、56.7%、70.0%和100%.因此, 本研究减小暴露浓度间隔, 进行0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·L^-1 PCMC的96 h急性毒性实验, 结果见表 2.由表可知, 随暴露时间延长及暴露浓度增加, 斑马鱼逐渐出现中毒症状和死亡现象, 空白对照组斑马鱼在96 h内无中毒和死亡现象, 活动能力和心跳频率表现正常.由表 3可知, PCMC暴露24、48、72和96 h时, 斑马鱼的LC₅₀值依次为4.42、1.97、1.39和1.14 mg·L^-1, 表明PCMC对斑马鱼的毒性随着暴露时间的延长而显著增加.选取0.114 mg·L^-1作为斑马鱼PCMC代谢组学分析的暴露浓度.

3.2 代谢物图谱分析

对QC样本进行PCA-X建模分析, 结果均在2倍标准偏差(Standard Deviation, STD)范围内, 表明仪器和方法稳定性可满足实验要求.实验组结果如图 1所示, 两种离子模式下空白对照组和暴露组均完全分开.在正、负离子模式下均筛选出4个主成分, 累计贡献率(R2Xcum)和模型预测能力(Q2cum)分别为53.76%和32.56%(正离子模式)及56.19%和33.61%(负离子模式).PCA结果表明, 在代谢水平上可观察到PCMC暴露对斑马鱼产生了影响.利用OPLS-DA的Pareto scaling(Par)对数据中心化后进行归一化.正离子模型参数为R2Xcum=99.83%和Q2cum=97.08%(图 2a), 负离子模型参数为R2Xcum=99.85%和Q2cum=95.80%(图 2b).横坐标表示主要成分的得分值, 用于指示组间的差异, 纵坐标表示正交成分的得分值, 用于指示组内的差异.结果显示, 空白对照组和暴露组的组间差异明显.置换验证后两种离子模式下R2回归线斜率大于1且Q2值构成的回归线截距均小于0.05, 表明所建模型有效.结果表明, PCMC可导致斑马鱼体内内源性物质含量发生变化.

3.3 差异代谢物及代谢通路分析

根据OPLS-DA模型的分析结果, 结合非靶向代谢组学分析限制条件对差异代谢物进一步筛选.经HMDB和mzCloud比对共筛选出内源性差异代谢物20种, 其中, 上调物质9种, 下调物质11种(表 4).20个代谢差异物通过MetaboAnalyst 4.0平台HCA绘制可视化的热图, 横轴表示斑马鱼样品, 纵轴表示差异代谢物, 颜色代表差异代谢物的相对丰度, 系统树图表示18个样本之间的聚类关系.从热图中可以看出, 空白对照组和PCMC暴露组明显分离, 两组间差异代谢物的相对丰度差异明显(图 3).

利用MetaboAnalyst 4.0分析平台, 选择斑马鱼为分析模型进行代谢通路分析.上述20种潜在生物标志物主要指向6条代谢通路, 分别是嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、淀粉和蔗糖代谢、组氨酸代谢、丙酮酸代谢及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(表 5).

4 讨论(Discussion)

PCMC暴露可使斑马鱼体内嘌呤、氨基酸、糖类和甘油磷脂等代谢物含量发生显著变化.嘌呤在能量供应、代谢调节及组成辅酶等方面起着十分重要的作用(李婷婷等, 2018).PCMC暴露可引起斑马鱼嘌呤代谢异常, 黄嘌呤和胞嘧啶核甙二磷酸胆碱水平上调, 这与Zhou等(2018)研究中小鼠暴露于4-叔辛基苯酚后体内嘌呤含量变化趋势一致.黄嘌呤作为一种潜在毒物可引起脑积水和腺苷激酶缺乏症等疾病(张旸等, 2013), 同时机体应激反应可使胞嘧啶核甙二磷酸胆碱水平上调, 对斑马鱼机体抑制神经损伤和减少细胞凋亡具有重要意义(Gutiérrez-Fernández et al., 2012).肌苷酸、5′-腺苷一磷酸和肌苷三磷酸作为嘌呤代谢的中间体, 其含量的相对降低对信号传导和酶促反应产生消极影响.此外, 嘌呤代谢异常也可导致斑马鱼体内尿酸升高与糖耐量受损(董立新等, 2012；丁慧等, 2013), 这与表 5中淀粉和蔗糖代谢通路异常密切相关.

6-磷酸葡萄糖经葡萄糖激酶催化葡萄糖磷酸化生成, 是糖酵解途径的第一步反应(杨正久等, 2013).与对照组相比, 暴露组斑马鱼体内6-磷酸葡萄糖水平下降, 可阻碍丙酮酸的生成(张杏丽等, 2019), 与上述嘌呤代谢异常和丙酮酸水平下调结果一致.丙酮酸代谢紊乱会引起肾、心等重要器官的功能衰弱、乳酸堆积酸中毒、肌肉损伤等(马延超等, 2004).脂肪酸的生物合成所需碳源来自乙酰CoA, 乙酰CoA是由线粒体中丙酮酸氧化脱羧生成, 因此, 丙酮酸代谢紊乱会导致脂质代谢异常.磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)是甘油磷脂代谢的重要产物, 经磷酸二酯酶A2水解分别形成溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱.磷脂酰胆碱能增加血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(Schertzer et al., 2008).PCMC暴露组斑马鱼体内的磷脂酰胆碱含量较对照组升高, 这与Zhang等(2016)采用防腐剂壬基酚对大鼠暴露后甘油磷酸胆碱的结果一致, 说明可能与胆固醇含量变化密切相关.溶血磷脂酰胆碱的变化可能与高脂血症的发病机制有关(Zhao et al., 2015；张晓松等, 2018), 故推测斑马鱼体内LysoPC(17∶0/0∶0)的升高与血脂水平升高有关.

酪氨酸是一种重要的营养必需氨基酸, 主要依靠肌肉蛋白分解后生成, 且不能被骨骼肌再吸收, 因此, 酪氨酸可反映肌肉中蛋白质的净降解情况.PCMC暴露组斑马鱼体内酪氨酸水平下降, 这与柳春红等(2016)针对防腐剂壬基酚的研究结果一致, 说明逆境胁迫可导致斑马鱼活力下降.组氨酸具有抗氧化、抗炎和抗分泌的特性(Hase et al., 2015), PCMC暴露导致斑马鱼体内组氨酸水平升高, 说明机体可通过组氨酸抵御外界不良环境的影响.

5 结论(Conclusions)

PCMC暴露可导致斑马鱼体内多种内源性代谢物, 包括嘌呤、氨基酸、丙酮酸和脂质等相对含量发生变化, 进而对斑马鱼产生毒性效应.其中20种代谢物的含量变化较为显著, 可作为PCMC暴露后水生生物机体代谢异常的潜在生物标志物.应用代谢组学相关技术研究防腐杀菌类物质对生态环境的潜在危害可为多组学研究提供新的策略, 也为指导实际生产生活中防腐杀菌剂的使用提供了数据支持.本实验应用代谢组学技术在差异代谢物的定量上存在局限性, 可结合系统生物学中的基因组学、转录组学和蛋白组学等技术, 使结果更加准确和可靠.