2020, Vol. 40
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2. 南京信息工程大学雷丁学院, 南京 210044
2. Reading Academy, Nanjing University of Information Science&Technology, Nanjing 210044
城市雨水管网系统是城市主要的排水通道之一, 对预防城市洪涝灾害意义重大.在大气干湿沉降、降雨淋溶、径流冲刷等一系列自然因素的作用下, 以颗粒物为主的多种污染物会随下垫面雨水径流排入城市雨水管网系统(Moore at al., 2017), 并在城市雨水管网系统中沉积.例如, 有调查发现北京城区部分典型雨水排水管道中, 有近80%的管道存在不同程度的沉积物沉积现象(李海燕等, 2011).这一沉积现象导致城市雨水管网沉积物中赋存的污染物种类很多, 如各种有机物等(李昆等, 2016).研究表明, 城市暴雨事件中随雨水径流进入受纳水体的污染负荷有30%~80%源于干期管道沉积物(Fan, 2004).雨水管网沉积物在暴雨时会被径流冲刷而输出并进入受纳水体, 从而增加城市水环境生态风险.
近年来, 抗生素耐药基因(ARGs)在河湖水体/沉积物、土壤等环境介质中越来越多地被发现(Qiao at al., 2018), 作为面源污染重要载体的雨水径流是其传播扩散的主要路径之一(Joy at al., 2013; Chen at al., 2018).最近的研究发现, 暴雨径流中存在丰度显著的四环素类和磺胺类ARGs污染(Garner at al., 2017).由于与颗粒物之间较强的粘附性(Mao at al., 2014; McEachran at al., 2015), 暴雨径流中游离ARGs、携带ARGs的抗生素耐药菌(ARB), 均有可能随径流颗粒物沉积在雨水管道中, 使得城市雨水管网沉积物成为ARGs污染的“汇”.然而, ARGs在城市雨水管网系统中的污染特性尚未见系统研究报道.
环境介质中ARGs污染具有丰富的多样性.据统计, 在各类环境介质中已检出超过100种ARGs, 比较典型的有β-内酰胺类、四环素类、卡那霉素类、磺胺类等ARGs(Mckinney et al., 2010; Leclercq et al., 2013).抗生素类型不同, 其ARGs种类也不同, 如抗β-内酰胺类ARGs包含blaSHV、blaSPM和blaACT等基因型(Graham et al., 2016), 抗四环素类ARGs以tetR基因型为主(Zhou et al., 2017).此外, 同种类ARGs在不同环境介质中的丰度或检出频率也不尽相同(Qiao et al., 2018).细菌耐药性程度是判断ARB及其ARGs污染现状的重要依据.研究表明, 通过可培养ARB数量、耐药率及最小抑制浓度等指标可判断环境中各类菌株的耐药性(Rizzo et al., 2013; Qiao et al., 2018).可见, 借鉴前人对其他环境介质中ARGs种类、细菌耐药性程度等的研究思路, 开展ARGs在城市雨水管网沉积物中的污染特性研究具有理论上的可行性.
另外, 输入来源对环境中ARGs种类及其丰度等污染特征有很大影响.例如, 长期施用粪肥的设施菜地土壤中ARGs的种类和丰度直接与施用粪肥本身有很强的关联性(Zhao et al., 2017).众所周知, 城市雨水管网沉积物中的污染物起因于降雨期暴雨径流污染物经由雨水管网系统输出过程中的沉积(Zgheib et al., 2012; 金鹏康等, 2016), 而暴雨径流污染物与人类生产、生活活动有很大的关联性(Liu et al., 2018).由于不同城市功能区的人类活动差异, 其所引起的大气气溶胶、下垫面表面尘、汇水区域表层土壤状况等也不尽相同(Mao et al., 2014; Allen et al., 2016), 势必导致雨水管网中沉积物成分和颗粒组成因城市功能区域的不同而存在差异, 这能被“不同汇水功能区域的排水管道内沉积物厚度不同(李昆等, 2016)”的研究结果所证明.因此, 按城市不同功能区开展雨水管网沉积物中典型ARGs污染特性的研究更为合理、全面.
因此, 本研究选择南京江北新区3种不同功能区(文教区、交通区及商业区)分流制雨水管网沉积物作为研究对象, 以β-内酰胺类和四环素类两类典型ARGs为目标污染物, 考察各功能区雨水管网沉积物中细菌耐药性, 分析典型ARGs的组成种类及其丰度差异, 重点探讨典型ARGs在不同粒径颗粒中的分布特征, 以期为城市雨水管网沉积物中ARGs污染的环境风险评估及其控制提供理论和数据支持.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 研究区域概况根据前人对城市不同功能区沉积物的研究(娄阳等, 2015; 刘亚纳等, 2016), 本研究选取南京江北新区不同典型功能区(文教区、交通区及商业区), 具体采样点如图 1所示.其中, 文教区采样点位于南京信息工程大学西苑2幢宿舍周围(32°12′18″N, 118°42′2″E), 交通区采样点位于路黑路与中轴路交叉口(32°11′21″N, 118°40′25″E), 而商业区采样点位于南京市大桥北路弘阳广场(32°8′39″N, 118°43′2″E).
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| 图 1 研究区域采样点位置分布 Fig. 1 Map showing the sample sites in the study areas |
于2019年6—8月, 利用预先灭菌(121 ℃, 15 min)的不锈钢采样套件对位于各功能区分流制雨水管网收集口内200 cm范围内的表层沉积物样品进行采集.根据中国天气网的天气预报情况, 采样工作均在每次降雨开始前的1 h内完成.在研究过程中, 共计采样9次, 且每个采样点均采集3个平行样, 采样日期及其对应的干期长度间隔如表 1所示.每次采集的样品均存放于无菌密封袋并置于冰盒采样箱, 及时运回实验室进行处理分析.各采样点每次取样质量均大于20 g, 经无菌环境下冷冻干燥后, 于-80 ℃深冷冰箱保存备用.
| 表 1 采样日期及其干期长度 Table 1 Sampling date and length of dry period |
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根据沉积物颗粒粒径的相关研究结论(Herngren et al., 2005; 刘旭阳等, 2015), 将本研究雨水管网沉积物颗粒粒径划分为4个区间：＜75 μm、76~150 μm、151~300 μm、＞300 μm.利用3种不同规格(300、150、75 μm)的不锈钢筛网对沉积物进行粒度分级, 每次过筛前, 均对筛网在121 ℃、30 min条件下进行灭菌处理.
2.4 耐药性检测方法 2.4.1 培养基配置方法LB固体培养基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 g、超纯水1000 mL, 调节pH值为7.2~7.4, 高压灭菌(121 ℃, 40 min).
抗生素选择性培养基：在LB固体培养基灭菌冷却至约60 ℃后加入四环素, 其终浓度为10 mg·L-1；另取LB固体培养基加入氨苄青霉素, 终浓度为50 mg·L-1.
2.4.2 可培养细菌及可培养耐药菌计数方法采用抗生素抗性培养基筛选法检测沉积物中的抗性细菌数, 采用异养菌平板计数法(HPC)计算沉积物中的活菌数(cfu·g-1).称取各粒径沉积物0.2 g置于2 mL已灭菌的0.9% NaCl溶液中, 涡旋混匀后对沉积物悬液进行梯度稀释, 稀释倍数按不同功能区可培养微生物数量而定.吸取200 μL悬液均匀涂布于两类选择性抗生素平板上和未添加抗生素的平板上, 每组做3个平行实验, 37 ℃恒温培养, 培养时间视菌落的生长情况而定, 最后进行菌落计数, 菌数计算公式如(1)所示.
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(1) |
式中, N为可培养细菌数(可培养耐药菌数), k为稀释倍数, n为无抗生素平板(抗生素平板)生长菌落平均值.
2.5 高通量测序方法所有样品均送至安徽微分基因科技有限公司进行测序.本研究选取β-内酰胺类ARGs(blaTEM、blaOXA1和blaSHV)和四环素类ARGs(tetA、tetC、tetM、tetO、tetQ和tetW)进行检测.为了消除因样本环境中微生物量的不同而引起的差异, 对16S RNA进行了检测, 作为相对丰度的分母拷贝数.所用引物序列如表 2所示.
| 表 2 ARGs和16S RNA的引物序列 Table 2 PCR primes selected ARGs and 16S RNA |
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众所周知, 实际雨水管网沉积物中微生物菌群的多样性导致雨水管网沉积物属于微生物复杂系统.而最小抑制浓度是用于表达纯菌系统中单一菌种对抗生素的抗性(伍娇等, 2017), 因此, 本研究中无法用最小抑制浓度来表达雨水管网沉积物中微生物菌群的耐药性.雨水管网沉积物中细菌耐药性可通过可培养细菌和可培养耐药菌的分析来反映.
3.1.1 3种功能区沉积物中细菌耐药性差异图 2可知, 3种功能区可培养细菌数均在106~108 cfu·g-1之间, 略高于土壤中可培养微生物的含量(106 cfu·g-1)(徐万里等, 2015), 这应该与管网沉积物中含有更为丰富的氮、碳等营养物质有关(李立青等, 2009), 表明管网沉积物更有利于微生物生长繁殖, 会加剧ARB传播风险.
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| 图 2 各功能区可培养细菌数的变化情况 Fig. 2 Changes in the number of cultured bacteria in different functional areas |
将各功能区不同日期可培养细菌和ARB数量进行平均, 以评估各功能区雨水管网沉积物中细菌耐药性差异, 结果如表 3所示.由表 3可知, 文教区雨水管网沉积物中可培养细菌数高于交通区.研究表明, 人类活动对大气和土壤中微生物贡献较大(娄阳等, 2015; 曲浩丽等, 2016), 文教区更多的人类活动应该是主要原因.相似地, 商业区有最密集的人流, 使得与文教区和交通区相比, 其可培养细菌数最高, 是交通区的3.67倍.比较不同功能区ARB的平均值可以发现, 文教区雨水管道沉积物中β-内酰胺类和四环素类ARB数量最多, 分别是商业区的8.93倍和3.49倍；而交通区雨水管网沉积物中ARB含量水平在3种功能区中最低, 表明交通区雨水管网沉积物中ARB污染程度较低.
| 表 3 各功能区可培养细菌数和ARB数量 Table 3 Number of cultured bacteria and ARB in different functional areas |
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3种功能区中β-内酰胺类及四环素类ARB的相对含量均在0.00001%~0.01%之间(图 3), 其中, 四环素类ARB的相对含量与张俊等(2014)检测施用猪粪土壤中的相对含量(0.001%)相近.从图 3可以发现, 干期长度较短(4 d), 两类ARB的相对含量较大, 相比之下, 干期长度为12 d(6月17日)的沉积物样品中, 这两类ARB的相对含量呈下降趋势.这可能是因为干期长度增加, 管网沉积物中微生物(包括ARB在内)所需的营养物因内源消耗而越缺乏, 从而增加了微生物死亡几率, 导致ARB数量下降.
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| 图 3 功能区β-内酰胺类ARB(a)和四环素类ARB(b)相对含量变化情况 Fig. 3 Changes of ampicillin ARB(a) and tetracycline ARB(b) relative content in different functional areas |
由表 4可知, 文教区干期长度与可培养细菌数之间的相关系数最大(0.17)；交通区干期长度与四环素类ARB数量之间相关系数最大(0.379)；商业区干期长度与可培养细菌和两种ARB数量之间的相关系数均较小(小于0.10).然而, 干期长度对3种功能区可培养细菌和两种ARB的影响不显著, 这应该与微生物生长代谢直接受土壤沉积物中pH、营养盐及重金属等环境条件的影响(Wolters et al., 1991; Baath et al., 1994; 王健波等, 2013; 张宁等, 2018)有关.
| 表 4 干期长度与可培养细菌及ARB数量之间的Pearson相关系数 Table 4 Pearson correlation analysis between dry length and cultured bacteria, and ARB |
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通过高通量定量PCR获得β-内酰胺类(blaTEM、blaOXA1、blaSHV)和四环素类(tetO、tetM、tetW)ARGs的相对拷贝数, 然后用ARGs的相对拷贝数除以16S rRNA基因的相对拷贝数得到ARGs相对丰度.由表 5可知, 文教区β-内酰胺类和四环素类ARGs的相对丰度分别为2.76×10-5和2.34×10-5；交通区这两类ARGs的相对丰度较高, 且高于文教区和商业区1个数量级；商业区ARGs的相对丰度在3种功能区中最低, β-内酰胺类和四环素类ARGs的相对丰度分别是文教区的0.69倍和0.46倍.可见, 交通区这两类ARGs的污染较为严重.
| 表 5 各功能区典型ARGs相对丰度 Table 5 Relative abundance of typical ARGs in different functional areas |
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按干期长度随机选取6月28日、7月12日和7月31日这3个不同日期, 分析各功能区雨水管网沉积物中典型ARGs组成种类及其相对丰度随干期长度的变化规律.如图 4所示, 文教区在干期长度较长的日期未检出这两类ARGs, 而干期长度较短的日期则检出了β-内酰胺类(blaTEM、blaOXA1、blaSHV)和四环素类(tetM)基因.交通区不同日期均能检出这两类ARGs, 其中, β-内酰胺类(blaOXA1)基因和四环素类(tetM)基因相对丰度较高, 均大于10-4.相关研究表明, 交通区的重金属污染高于商业区和文教区(刘亚纳等, 2016), 而重金属对ARGs的传播有促进作用(Ji et al., 2012), 会增加交通区ARGs的丰度.商业区不同日期分别检出了单种ARGs, 6月28日的沉积物样品中发现了β-内酰胺类(blaTEM)基因, 7月12日和7月31日的样品中检出四环素类(tetM)基因, 这两类ARGs的相对丰度在2×10-4左右.
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| 图 4 各功能区不同日期典型ARGs种类及相对丰度 Fig. 4 Typical ARGs species and relative abundance of different sampling dates in different functional areas |
另一方面, 各功能区3个日期均检出了四环素类ARGs, 且相对丰度较β-内酰胺类ARGs高.四环素类抗生素在生活中应用较为广泛(常海东等, 2016), 由滥用而导致的残留四环素能经由雨水径流运移(Garner et al., 2017)等途径进入环境中, 从而导致四环素类ARGs广泛存在(王国兰等, 2019).干期长度为11 d(6月28日)和19 d(7月31日)的沉积物中β-内酰胺类和四环素类ARGs种类较少且相对丰度较低, 整体低于干期长度6 d(7月12日)的沉积物.在干期, 携带ARGs的细菌因缺乏水分而死亡(李晨华等, 2007), ARGs便从菌体内流出, 产生更多的游离ARGs, 而游离ARGs易于被核酸酶等活性酶降解(岳鑫业, 2012).因此, 随着干期长度增加, 沉积物中ARGs种类会减少.
3.3 典型ARGs在不同粒径颗粒中的分布特征颗粒粒径是表征颗粒物行为的重要参数(朱伟等, 2008), 对其他污染物的分布具有决定作用, 如TP和COD等(李俊奇等, 2004).结合各功能区不同粒径颗粒中典型ARGs种类及分布情况, 发现ARGs在不同功能区各粒径颗粒中的分布差异明显.
就文教区干期长度为11 d(6月28日)和19 d(7月31日)的沉积物样品而言, 各粒径颗粒中未能检测出两类典型ARGs；干期长度为6 d(7月12日)的各粒径颗粒中均检出四环素类(tetM)基因, 且相对丰度在6×10-6左右, 在粒径＞150 μm的颗粒中检测出了β-内酰胺类ARGs(图 5).
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| 图 5 文教区各粒径颗粒中ARGs的分布情况(7月12日) Fig. 5 Distribution of ARGs among particle sizes in the education area |
交通区不同日期雨水管网沉积物的不同粒径颗粒中两类典型ARGs的种类和相对丰度如图 6所示.就交通区干期长度为11 d(6月28日)的沉积物样品而言, 随着粒径的减小, 颗粒中β-内酰胺类ARGs的相对丰度不断增加.粒径＜75 μm颗粒中β-内酰胺类ARGs的相对丰度是粒径＞300 μm颗粒中的4倍.在粒径＞300 μm颗粒中检出四环素类tetW基因, 而在粒径＜300 μm颗粒中却检出tetM基因.对于干期长度为6 d(7月12日)的沉积物样品而言, 四环素类tetM基因的相对丰度在75~300 μm粒径范围的颗粒中最大, 而在粒径＞300 μm颗粒中没有被发现.对于干期长度为19 d(7月31日)的沉积物样品而言, 随着颗粒粒径的减小, ARGs的相对丰度呈下降趋势, 而ARGs的种类没有变化.
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| 图 6 交通区不同日期各粒径颗粒中ARGs的分布情况 Fig. 6 Distribution of ARGs among particle sizes at different sampling dates in the traffic area |
对于商业区干期长度为11 d(6月28日)的沉积物样品而言, 在76~300 μm粒径范围内的颗粒中检出β-内酰胺类blaTEM基因(图 7), 而其他粒径颗粒均未检出；干期长度为6 d(7月12日)的沉积物样品各粒径颗粒中未能发现这两类典型ARGs；7月31日在151~300 μm粒径段的颗粒中检测出了四环素类tetM基因, 其他粒径颗粒中未发现这两类ARGs.
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| 图 7 商业区不同日期各粒径颗粒中ARGs的分布情况 Fig. 7 Distribution of ARGs among particle sizes at different sampling dates in the commercial area |
总之, 随着颗粒粒径的减小, 文教区雨水管道沉积物中ARGs的相对丰度变化不大, 交通区雨水管道沉积物中ARGs的相对丰度则呈现增加趋势, 商业区的无明显规律, 这可能与各功能区管网沉积物污染类型(荣兴民等, 2008)、用地类型(王焕华等, 2005)和颗粒来源组成有关.研究表明, 雨水径流中小粒径颗粒(＜150 μm)以粉粒和黏粒为主(Herngren et al., 2005), 而大颗粒成分多以沙粒为主(Kim et al., 2008), 颗粒成分可能会对ARGs的种类及分布造成影响(刘亚纳等, 2016).此外, 由于沉积物中可移动遗传因子(MGEs)能促进ARGs的传播扩散(蒋培余等, 2006; Oliveira et al., 2016), 分析MGEs在不同粒径颗粒中的相对丰度和相应粒径颗粒中ARGs相对丰度的关系, 可评价不同粒径颗粒中MGEs对ARGs相对丰度的影响.由表 6可知, 粒径较大的(＞300 μm)颗粒中典型ARGs和MGEs之间的相关系数最小(0.518), 而其他粒径颗粒中的相关系数均较大(>0.70).可见, 粒径较小的颗粒中MGEs对ARGs的分布影响更大, 且以＜75 μm粒径段颗粒中最明显(相关系数为0.874).
| 表 6 粒径颗粒中典型ARGs和MGEs的Pearson相关系数 Table 6 Pearson correlation analysis between typical ARGs and MGEs in particles-size |
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1) 南京江北新区3种不同功能区(文教区、交通区及商业区)分流制雨水管网沉积物中细菌耐药性差异明显, 其中, 可培养细菌总数均在106~108 cfu·g-1范围内, 但其大小顺序为商业区＞文教区＞交通区；而β-内酰胺类和四环素类ARB的相对含量大小顺序却为文教区＞商业区＞交通区；耐药性最低的交通区沉积物中四环素类ARB受干期长度的影响最显著.
2) 本研究中, 污染较为严重的交通区的β-内酰胺类和四环素类ARGs的相对丰度高于文教区和商业区1个数量级；随着干期长度的增加, 各功能区雨水管网沉积物中这两类典型ARGs的种类及相对丰度均有不同程度的减少.
3) 随着颗粒粒径的减小, 文教区雨水管道沉积物中典型ARGs的相对丰度变化不大, 交通区的则呈现增加趋势, 而商业区的无明显规律.粒径较小的颗粒中MGEs对ARGs的分布影响更大, 且以＜75 μm粒径段颗粒中最明显(相关系数为0.874).
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