1 引言(Introduction)

大量野外和室内实验证明穗花狐尾藻(Myriophyllum spicatum)等沉水植物可以通过释放化感物质抑制藻类生长(Nakai et al., 1999; Körner et al., 2002; Gao et al., 2017a), 相对于绿藻等真核藻类, 蓝藻尤其是铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)最易受到抑制(Zhu et al., 2010; Švanys et al., 2014).沉水植物体内产生并能释放到周围水环境中的化感活性物质主要为脂肪酸类和酚酸类物质(高云霓等, 2016).其中, 活性最高、研究最深入的是穗花狐尾藻释放的壬酸和焦酚, 对铜绿微囊藻生长的半抑制浓度(EC₅₀)分别为0.50 mg · L^-1和0.65 mg · L^-1(Nakai et al., 2000；2005).壬酸通过破坏藻细胞膜和胞内结构抑制目标藻类生长(Wang et al., 2013).焦酚及其自氧化产物可抑制铜绿微囊藻光合系统结构和功能、诱导藻细胞程序性死亡、调控毒素合成相关基因转录水平(Zhu et al., 2010; Wang et al., 2016; Lu et al., 2017).相对于羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)等绿藻, 焦酚对铜绿微囊藻等蓝藻的抑制作用更强(Zhu et al., 2010).相对于非产毒铜绿微囊藻, 焦酚对产毒铜绿微囊藻的抑制作用更强(Gao et al., 2020).植物化感物质抑藻作用的选择性为有害蓝藻的靶向控制提供了可能, 但植物化感物质投入水生态系统中, 对浮游动物等其他水生生物的影响还不清楚, 不利于植物化感物质控藻技术生态安全性的科学评价.

自然水体中沉水植物本身可以为浮游动物提供栖息地, 穗花狐尾藻种植围隔中蓝藻生物量及其所占比例显著低于对照, 但枝角类、轮虫和纤毛虫等浮游动物生物量与对照组相比无明显区别(Švanys et al., 2014).穗花狐尾藻分泌物对大型溞(Daphnia magna)的生活史无明显影响(Cerbin et al., 2007).水蕴草(Egeria densa)分泌的化感物质可显著增加多种枝角类浮游动物丰度(Espinosa-Rodríguez et al., 2017).沉水植物化感物质的释放具有持续低剂量特性(Gao et al., 2017b), 因而沉水植物重建和恢复对浮游动物等其他水生生物无显著不利影响, 表现出良好的生态安全性和环境友好性.但针对可以商品化获取的植物化感活性物质, 若大量用于富营养化水体中有害蓝藻控制, 是否仍具有良好的生态安全性？这个问题的答案直接决定植物化感物质控藻技术推广应用的有效范围和合理时机.水生植物化感物质亚油酸、水杨酸和对羟基苯甲酸对多刺裸腹蚤(Moina macrocopa)的EC₅₀明显大于对池塘水华混合藻类的EC₅₀, 表明3种化感物质在可除藻的浓度范围内对环境的不良影响可能较小, 有开发生物除藻剂的潜能(郑春艳等, 2010).对羟基苯甲酸和水杨酸在其最佳抑藻浓度对鲤鱼无毒性作用(张庭廷, 2008；吴安平等, 2008).10 mg · L^-1小檗碱对蓝藻生物量96 h抑制率为63.6%, 但对草金鱼(Carassius aurutus)的存活率无影响(毕相东等, 2012).以上急性毒性试验初步证明植物化感物质在其有效抑藻浓度范围对水生动物生长和存活的影响较小, 但对水生动物的慢性毒性和繁殖毒性还不清楚.

大型溞是一种广布性小型浮游甲壳类动物, 是全球淡水食物链中不可或缺的组成成分(刘建梅等, 2015), 也是一种在国际上公认并广泛用于化学物质环境风险评估的标准毒理实验生物(陈丽萍等, 2018)(Lee et al., 2019).自1978年被欧盟和美国资源与环境保护局(EPA)正式确认使用并作为毒理生物实验模型以来, 大型溞以其实验方法简便、毒物敏感、生长快和繁殖量高等多种优点, 受到科学界的普遍关注和广泛应用(范文宏等, 2009；Hu et al., 2018).因此, 本研究以大型溞为受试生物, 选择沉水植物穗花狐尾藻典型化感物质壬酸和焦酚, 通过48 h急性毒性试验和21 d慢性毒性实验, 初步评估壬酸和焦酚对浮游动物生长和繁殖的毒性效应, 评价其用于藻华控制的生态安全性, 为壬酸和焦酚等植物化感物质用于有害蓝藻靶向防治技术研发和应用提供基础数据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验动物

实验所用大型溞(D. magna)购自华中农业大学水产学院, 参考GB/T 16125—2012标准方法在恒温光照培养箱(MGC-800BP-2, 莱福, 宁波)中驯养, 培养温度为23~25 ℃, 光暗比为12 h : 12 h, 光照强度为2000 lx, 饵料为实验室BG11培养基纯培养的普通小球藻(Chlorella vulgaris).驯养水为曝气24 h的自来水, pH值为7.5~7.6, 电导率为378~380 μS · cm^-1, 溶解氧为8.5~8.6 mg · L^-1, 硬度为0.72 mmol · L^-1.正式实验选用活泼健康、体型均匀、溞龄为24 h以内的幼溞.急性毒性实验期间不投喂饵料, 慢性毒性实验以普通小球藻浓缩液投饵, 投加到实验系统的藻细胞OD₆₈₀为0.02.

2.2 实验设计 2.2.1 大型溞急性毒性实验

参照OECD202(Organization for Economic Co-operation and Development, 2004)和GB/T16125—2012(国家环境保护总局, 2012)的方法开展壬酸(阿拉丁, 上海)和焦酚(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)对大型溞的急性毒性实验.通过预实验确定实验溶液浓度梯度, 壬酸分别为15、30、45、60、75、90 mg · L^-1, 焦酚分别为10、20、30、40、50 mg · L^-1, 同时设置纯水和二甲基亚砜(DMSO, 0.01%)助溶剂对照组.每个浓度3个平行, 每个锥形瓶中10只幼溞, 实验周期为48 h, 期间未进食, 受试物溶液未更新.分别于暴露24 h和48 h观察和记录每个测试组中大型溞的死亡数, 计算各处理组的致死率、壬酸和焦酚半致死浓度LC₅₀和安全浓度(SC).

2.2.2 大型溞慢性毒性实验

参照OECD211(Organization for Economic Co-operation and Development, 1998)和GB/T21828—2008(国家环境保护总局, 2008)的方法, 开展壬酸和焦酚对大型溞的慢性毒性实验.参考壬酸和焦酚对大型溞急性毒性实验结果, 选取对大型溞生长无明显影响的安全浓度范围.为便于比较, 壬酸和焦酚浓度均设为0.25、0.5、1.0、2.0 mg · L^-1, 同时设置纯水和二甲亚砜(0.01%)助溶剂对照组.每个浓度10个平行, 每个锥形瓶中1只幼溞, 实验期间以浓缩的小球藻作为饵料投饵, 每天定时更新一次溶液, 实验周期为21 d.每天记录死亡的亲溞数和出生的幼溞数、蜕皮数、第一次产溞的时间, 并使用光学显微镜(MoticBA210, 厦门)在10倍镜下测量21 d亲溞体长(初始体长的均值为0.86 mm).实验结束后, 计算壬酸和焦酚作用下大型溞的净增殖率、世代时间和内禀增长率.

2.3 数据处理

运用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析方法确定不同浓度的壬酸和焦酚对大型溞生长繁殖影响的差异显著性.运用Probit模块计算壬酸和焦酚对大型溞的24 h-LC₅₀、48 h-LC₅₀和21 d-LC₅₀, 并进一步按照式(1)计算壬酸和焦酚对大型溞的安全浓度(SC)(魏杰等, 2019), 按照式(2)~(4)分别计算大型溞的世代时间(T, d)、净增殖率(R₀)、内禀增长率(r_m)(史文等, 2009).

(1)

(2)

(3)

(4)

式中, x为年龄, 以日龄表示, l_x为x龄的存活率, m_x为x龄的生殖率.

3 结果(Results) 3.1 壬酸和焦酚对大型溞的急性毒性效应

无壬酸添加的纯水和助溶剂对照组中24 h大型溞没有死亡, 48 h时致死率低于6.67%.15、30、45、60、75、90 mg · L^-1壬酸处理大型溞24 h, 致死率分别为16.67%、30.00%、26.67%、33.33%、43.33%、73.33%, 48 h时分别为26.67%、40.00%、50.00%、50.00%、66.67%、96.67%(图 1a).大型溞致死率随壬酸溶液浓度增加和暴露时间延长而增加.壬酸对大型溞24 h和48 h的LC₅₀分别为75.08 mg · L^-1和38.55 mg · L^-1, 安全浓度为3.05 mg · L^-1.

无焦酚添加的纯水和助溶剂对照组中48 h内大型溞没有死亡.10、20、30 mg · L^-1焦酚处理组24 h大型溞致死率分别为3.33%、53.33%、93.33%, 48 h时分别为6.67%、96.67%、100%.焦酚浓度达到40 mg · L^-1, 大型溞在24 h内即全部死亡(图 1b).焦酚对大型溞24 h和48 h的LC₅₀分别为18.89 mg · L^-1和13.71 mg · L^-1, 安全浓度为2.17 mg · L^-1.

3.2 壬酸和焦酚对大型溞的慢性毒性效应

经过21 d生长, 纯水和助溶剂对照组大型溞的平均体长增至2.62 mm, 增长3倍.添加壬酸和焦酚的处理组中, 大型溞体长增幅随壬酸和焦酚浓度增加而减小, 但与对照组间无显著差异(p>0.05).21 d后, 0.25、0.5、1.0、2.0 mg · L^-1壬酸处理组大型溞的平均体长分别为2.63、2.61、2.56、2.52 mm, 焦酚处理组大型溞的平均体长分别为2.60、2.51、2.51、2.48 mm(图 2a).纯水和助溶剂对照组大型溞平均蜕皮次数为10次, 壬酸和焦酚处理组大型溞蜕皮次数随物质浓度增加呈轻微下降趋势, 但均不低于9次, 与对照组间均无显著差异(p>0.05, 图 2b).

如图 3a所示, 纯水和助溶剂对照组中亲溞分别在8.6 d和8.8 d第一次产溞, 0.25、0.5、1.0、2.0 mg · L^-1壬酸处理组亲溞第一次产溞时间分别为9.0、9.9、10.6、10.8 d, 焦酚处理组分别为9.1、10.4、10.7、11.0 d.浓度为0.5~2.0 mg · L^-1的壬酸和焦酚处理组, 亲溞第一次产溞时间显著长于对照组(p < 0.05).如图 3b所示, 纯水和助溶剂对照组21 d内亲溞的平均产溞个数为35个.1.0、2.0 mg · L^-1壬酸处理组亲溞的产溞个数明显减少, 分别为29和22个, 与对照组间存在显著差异(p < 0.05).0.5、1.0、2.0 mg · L^-1焦酚处理组亲溞的产溞个数分别为30、28和22个, 与对照组间存在显著差异(p < 0.05).当壬酸和焦酚浓度为2.0 mg · L^-1时, 对大型溞产溞个数抑制率分别为38.01%和37.81%.

慢性毒性实验中, 助溶剂对照组中大型溞平均世代时间、净增殖率和内禀增长率平均值分别为15.02 d、35.38、0.24, 与纯水对照组无显著差异(p>0.05).壬酸和焦酚处理组大型溞平均世代时间随处理浓度增加而增加, 净增殖率和内禀增长率均随处理浓度增加而降低.2.0 mg · L^-1壬酸和焦酚处理组大型溞的平均世代时间最长, 分别为16.60、16.23 d, 净增殖率最低, 分别为20.38和21.63, 抑制率分别为42.40%和38.86%, 内禀增长率也最低, 分别为0.18和0.19, 对应的抑制率分别为25.00%和20.83%(表 1).壬酸和焦酚浓度不低于0.5 mg · L^-1时, 大型溞世代时间和内禀增长率与对照组差异显著(p < 0.05).壬酸浓度不低于0.25 mg · L^-1、焦酚浓度不低于1.0 mg · L^-1时, 大型溞净增殖率与对照组差异显著(p < 0.05).

4 讨论(Discussion)

壬酸和焦酚主要是沉水植物穗花狐尾藻释放到水环境中的两种典型化感物质.已有研究表明, 壬酸和焦酚对铜绿微囊藻生长抑制的EC₅₀分别为0.5 mg · L^-1和0.65 mg · L^-1(Nakai et al., 2000；2005).焦酚对铜绿微囊藻生长和光合作用的抑制作用显著高于对绿藻羊角月牙藻的抑制, 有效抑制浓度相差近5倍(Zhu et al., 2010), 说明化感物质焦酚对铜绿微囊藻等蓝藻表现出抑制选择性.本研究中壬酸和焦酚对大型溞抑制的48 h-LC₅₀分别为38.55 mg · L^-1和13.71 mg · L^-1, 均显著高于其有效抑藻浓度, 说明壬酸和焦酚在其有效抑藻浓度范围内不会对大型溞的存活产生明显影响.传统杀藻剂硫酸铜中金属Cu²⁺对大型溞的48 h-LC₅₀是0.12 mg · L^-1(刘坤等, 2009), 纳米氧化锌对大型溞的48 h-LC₅₀是3.0 mg · L^-1(刘倩等, 2019).根据《化学品分类和标签规范-第28部分：对水生环境的危害》中物质对甲壳纲动物的急性水环境毒性的分级标准(48 h-LC₅₀≤1 mg · L^-1为I级, 1 mg · L^-1 < 48 h-LC₅₀≤10 mg · L^-1为II级, 48 h-LC₅₀ >10 mg · L^-1为III级), 硫酸铜属于毒性I级, 纳米氧化锌属于毒性II级, 壬酸和焦酚均属于毒性III级.植物化感物质水杨酸和对羟基苯甲酸对多刺裸腹蚤的毒性也属于III级(郑春艳等, 2010), 初步说明植物化感物质对浮游动物的生长和存活危害较小, 有望用于铜绿微囊藻等有害蓝藻的靶向生态防控.

壬酸和焦酚对大型溞繁殖过程的影响比其对大型溞存活率的影响更大.慢性毒性试验中, 2.0 mg · L^-1壬酸和焦酚对大型溞体长和蜕皮次数无显著影响(p>0.05), 而0.5 mg · L^-1浓度水平下即显著影响大型溞繁殖行为(p < 0.05).世代时间指种群中子代从母体出生到子代再产子的平均时间, 内禀增长率反映的是在无限生存空间和食物摄取量的条件下, 在没有天敌的环境中, 一个种群扩大繁殖的能力, 是衡量种群生存和繁殖的综合性指标(牛翠娟等, 2015).然而种群在经历一个世代后数量的净增长率是净增殖率(单访等, 1988；徐彩霞等, 2008).相同浓度水平下, 壬酸和焦酚对大型溞净增殖率的抑制作用强于对大型溞内禀增长率的影响, 进一步说明壬酸和焦酚对大型溞繁殖过程的影响程度强于对其存活的影响.这与接触性除草剂敌稗、溴系阻燃剂四溴双酚A和三溴苯酚、铜离子等对大型溞的毒性效应具有一致性(Villarroel et al., 2003；张榜军等, 2009；刘建梅等, 2015).由此可见, 繁殖毒性也应该成为考察植物化感抑藻物质生态安全性的重要内容, 同时也为植物化感物质控藻应用提供科学指导.若采用壬酸和焦酚控制水域有害藻类, 则应在物质降解和作用减弱后, 适当增殖水域浮游动物生物量, 恢复其自然繁殖行为, 从而维持生态系统平衡.另一方面, 则有必要通过原位试验在更大尺度水平系统评估壬酸和焦酚对浮游动物生长繁殖的影响, 考察浮游动物繁殖行为的恢复能力.

焦酚对大型溞48 h的LC₅₀显著低于壬酸, 但慢性毒性实验中, 从大型溞世代时间、净增殖率和内禀增长率的数据能明显看出, 壬酸对大型溞繁殖毒性的影响略大于焦酚.双氧水浓度在1.25 mg · L^-1以下对大型溞致死时间、首次产溞时间无影响, 在0.63 mg · L^-1以下总产溞数与对照无差异, 但在0.32 mg · L^-1以上即对大型溞生长产生显著影响(Meinertz et al., 2008).物质结构和物化性质是影响其毒性效应与模式的重要因素(Hayashi et al., 2015).Khan等(2019)采用定量构效关系(QSAR)模型分析了400余种常用农用杀菌剂、杀虫剂和除草剂对大型溞的毒性, 发现极性、碳链长度、取代基等物质构型与其毒性显著相关.QSAR模型分析结果显示, 苯并恶嗪酮类化感物质及其衍生物对大型溞具有相似的毒性作用模式(Lo Piparo et al., 2006).壬酸属于中链脂肪酸, 焦酚属于多酚类物质.两种物质的结构特征不同, 化学特性也存在区别, 如壬酸和焦酚的脂水分配系数(logP)分别为3.25和0.06, 酸度系数(pKa)分别为4.78和9.28(源自SciFinder学术).前期研究已发现两种物质抑制铜绿微囊藻的分子靶标不同(Zhu et al., 2010; Wang et al., 2013; Wang et al., 2016; Lu et al., 2017).本研究显示, 壬酸和焦酚对大型溞的毒性效应和模式也存在不同, 但化感物质结构性质与其对大型溞毒性效应和作用机制的规律仍不明确, 需要进一步扩大化感物质研究种类, 结合大型溞在分子和细胞水平的响应, 采用模型预测和实验验证相结合的方法深入研究.

5 结论(Conclusions)

1) 急性毒性实验中, 壬酸对大型溞24 h和48 h的LC₅₀分别为75.08 mg · L^-1和38.55 mg · L^-1, 焦酚对大型溞24 h和48 h的LC₅₀分别为18.89 mg · L^-1和13.71 mg · L^-1, 壬酸和焦酚对水生环境的毒性分级都属于III级, 但焦酚的毒性高于壬酸.

2) 慢性毒性实验中, 2.0 mg · L^-1壬酸和焦酚对大型溞的体长和蜕皮次数等生长指标无显著影响, 但在高于0.5 mg · L^-1浓度水平, 对大型溞繁殖行为产生显著影响.大型溞的净增殖率和内禀增长率均随着壬酸和焦酚浓度的增加而逐渐减小.壬酸和焦酚对大型溞的繁殖毒性强于生长毒性.