1 引言(Introduction)

当前国内水体富营养化严重, 俨然已成为我国生态环境和社会可持续发展中备受关注的问题.从国外诸多水体富营养化治理成功案例来看, 经济高效的控磷措施相比控氮更为可取(Schindler et al., 2016; Schindler et al., 2008), 但对水污染程度更严重的国内而言, 河湖水体氮和磷本底值普遍偏高, 内源负荷严重, 难以短期内达到控磷效果(Xu et al., 2015), 控氮在我国水体富营养化治理过程中仍然是一项必要措施.从国内研究来看, 国内富营养化水体中的氮和磷, 主要源于农业化肥、畜牧养殖、地表径流、初期雨水等, 这种城镇生活污水中的氮浓度对河流来说仍是主要污染源(Xie et al., 2014; Xu et al., 2014), 因此如何实现这种微污染水体的深度脱氮, 是我国当前污染治理和生态修复成败的关键.

目前对好氧反硝化细菌的研究发现, 多数具有同步硝化反硝化的能力(Pochana et al., 1999; Kinh et al., 2017; Feng et al., 2018), 且大多存在于生活污水、活性污泥或海水中(黄廷林等, 2015), 而对于湖泊水库以及城镇当中这种微污染水体, 其大部分污染物浓度小于10 mg·L^-1(Wang et al., 2013; Yu et al., 2016), 能适应其环境的好氧反硝化菌则更少.由于微污染水体有机质含量较低, 传统的生物法难以发挥理想效果, 而贫营养细菌的初次培养只需1~15 mg·L^-1的含碳量即可生长(Kuznetsov et al., 1979), 因此对微污染水体的治理具有重要的意义.目前只有少数成功分离出具有高效脱氮的好氧反硝化菌, 如周石磊等(2016)分离出贫营养型好氧反硝化菌对硝氮去除率最高可达99.44%;Guo等(2013)应用分离后的贫营养型好养反硝化菌, 使河湖水样水质由Ⅴ级提高到Ⅱ级; 魏巍等(2011)成功将贫营养型好氧反硝化菌应用于原位强化水体脱氮的研究中.

本研究小组前期对澜沧江流域的研究发现, 梯级水库建设改变了流域营养盐及微生物群落结构的分布特征(程豹等, 2018; 2019), 并对流域内水库沉积物细菌群落结构调查研究发现, 均有不同相对丰度的脱氮细菌存在, 值的注意的是发现了一类好氧反硝化细菌并表现了明显的垂向分布特征, 且相对丰度可观(王慎等, 2019).为研究小湾水库沉积物已发现好氧反硝化菌的脱氮特性, 解决微污染水体深度脱氮困难的问题, 采集了澜沧江流域小湾水库沉积物, 成功分离纯化得到一株较理想的好氧反硝化菌株XW731, 并分析其不同氮源条件下及城镇微污染水体中的脱氮特性, 为日后水库生态调查及河湖生态修复提供理论依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 培养基

好氧反硝化培养基：CH₃COONa 0.1 g·L^-1; NaNO₃ 0.02 g·L^-1; K₂HPO₄·3H₂O 0.02 g·L^-1; CaCl₂ 0.01 g·L^-1; MgSO₄ 0.01 g·L^-1; 蒸馏水1 L; 琼脂20 g·L^-1(固基加入); pH 7.2;121 ℃、30 min.

异养硝化培养基：CH₃COONa 0.05 g·L^-1; NH₄Cl 0.01 g·L^-1; K₂HPO₄·3H₂O 0.02 g·L^-1; CaCl₂ 0.01 g·L^-1; MgSO₄ 0.01 g·L^-1; 蒸馏水1 L; pH 7.2;121 ℃、30 min.

同步硝化反硝化培养基：CH₃COONa 0.1 g·L^-1; NaNO₃ 0.01 g·L^-1; NH₄Cl 0.006 g·L^-1; K₂HPO₄·3H₂O 0.02 g·L^-1; CaCl₂ 0.01 g·L^-1; MgSO₄ 0.01 g·L^-1; 蒸馏水1 L; pH 7.2;121 ℃、30 min.

短程反硝化培养基：CH₃COONa 0.1 g·L^-1; NaNO₂ 0.02 g·L^-1; K₂HPO₄·3H₂O 0.02 g·L^-1; CaCl₂ 0.01 g·L^-1; MgSO₄ 0.01 g·L^-1; 蒸馏水1 L; pH 7.2;121 ℃、30 min.

2.2 菌株驯化与分离

实验样品采集于澜沧江流域小湾水库区表层0~2 cm沉积物, 图 1所示, 取适量沉积物投加到装有300 mL的反硝化液体培养基容器中, 30 ℃, 300 r·min^-1恒温振荡培养, 每日定时向容器内曝气并更换1/2总体积的新鲜培养基, 驯化过程持续40 d.驯化结束后, 取适量菌液按10^-1~10^-7梯度稀释, 分别划线接种到反硝化固体培养基上, 30 ℃恒温培养, 挑取合适稀释梯度的单一菌落, 反复进行划线重复3个周期, 以达到对菌株分离纯化效果(张娴等, 2012).实验共分离得到57株好氧反硝化细菌, 其中XW731表现脱氮效果较好, 并进一步对其研究.

2.3 菌株的鉴定 2.3.1 菌株的形态及生理生化鉴定

将纯化后的菌液稀释涂布在固体培养基, 30 ℃恒温培养, 待菌落长出后观察其颜色、大小及形态, 并根据《伯杰细菌鉴定手册》鉴定菌株生化特性(Buchanan et al., 1984).

2.3.2 16S rDNA基因测序与系统发育树构建

以菌株细胞基因组DNA为模板扩增16S rDNA, PCR扩增以通用引物为准, 正向引物F为27F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′, 反向引物R为1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′; PCR反应体系(50 μL)：DNA模板(20 g·L^-1)1 μL, 正向引物F(10 μmol)2 μL, 反向引物R(10 μmol)2 μL, dNTP mix(10 mmol)2 μL, Taq Buffer(with MgCl₂)(10×)5 μL, Taq酶(5 U·μL^-1)0.5 μL, ddH₂O 37.5 μL.PCR反应条件：95 ℃预变性5 min, 然后进行94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 35次循环, 最后72 ℃修复延伸8 min.PCR产物纯化、测序在生工生物工程(上海)股份有限公司进行.系统发育树采用MEGA(Version 5. 0)软件, 以Neighbour-Joining法建树(Saitou et al., 1987), 以最大似然法计算进化距离, Bootstrap计算次数设为1000.

2.4 菌株在配水中的脱氮特性研究

取分离纯化后的XW731菌液, 按1%接种量接种于300 mL不同氮源的灭菌培养基中, 30 ℃、300 r·min^-1恒温培养, 以封口膜封口保证空气流通, 定时测定水体中总氮(TN)、氨氮(NH₄⁺-N)、硝氮(NO₃^--N)、亚硝氮(NO₂^--N)质量浓度和菌体生长量(OD₆₀₀), 实验设3个重复(He et al., 2019).

2.5 菌株在污染水源中的脱氮特性研究

选取城市河流和城市降雨作为初步研究对象, 来分析菌株在城市两种不同污染水源中的脱氮效果, 分别取自武汉市内中小型河流巡司河和武汉市夏季八月份降雨.将采集的不同污水水样不经处理直接装入300 mL灭菌空瓶内, 按1%投加量加入活化菌液, 透气封口膜封口, 30 ℃、300 r·min^-1恒温培养, 定时测定水体中TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N, 实验设3个重复.

2.6 测定方法

TN测定方法为过硫酸钾氧化-紫外分光光度法, NH₄⁺-N为纳氏试剂分光光度法, NO₃^--N为紫外分光光度法, NO₂^--N为N-(1-奈基)-乙二胺光度法(国家环境保护总局, 2002).实验设置3个平行样以防止偏差, 硝氮、亚硝氮、氨氮、总氮的水样预处理为经过0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤(Li et al., 2018).

3 结果与讨论(Results and discussions) 3.1 菌株分离与鉴定

通过固体培养基上的菌落观察可知, 培养前期菌落表面干燥光滑不透明, 形态凸起, 边缘整齐且无晕圈, 颜色呈米白色, 培养后期颜色向米黄色转变, 革兰氏染色结果为阴性, 电镜扫描观察XW731为杆菌, 平均长度为1.40 μm.对菌株XW731测序共获得16S rRNA长度为1497 bp, 将菌株基因序列与GenBank数据库中选取的细菌基因序列分析比对, 图 2结果表明, XW731与Pseudomonas sp.同源性最高, 相似度为98%, 综合确定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).

XW731菌株16S rDNA序列分析鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.), 目前对假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的研究发现, 其能够在溶解氧较高的环境下同时具有硝化、反硝化、降解有机物多种功能(Baraniecki et al., 2002; 张培玉等, 2010; 李军冲等, 2010; 李雪等, 2018).另外通过前期对小湾水库沉积物细菌群落垂向分布的调查分析发现, 假单胞菌属(Pseudomonas sp.)在垂向上具有明显的分布特征, 表现为垂向向下相对丰度递减, 主要集中在溶解氧较高的表层沉积物中, 另外通过与环境因子的冗余分析(RDA)发现, 该菌属与NH₄⁺-N和NO₃^--N具有明显的负相关性(王慎等, 2019).这也从侧面证明了实验结果, 说明XW731硝化和好氧反硝化功能.

3.2 菌株好氧反硝化效率实验分析

为验证菌株XW731好氧反硝化特性, 实验配置了分别以NaNO₃和NaNO₂为唯一氮源且C/N分别为8.9和7.2的反硝化培养基, 按1%投加量加入活化后的菌液, 以透气封口膜封口, 保持空气流通模拟好氧环境, 每隔一段时间测定培养基中TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N和OD₆₀₀.

由图 3a可知, NO₃^--N初始质量浓度为3.528 mg·L^-1, TN为5.194 mg·L^-1, 由OD₆₀₀可知, 菌株反硝化过程的生长对数期为48 h, 72 h内NO₃^--N和TN质量浓度分别降为1.111 mg·L^-1和2.855 mg·L^-1, 去除率分别达68.5%和45%, NO₂^--N最终积累量不足0.200 mg·L^-1, 而NH₄⁺-N则表现较小质量浓度的累积, 72 h累积量为0.867 mg·L^-1.从以上结果来看, 菌株好氧反硝化过程主要发生在菌株生长对数期48 h内, 72 h内营养盐质量浓度趋于稳定, 表现了对NO₃^--N较强的去除率, 同时NO₂^--N没有明显的累积量, 说明该菌株具有较好的完全反硝化能力(黄廷林等, 2015), NH₄⁺-N在反应末尾有较小质量浓度的积累, 分析原因可能是进入稳定期后反应体系碳源不足导致菌株不能够完成其硝化过程, 或者由于实验中期取样过程造成培养基轻度污染导致.

如图 3b所示, NO₂^--N初始质量浓度为3.124 mg·L^-1, TN为4.064 mg·L^-1, 72 h内NO₂^--N和TN质量浓度分别降为2.840 mg·L^-1和3.318 mg·L^-1, 去除率分别仅有9.1%和18.3%, 同时NH₄⁺-N质量浓度有少量累积, 但累积量不足0.300 mg·L^-1, NO₃^--N质量浓度先有少量累积后逐渐下降, 最终累积量不足0.02 mg·L^-1, 这和黄延林等(2015)的研究结果较为一致.从OD₆₀₀来看, 菌株短程反硝化过程的生长对数期相对反硝化过程明显较短为24 h, 同时反映菌体生长量OD₆₀₀值也整体较小, 说明相较之下菌株生长受到抑制.对比两种不同氮源模式下的TN去除效果可以发现, 该菌株在NO₃^--N为唯一氮源较NO₂^--N为唯一氮源条件下反硝化效果更优.

3.3 菌株异养硝化效率实验分析

由于目前发现的已知好氧反硝化细菌同时具备异养硝化功能(李贵珍等, 2018), 为检验实验分离纯化的菌株是否具备异养硝化功能, 实验配置了以NH₄Cl为唯一氮源且C/N为5.6的硝化液体培养基, 并以1%投加量加入活化后的菌液, 每隔一段时间测定培养基中TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N和OD₆₀₀.如图 4所示, NH₄⁺-N初始质量浓度为2.681 mg·L^-1, TN为3.137 mg·L^-1, 由OD₆₀₀可知菌株异样硝化过程的生长对数期为48 h, 72 h后营养盐基本稳定, 此时段内NH₄⁺-N和TN质量浓度分别降为1.779 mg·L^-1和2.835 mg·L^-1, 去除率分别达33.6%和9.6%, 而整个过程NO₃^--N未表现明显积累量, NO₂^--N在48 h时候有明显的少量积累量0.234 mg·L^-1, 随后逐渐降低.分析原因可能是由于NO₂^--N易被氧化成NO₃^--N, 同时菌株较强的反硝化能力导致中间产物最终没有表现累积效应(刘小英等, 2016), 或是由于NH₄⁺-N在酶作用下氧化成羟胺(NH₂OH)或N₂O、N₂(于大禹等, 2012).从结果来看, 菌株对氨氮表现了一定的去除效果.

3.4 菌株同步硝化反硝化效率实验分析

为研究菌株同步硝化反硝化特性, 配置以NH₄Cl和NaNO₃为氮源且C/N为8.9的同步硝化反硝化培养基, 以1%投加量加入活化后的菌液, 并测定培养基中TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N和OD₆₀₀.如图 5所示, NH₄⁺-N、NO₃^--N和TN的初始质量浓度分别为1.883、2.066和4.540 mg·L^-1, 72 h内营养盐基本稳定且分别降为0.633、0.215和2.129 mg·L^-1, 去除率分别为66.4%、89.6%和53.1%, 72 h内NO₂^--N积累量为0.833 mg·L^-1, 分析原因可能由于稳定期后碳源不足NO₂^--N无法进一步被氧化, 并且通过对短程反硝化特性分析发现该菌对NO₂^--N去除效果并不高.

相较于反硝化和硝化系统, 同步硝化反硝化系统NO₃^--N去除率较高, NH₄⁺-N去除率具有显著性的提高(p=0.03), 但NO₂^--N发生了少量的累积.目前对异养硝化好氧反硝化系统研究发现, NO₂^--N存在条件下, 多数菌会优先进行反硝化, 且NO₂^--N的加入会抑制异养硝化作用(Robertson et al., 1989; Robertson et al., 1989; Kim et al., 2002), 但也有研究发现NO₂^--N的加入能够诱导菌体产生NIR(nitrite reductase)诱导酶, 进而促进NH₄⁺-N降解, 并沿NH₂OH、NO₂^--N、NO、N₂O的路径被脱除(张培玉等, 2010).从本研究实验结果来看, 同步硝化反硝化体系初始C/N较硝化体系高, 同时24 h后NO₂^--N的累积, 极大可能促进了体系中NH₄⁺-N的降解, 因此NH₄⁺-N去除率具有显著性的提高.

3.5 菌株对不同城市水体脱氮效率实验分析

为响应政府号召并推进水污染防治措施的实施, 研究初步选取了武汉市内一条中小型城市河道巡司河与城市降雨作为源水样, 分别以1%投加量加入活化菌液, 测定河水与雨水中TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N, 结果如图 6所示.

巡司河河水TN和NH₄⁺-N初始质量浓度较高分别为6.766、5.960 mg·L^-1, 而NO₃^--N、NO₂^--N初始质量浓度较低分别为0.335、0.210 mg·L^-1, 投加菌液后, 48 h内营养盐质量浓度基本趋于稳定, TN、NH₄⁺-N和NO₃^--N分别降为4.891、3.677和0.193 mg·L^-1, 去除率分别为27.7%、38.3%和42.4%, NO₂^--N有少量累积, 累积量为0.816 mg·L^-1.巡司河水样营养盐呈现NH₄⁺-N较高NO₃^--N较低的特征, 分析原因可能由于采样点在校区河道段内, 部分校区生活污水排入河流, 并且近期河道治理施工导致水体流速较缓, 夏季温度较高, 岸边腐殖质较多, 易于反硝化细菌的繁殖, 使河流水体营养盐呈现NH₄⁺-N过高特征(徐竑珂等, 2017).48 h内菌株表现了一定的脱氮效果, 但NO₂^--N存在少量的累积, 可能由于污染较重而可利用碳不高, 后期碳源不足, 且该菌对NO₂^--N亲和力不高, 导致累积效应.

雨水水样为武汉市夏季降雨, TN和NH₄⁺-N初始质量浓度较高分别为3.572、3.116 mg·L^-1, NO₃^--N初始质量浓度较低为0.156 mg·L^-1, 72 h内分别降为2.812、2.425和0.144 mg·L^-1, 去除率分别为21.3%、22.2%和7.7%, NO₂^--N没明显变化, 累积量不足0.001 mg·L^-1.雨水具有与巡司河水相似的营养盐特征, 分析可能由于此次降雨距上次降雨时间间隔较长, 降雨强度较大, 时间较短降雨量较小, 导致雨水中NH₄⁺-N表现较高质量浓度(徐海波等, 2011), 72 h内菌株表现一定的脱氮效果, 但速度相比巡司河水样条件下更慢脱氮效果较低, 分析可能是此次降雨富含大量空气中悬浮物, 雨水中可利用性碳源较少, 说明该菌对雨水具有一定的脱氮效果, 但相比较城市河流条件下脱氮效果略低.

目前贫营养好氧反硝化细菌已有诸多成功的应用先例, 同样分离于水库沉积物的贫营养好氧反硝化菌, 在应用于水库源水后的TN去除率最高达到35%(黄廷林等, 2011), 本研究中XW731菌株在两种不同微污染水源中的TN去除率最高也可达28%, 说明在对微污染水体的脱氮应用上具有较为可观的应用效果.来自太湖沉积物并筛选鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的一株菌株, 在太湖源水应用中据有更高的脱氮效果, NH₄⁺-N和NO₃^--N去除率均达到60%以上, 相比之下XW731菌株的去除率则较低(Guo et al., 2013).为了更好探究XW731菌株在微污染水体中的脱氮效果, 后期应对城市典型湖泊进行源水的实验分析, 为进一步应用到微污染水源水的治理当中奠定理论基础.

4 结论(Conclusions)

1) 小湾水库沉积物成功筛选分离一株贫营养型异养硝化好氧反硝化细菌XW731, 根据形态观察及16S rDNA序列分析鉴定属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.).

2) 对菌株XW731进行脱氮效率分析得出, 分别以NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N为唯一氮源的去除率为33.6%、68.5%和9.1%, 在以NH₄⁺-N和NO₃^--N为氮源时, 去除率分别为66.4%、89.6%, 表现出更高的同步硝化反硝化能力.

3) 菌株XW731对城市微污染水体具有一定脱氮效果, 对城市河道水体NH₄⁺-N和NO₃^--N去除率为38.3%和42.4%, 对城市降雨水体为22.2%和7.7%.