环境科学学报  2020, Vol. 40 Issue (7): 2496-2501
诺氟沙星对地下水中反硝化过程的影响:反硝化酶活性的证据    [PDF全文]
陈淋鹏, 黄福杨, 张冲, 刘菲, 郎杭    
中国地质大学(北京)水资源与环境学院, 水资源与环境工程北京市重点实验室, 北京 100083
摘要:为探究不同初始浓度诺氟沙星对地下水反硝化过程中NO3--N和NO2--N降解的影响,选取以乙酸钠为电子供体,硝酸盐为电子受体驯化的反硝化细菌进行厌氧反硝化批实验研究,从反硝化细菌生长特性和反硝化酶活性等方面揭示诺氟沙星对反硝化过程的影响机制.结果表明,浓度为10 μg·L-1和100 μg·L-1的诺氟沙星对反硝化细菌的生长及NO3--N降解均有抑制作用,100 μg·L-1诺氟沙星对NO3--N降解的抑制程度更大,抑制率为77.3%;且100 μg·L-1诺氟沙星减少了NO2--N积累,最大积累量降低了67.9%.诺氟沙星初始浓度大于10 μg·L-1时抑制了硝酸盐还原酶活性,在此过程中,亚硝酸盐还原酶活性在一定程度上有所增强.反硝化酶活性与NO3--N及NO2--N降解规律相符.因此,诺氟沙星对反硝化酶活性的控制作用是其影响反硝化过程的主要原因.
关键词诺氟沙星    地下水    反硝化        
Effect of norfloxacin on denitrification process in groundwater: Evidence for denitrifying enzyme activity
CHEN Linpeng, HUANG Fuyang, ZHANG Chong, LIU Fei, LANG Hang    
Beijing Key Laboratory of Water Resources and Environmental Engineering, School of Water Resources and Environment, China University of Geosciences(Beijing), Beijing 100083
Received 20 December 2019; received in revised from 17 January 2020; accepted 17 January 2020
Abstract: To investigate the concentration effect of norfloxacin on NO3--N and NO2--N denitrification in groundwater, we carried out batch experiments with denitrifying bacteria acclimated with sodium acetate as electron donor and nitrate as electron acceptor, to reveal the mechanism. The results showed that norfloxacin at a concentration of 10 and 100 μg·L-1 both inhibited the growth of denitrifying bacteria and NO3--N denitrification, and 100 μg·L-1 norfloxacin had a greater inhibition with a rate of 77.3%. Moreover, 100 μg·L-1 norfloxacin decreased NO2--N accumulation, and the maximum accumulation decreased by 67.9%. Norfloxacin inhibited nitrate reductase activity when the initial concentration was greater than 10 μg·L-1, and nitrite reductase activity was enhanced to some extent during this process. It is clear that the variation of denitrifying enzyme activity was consistent with the degradation principle of NO3--N and NO2--N. Therefore, the control of norfloxacin on denitrifying enzyme activity is the main reason for influencing on the denitrification process.
Keywords: norfloxacin    groundwater    denitrification    enzyme    
1 引言(Introduction)

诺氟沙星作为第三代氟喹诺酮类抗生素, 由于具有广谱抗菌作用, 主要通过抑制DNA的合成和复制导致致病性细菌死亡(叶慧珍, 1985), 故而被广泛应用于人体和动物的感染性疾病治疗.我国是氟喹诺酮类抗生素消耗大国, 2013年我国氟喹诺酮类抗生素年消耗量为25500 t, 其中, 诺氟沙星年消耗量为5440 t, 位居氟喹诺酮类抗生素年消耗量首位(Zhang et al., 2015).由于内服抗生素不能被完全吸收, 仍然有80%~90%的抗生素以母体化合物的形式经由尿液或者粪便直接排泄到体外(Yan et al., 2013; Zhang et al., 2013).因此, 医疗、养殖业大量使用的诺氟沙星可能会通过多种途径进入到土壤和水体环境.地下水作为我国的主要饮用水水源, 陆续有诺氟沙星被检出的报道(Tong et al., 2014; Ma et al., 2015; Chen et al., 2016).其中, 有研究发现在中国北方和西南地区地下水中诺氟沙星检出浓度高达0.44 μg·L-1(Chen et al., 2018; Huang et al., 2019).

硝酸盐是我国地下水中常见的污染物之一, 其主要来自于与人类活动相关的农业活动和畜牧养殖(Rivett et al., 2008; Kaown et al., 2009), 长期饮用含有高浓度硝酸盐的地下水会导致高铁血红蛋白血症、高血压、甲状腺疾病及细胞遗传学缺陷, 从而对人体健康构成威胁(Ayyasamy et al., 2007).自然条件下地下水中硝酸盐主要是在厌氧条件下, 通过微生物驱动的异化反硝化过程进行脱氮, 异化反硝化作用主要流程为:NO3-→NO2-→NO→N2O→N2, 该过程分别由硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶催化完成(Berks et al., 1995; Barnard et al., 2004).

近年来, 我国地下水中硝酸盐浓度持续升高, 这可能受两个方面影响:一是污染通量增加, 二是反硝化过程受到抑制.当前的研究主要集中在第一方面, 而且研究表明, 在畜牧养殖、污水灌溉及再生水利用等地区硝酸盐和抗生素污染总是同时存在, 且二者之间具有一定的相关关系(Schaider et al., 2014); 关于反硝化过程的抑制, Brooks(1992)研究表明, 300 mg·L-1氯霉素抑制了硝酸盐的减少和N2(N2O)的生成; Ahmad等(2014)指出, 地下水中0.01 mg·L-1的磺胺甲嘧啶和1 mg·L-1的金霉素对硝酸盐的降解起抑制作用; Hou等(2015)研究表明, 5 μg·L-1磺胺甲嘧啶抑制了反硝化速率.可见, 抗生素对反硝化过程的影响程度不同.

目前, 有关诺氟沙星对地下水中反硝化过程影响研究较少, 且机理尚不清楚.因此, 本文选取氟喹诺酮类抗生素中的诺氟沙星作为典型抗生素代表, 采用批实验方法探究不同浓度诺氟沙星对反硝化过程的影响, 并从反硝化细菌生长及反硝化酶活性等方面探讨诺氟沙星对反硝化过程的影响机制, 以期为评估抗生素对地下水反硝化功能的影响提供理论依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 反硝化细菌的获取与多样性分析 2.1.1 反硝化细菌的获取

从北京市潮白河流域实际含水层中采集微生物样品, 在常温密封避光条件下对其进行驯化培养, 直至微生物具有稳定的NO3--N降解能力.驯化培养液使用实际地下水配制, 利用ICP-AES、离子色谱仪和电位滴定仪对培养液中离子浓度进行测试, 结果如表 1所示.

表 1 驯化培养液离子浓度 Table 1 Ion concentration in domesticated medium
2.1.2 微生物多样性分析

使用强力土壤DNA提取试剂盒(MoBio, USA)提取细菌DNA进行16S rDNA测序.PCR扩增所用引物为细菌通用引物对27F(5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′).PCR反应体系(10 μL):DNA模板(50 ng), KOD FX Neo buffer 5.0 μL, KOD FX Neo 0.2 μL, dNTP(2 mmol·L-1) 2 μL, 27F(10 μmol·L-1)和1492R(10 μmol·L-1)各0.3 μL, ddH2O补至10 μL, 充分混匀.PCR反应条件:95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 循环20次; 72 ℃延伸7 min.对PCR扩增产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库, 文库质检合格后采用PacBio Sequel进行测序.测序分析由北京百迈客生物科技有限公司完成.

2.2 批实验方法

配制反硝化培养液, 其成分包含(g·L-1):KNO3(0.361)、CH3COONa(0.59)、(NH4)2SO4(0.7095)、MgSO4·7H2O(0.10)、KH2PO4(2.44)、Na2HPO4·12H2O(11.70)和1 mL微量元素, 微量元素包括(g·L-1):C10H14N2O8Na2·2H2O(7.30)、FeSO4·7H2O(2.50)、CuCl2·2H2O(0.135)、ZnCl2(0.34)、Na2MoO4·2H2O(0.242)和MnCl2·4H2O(0.02)(Wan et al., 2016).调节培养液pH至7.00 ± 0.05, 将其放入高压灭菌锅中, 在121 ℃下灭菌15 min, 灭菌后向培养液中通入氩气对其驱氧30 min, 并将其分装至120 mL血清瓶中密封保存.

将100 μL菌液加入到100 mL的LB培养基中, 在30 ℃、175 r·min-1、好氧条件下培养, 当OD600为0.8~1.0时, 加入到分装好的培养液中.实验共设置1个空白组和3个实验组, 空白组为100 mL培养液+100 μL菌液+100 μL蒸馏水, 实验组为100 mL培养液+100 μL菌液+100 μL不同浓度(1、10、100 mg·L-1)诺氟沙星溶液, 所有实验均设置4个平行样, 在30 ℃、175 r·min-1、厌氧条件下进行反应, 每隔8 h取一次样, 取样后的溶液用于NO3--N、NO2--N、细菌生长曲线、诺氟沙星及反硝化酶等指标的测定.

2.3 分析方法 2.3.1 NO3--N、NO2--N、细菌生长曲线

NO3--N采用紫外分光光度法于吸收波长为220 nm和275 nm处测定; NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法于吸收波长为540 nm处测定(魏复盛, 2002); 细菌生长曲线采用吸光光度法于吸收波长为600 nm处测定(OD600).

2.3.2 诺氟沙星

实验所用诺氟沙星购买自德国Dr.Ehrenstorfer公司.诺氟沙星采用Waters液相色谱质谱联用仪进行检测, 液相色谱条件为:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm); 流动相A为0.1%甲酸水溶液; 流动相B为甲醇/乙腈(V/V, 1/1, 含0.1%甲酸); 洗脱梯度:0 min 10%B; 0~4 min 40%B; 4~4.1 min 10%B; 4.1~5 min 10%B; 流速0.2 mL·min-1; 进样体积1 μL; 柱温40 ℃.质谱检测条件为:诺氟沙星的母离子/子离子1/子离子2:320.30/276.33/302.28;毛细管电压3.2 kV; 去溶剂温度500 ℃; 载气为氮气; 碰撞气为氩气; 采用电喷雾离子源(ESI), 正离子模式扫描, 该方法在5 min内完成.

2.3.3 反硝化酶

硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶测试方法如下:在10000 r·min-1条件下对培养液离心10 min, 提取培养液中的细菌; 用0.1 mol·L-1的PBS(pH=7.4)使细菌悬浮, 在4 ℃、10000 r·min-1条件下离心10 min, 洗除NO3--N和NO2--N; 再次悬浮细菌, 使用超声波(20 kHz)对细菌进行破碎, 破碎时间为5 min; 在4 ℃、12000 r·min-1条件下对细菌破碎液离心10 min, 获取上清液(粗酶提取液); 将0.1 mL粗酶提取液加入到1.9 mL混合液(包含10 mmol·L-1磷酸钾(pH=7.10)、10 mmol·L-1甲基紫腈、5 mmol·L-1连二亚硫酸钠、1 mmol·L-1电子受体(NO3-或NO2-))中, 放在30 ℃恒温培养箱中静置30 min后, 通过测定NO2--N的增加量和减少量来表征硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的活力(Xiong et al., 2014; Su et al., 2019).同时, 采用BCA蛋白定量分析试剂盒对粗酶提取液中蛋白质含量进行测定(Smith et al., 1985).硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶活力以U表示, 单位为nmol·mg-1·min-1, 分别表示每毫克蛋白每分钟生成或转化NO2--N的量.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 反硝化细菌生长特性

由测序结果可知, 实验所用混合细菌主要包括以下5种菌属, 分别为Acinetobacter(不动杆菌属)、Exiguobacterium(微小杆菌属)、Aeromonas(气单胞菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)和Acidovorax(食酸菌属), 占比分别为93.53%、5.07%、1.12%、0.26%和0.02%.由此可知, Acinetobacter(不动杆菌属)为实验所用细菌中的优势菌属.且实验表明, Acinetobacter(不动杆菌属)在厌氧条件下具有较强的反硝化能力, 该结果与Su等(2015)的研究结果相一致.

生物反硝化过程由反硝化细菌驱动, 因此, 反硝化细菌的生长情况与其反硝化能力密切相关.不同浓度诺氟沙星条件下反硝化细菌生长情况如图 1所示.由图 1可知, 和空白组相比, 诺氟沙星初始浓度为1 μg·L-1时, 对反硝化细菌的生长几乎无影响; 诺氟沙星初始浓度超过10 μg·L-1时, 反硝化细菌在生长初期受到抑制, 而后其生长能力有所恢复.当t=64 h时, 空白组中的OD600值为0.24, 10 μg·L-1和100 μg·L-1反应体系的OD600值分别为0.22和0.16, 此时抑菌程度最大, 抑制率分别为8.3%和33.3%.由此可知, 10 μg·L-1和100 μg·L-1诺氟沙星对反硝化细菌生长起抑制作用, 这与Zou等(2019)的研究结果一致.诺氟沙星对反硝化细菌生长的抑制作用可能会降低其反硝化能力.

图 1 不同浓度诺氟沙星条件下反硝化细菌生长特性 Fig. 1 Growth characteristics of denitrifying bacteria under different concentrations of norfloxacin
3.2 诺氟沙星的降解

实验中对反应前后诺氟沙星的浓度进行了测试, 结果如图 2所示.反应前实验组中诺氟沙星初始浓度分别为1、10、100 μg·L-1, 反应后诺氟沙星浓度分别为0.98、9.7、101.5 μg·L-1.由此可见, 诺氟沙星未发生降解.孟磊等(2015)指出, 氟喹诺酮类抗生素属光降解敏感型, 在环境中易发生光解, 不易发生水解, 而本实验是在避光条件下进行, 排除了光照的影响.因此, 在整个反应过程中诺氟沙星浓度始终与初始浓度保持一致, 且不存在其它降解产物对反硝化过程的干扰.

图 2 诺氟沙星的降解情况 Fig. 2 Degradation of norfloxacin
3.3 诺氟沙星对反硝化过程的影响

当诺氟沙星初始浓度分别为1、10和100 μg·L-1时, 反硝化过程中NO3--N和NO2--N浓度变化如图 3所示.由图 3a可知, 1 μg·L-1反应体系和空白组中NO3--N降解情况基本一致, 当t=40 h时, NO3--N均全部降解; 此时, 10 μg·L-1和100 μg·L-1反应体系中NO3--N浓度分别为27.67 mg·L-1和42.26 mg·L-1.因此, 10 μg·L-1和100 μg·L-1诺氟沙星对NO3--N降解起到抑制作用, 抑制率分别为50.6%和77.3%;随着反应的进行, NO3--N分别于56 h和88 h时全部降解.根据空白组、1、10和100 μg·L-1反应体系中NO3--N完全降解所需时间, 可以得出NO3--N平均降解速率分别为1.37、1.37、0.98和0.62 mg·L-1·h-1.由此可知, 1 μg·L-1诺氟沙星对NO3--N降解基本无影响, 10 μg·L-1和100 μg·L-1诺氟沙星抑制了NO3--N降解, 且随着诺氟沙星浓度的增大, 抑制程度逐渐增强.

图 3 不同浓度诺氟沙星条件下NO3--N和NO2--N含量变化(a.浓度效应, b.1 μg·L-1, c.10 μg·L-1, d.100 μg·L-1) Fig. 3 Variation of NO3--N and NO2--N contents under different concentrations of norfloxacin

不同浓度诺氟沙星条件下NO2--N浓度变化如图 3b~3d所示.由图可知, 在反硝化过程初期, 随着NO3--N浓度的降低, NO2--N开始有了较为明显的积累现象, 当t=40 h时, 空白组中NO3--N全部降解, NO2--N累积浓度达到最大, 其最大积累量为37.02 mg·L-1, 而后NO2--N又逐渐下降, 在56 h时全部被还原; 而1、10和100 μg·L-1反应体系中NO2--N最大积累量分别为36.07、35.58和11.9 mg·L-1.因此, 100 μg·L-1诺氟沙星减少了NO2--N积累, 与空白组相比, NO2--N最大积累量降低了67.9%.这与杨腾飞等(2018)发现的甲氧苄啶主要通过影响NO3--N还原为NO2--N的过程, 从而对反硝化过程产生明显的抑制作用这一规律相似.

3.4 诺氟沙星对反硝化酶活性的影响

实验测定了t=40 h时硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的活性, 结果如图 4所示.由图 4可知, 空白组、1、10和100 μg·L-1反应体系中每毫克蛋白对NO3--N的降解能力分别为13.44、13.93、9.76和1.19 nmol·min-1, 1、10和100 μg·L-1反应体系中硝酸盐还原酶活性分别为空白组的103.6%、72.6%和8.9%.因此, 10 μg·L-1和100 μg·L-1诺氟沙星对硝酸盐还原酶活性起抑制作用.而对于亚硝酸盐还原酶活性, 空白组、1、10和100 μg·L-1反应体系中每毫克蛋白对NO2--N的降解能力分别为0.31、0.39、3.68和7.99 nmol·min-1, 1、10和100 μg·L-1反应体系中亚硝酸盐还原酶活性分别为空白组的1.23、11.87和25.77倍.由此可知, 在此过程中亚硝酸盐还原酶活性逐渐增强.

图 4 不同浓度诺氟沙星条件下反硝化酶活性 Fig. 4 Activity of denitrifying enzyme under different concentrations of norfloxacin

同时, 从图 4可看出, 空白组、1 μg·L-1和10 μg·L-1反应体系中硝酸盐还原酶活性均大于亚硝酸盐还原酶活性, 说明NO2--N生成速率大于NO2--N还原速率, 这与该时刻NO2--N有明显积累相符; 而在100 μg·L-1反应体系中, 硝酸盐还原酶活性小于亚硝酸盐还原酶活性, 说明NO2--N生成速率小于NO2--N还原速率, 进而表现为NO2--N积累量的减少.

为了探究反硝化酶与NO3--N和NO2--N降解的关系, 分别对40 h时硝酸盐还原酶活性和NO3--N降解率及亚硝酸盐还原酶活性和NO2--N降解率进行对比, 结果如表 2所示.由表 2可知, NO3--N降解率和硝酸盐还原酶活性之间具有良好的相关性, 二者均随着诺氟沙星初始浓度的升高而逐渐减小.由此可推测, 诺氟沙星对硝酸盐还原酶活性产生的负面影响是NO3--N降解受到抑制的主要原因.该结果与Murray等(1999)Chen等(2015)的研究结果相一致, Murray等(1999)Chen等(2015)认为氯霉素和四环素降低了反硝化酶活性, 从而使得NO3--N降解受到抑制.NO2--N降解率=(NO3--N降解量-NO2--N积累量)/NO3--N降解量×100%, 从表 2中可以看出, NO2--N降解率和亚硝酸盐还原酶活性之间相关性较好, 二者均随着诺氟沙星初始浓度的升高而逐渐增大.由此可知, 在NO3--N降解受到抑制的过程中, 在一定程度上亚硝酸盐还原酶活性的增强, 加大了NO2--N的降解.

表 2 反硝化酶和无机氮降解率的关系 Table 2 Relationship between denitrifying enzyme and degradation rate of inorganic nitrogen
4 结论(Conclusions)

1) Acinetobacter(不动杆菌属)为实验所用反硝化细菌中的优势菌属, 在厌氧条件下具有较强的反硝化能力, 且诺氟沙星初始浓度大于10 μg·L-1时对其生长起抑制作用.

2) 诺氟沙星初始浓度大于10 μg·L-1时可以抑制NO3--N降解, 随诺氟沙星初始浓度增大, NO3--N降解抑制程度增强, NO2--N积累量减小.

3) NO3--N和NO2--N降解与反硝化酶活性相关, 诺氟沙星对硝酸盐还原酶活性产生的负面影响是NO3--N降解受到抑制的主要原因; 在NO3--N降解受到抑制的过程中, 亚硝酸盐还原酶活性在一定程度上有所增强.

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