2019, Vol. 39
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2. 重庆市农业资源与环境研究重点实验室, 重庆 400716
2. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Resources and Environment, Chongqing 400716
自20世纪“水俣病”事件以来, 汞(Hg)污染问题引起了科学家的持续关注.随着对Hg污染的深入了解, 人们发现Hg是一种具有全球污染性的有毒重金属, 其无机态在自然环境中能被转化为甲基汞(MeHg)(孙涛等, 2018), 而MeHg具有亲脂性、高神经毒性, 可在生物体内积累, 能够通过生物链危害人体健康.研究指出, 自然环境中汞的甲基化反应受到诸多因素的影响, 如微生物群落、DOM、pH、氧化还原电位等(Macalady et al., 2000; Ullrich et al., 2001).其中, DOM被认为是影响汞甲基化的重要因素.但由于DOM的结构和成分十分复杂, 其对汞甲基化的影响尚未得到较一致的结论：一方面DOM可与Hg结合, 降低可供甲基化的汞离子浓度, 抑制MeHg的生成；另一方面, 还可为微生物提供碳源, 提高汞甲基化微生物的活性, 促进MeHg的生成(Bravo et al., 2017).而随着对DOM的认识, 有研究指出DOM对汞甲基化的影响主要取决于其自身的结构组成与特性(Bravo et al., 2017)
水库被认为是典型的“汞敏感生态系统”(Lucotte et al., 1999; 覃蔡清等, 2015; 游蕊等, 2016), 水库环境有利于汞的活化及甲基化, 被淹没的土壤和植被释放的有机质为汞甲基化微生物提供了良好的生长环境, 是新建水库水体和鱼体中MeHg的重要来源(Jackson, 1986; 李楚娴等, 2014).因此, 汞在水库生态系统中的环境行为成为了国内外学者研究的热点问题之一.
三峡水库属特大型年调节水库, 运行水位在145~175 m之间, 特殊的调度方式使得水库周边形成了垂直高差为30 m、面积超过400 km2的消落带(牛志明等, 1998).在落干期, 消落带会长出大量以狗牙根为主的草本植被；同时, 部分裸露区域会被用作农业用地, 灌溉施用以猪粪为主的生物有机肥；在淹水期, 植物发生腐解的同时向水中释放了大量的DOM和氮、磷等物质, 一方面可以为微生物的生长提供营养成分, 另一方面也会改变水体的DOM组成和结构, 并可能影响环境中汞的赋存形态和甲基化作用(Xiao et al., 2017).尹德良等(2018)通过室内模拟实验, 发现狗牙根淹水后会释放低分子有机酸, 同时改变了上覆水DOM紫外-荧光光谱特性, 提高了有色DOM的浓度.目前, 关于三峡库区消落带DOM光谱特征的研究指出, 三峡库区土壤中的DOM成分来源复杂广泛(李璐璐等, 2014; 高洁等, 2015; 王齐磊等, 2016), 但有关三峡库区消落带沉积物中DOM对汞甲基化的影响仍然了解较少.因此, 本实验以采集自三峡库区消落带的代表性土壤作为研究对象, 采用室内模拟的方式研究不同类型(狗牙根和猪粪)的DOM对土壤汞甲基化的影响, 以期为正确认识三峡库区汞的环境生物地球化学循环及其生态风险提供科学的基础数据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品的制备供试土壤采自重庆市忠县石宝寨消落带的表层土(0~20 cm).土壤采回经风干、磨碎后, 过2 mm筛备用.供试土壤为冲积土, 基本理化性质如下：总汞(THg)含量为80.5 ng·g-1, 甲基汞(MeHg)含量为137.8 pg·g-1, 土壤pH值为7.34, 有机质(SOM)含量为37.85 g·kg-1, 阳离子交换量(CEC)为8.19 cmol·kg-1.
DOM的提取参照相关文献(Baham et al., 1983; 陈同斌等, 2002)中的方法.狗牙根采自三峡库区消落带, 先用去离子水冲洗狗牙根, 然后按1:10的质量比将狗牙根放置于去离子水中, 并在25 ℃下恒温浸泡发酵7~8 d, 发酵液过0.45 μm滤膜, 滤液即为DOMg溶液.新鲜的猪粪采自周边养殖场, 采回的样品经自然风干、磨碎后过0.5 mm筛, 取适量样品于三角瓶中, 按1:20的比例加入超纯水, 在室温下以220 r·min-1的速度振荡12 h, 然后离心分离, 转速为3500 r·min-1, 时间为20 min, 取上清液过0.45 μm的滤膜, 滤液即为DOMz溶液.两种提取液均保存于4 ℃冰箱中待用, 其基本性质如表 1所示.
| 表 1 DOMg、DOMz的基本性质 Table 1 The basic properties of DOMg and DOMz |
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称取20.00 g土壤于200 mL洁净的硼硅玻璃瓶中, 添加250 ng Hg(NO3)2溶液, 再分别加入不同浓度的两种DOM提取液(添加到土壤中的DOM浓度梯度分别为0、50、100、200 mg·kg-1), 然后按土水比3:1加入一定量的超纯水, 放入25 ℃的恒温培养箱中避光培养, 分别在0、10、30、50、80、120 h时取样, 每组3个平行, 并测定土样中的DOM浓度(用溶解性有机碳(DOC)浓度表示)、MeHg含量、THg及溶解态总汞(DTHg).取样时, 土样装入干净的自封袋中, 真空冷冻干燥后, 用玛瑙研钵磨细过100目筛, 冷藏待测.
紫外-可见吸收光谱和三维荧光光谱均采用Horiba公司的Aqualog荧光光谱仪进行测定.紫外-可见吸收光谱的测定方法：将Milli-Q水(18 MΩ·cm)作为空白, 用10 mm石英比色皿在230~800 nm范围内扫描, 波长间隔1 nm, 用355 nm处的吸收系数α(355)表示CDOM的相对浓度, 相关参数如下所述.
吸收系数α(355)=2.303D(355)/r(Bricaud et al., 1981), 其中, D(355)为吸光度, r为光程路径(m), α(355)通常用来表示CDOM的相对浓度(Hong et al., 2005; 刘明亮等, 2009; 闫丽红等, 2013).
SUVA254=α(254)/DOC(苏冬雪等, 2012), 其中, α(254)为254 nm波长处的吸收系数, DOC为溶解性有机碳浓度(mg·L-1), SUVA254用来表征DOM芳香性的强弱(Weishaar et al., 2003).
SUVA260=α(260)/DOC(苏冬雪等, 2012), 其中, α(260)为260 nm波长处的吸收系数, DOC为溶解性有机碳浓度(mg·L-1), SUVA260用来表征DOM疏水性组分含量(Jaffrain et al., 2010).
三维荧光光谱方法：将Milli-Q水作为空白, 激发波长(λEx)的范围为230~450 nm, 增量为5 nm；发射波长(λEm)的范围为250~620 nm, 积分时间3 s, 光源为150 W无臭氧氙弧灯, Aqualog系统自动校正瑞利和拉曼散射.相关荧光参数如下所述：荧光指数(Fluorescence index, FI)为激发波长为370 nm时, 荧光发射强度在发射波长为470 nm与520 nm处的比值(f470/520)(Cory et al., 2005).腐殖化指数(Humification index, HIX)为激发波长为254 nm时, 发射波长在435~480 nm间的区域积分值(∫435~480)与300~345 nm间区域积分值(∫300~345)的比值(Zsolnay et al., 1999).自生源指数(Autochthonous index, BIX)为激发波长为310 nm时, 荧光发射强度在发射波长为380 nm与430 nm处的比值(f380/430)(Huguet et al., 2009).
土样THg使用Milestone公司DMA-80测汞仪直接测定, 仪器检出限为0.5 ng·g-1；土样MeHg采用萃取-乙基化结合气相色谱(GC)-冷原子荧光法(CVAFS)(何天容等, 2004)测定, 检出限为0.6 pg·g-1；土样DTHg采用金汞齐-冷原子荧光法(仇广乐等, 2004)测定, 检出限为0.01 ng·L-1；水样DOC浓度经0.45 μm滤膜过滤后采用Sievers Innovox总有机碳(TOC)分析仪测定, 仪器检出限为0.03 μg·L-1.
2.3 质量控制与数据处理实验中所用的玻璃器皿均在25%(V/V)硝酸溶液中浸泡24 h以上, 然后用超纯水清洗, 在450 ℃下灼烧30 min后使用.实验中所用试剂均为优级纯或色谱纯, 分析过程采用空白试验、平行试验和标准物质回收率等进行质量控制.THg的加标回收率在93%~105%之间, 样品重复测定相对标准偏差(RSD)＜5%, MeHg样品的加标回收率在90%~120%之间, RSD＜8%.实验数据用Excel2010、SPSS19.0进行处理和分析, 图形绘制用Origin9.0进行.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 不同DOM的光谱特征如表 2所示, DOMg和DOMz提取液的α(355)分别为0.345、0.880 m-1, DOMz的α(355)值是DOMg的2.55倍, 说明DOMz提取液中含有较多的共轭双键生色团.DOMz的SUVA254和SUVA260分别为2.596和2.519, 均高于DOMg(SUVA254=1.893, SUVA260=1.805), 说明DOMz的芳香性更强, 所含的疏水性组分更多.李璐璐等(2014)在研究三峡库区典型消落带土壤及沉积物中DOM的紫外-可见光谱特征时发现, SUVA254与SUVA260呈显著正相关关系(r=0.875, p < 0.01), 并得出芳香性结构主要存在于疏水性组分中的结论, 这与本研究结果类似, 从而进一步证明了芳香性结构与疏水性组分的密切关系.
| 表 2 两种DOM的光谱参数 Table 2 The spectral parameters of two types of DOM |
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图 1为两种DOM的三维激发发射矩阵荧光光谱图(3-D Excited Emission Matrix Fluorescence Spectrogram, 3D-EEMs).由图可知, 存在两类3个荧光峰, 分别为类腐殖质荧光峰A、C和类蛋白荧光峰T(高洁等, 2015).其中, A峰为紫外区类腐殖质峰, C峰为可见光类富里酸峰, 主要受腐殖质中的羟基和羧基的影响；T峰为类色氨酸峰, 主要受芳环氨基酸结构的影响.类腐殖质荧光组分与外源腐殖质及底泥腐殖质的释放有关, 类蛋白荧光组分则主要来自内源输入, 包括由微生物、藻类及浮游植物等内源作用产生的部分(高洁等, 2015).
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| 图 1 两种DOM的3D-EEMs谱图(a.DOMg, b.DOMz) Fig. 1 3D-EEMs spectra of the two types of DOM |
由表 2可知, 两种DOM均含有类腐殖质和类蛋白质组分, 但它们的荧光特性却存在较大差异.在DOMg和DOMz的荧光强度中, T峰的荧光强度占比分别为83.8%与69.8%, 所占比例均较高, 说明两者都以类蛋白质组分为主, 且所占的比例要远远高于库区水体的值(5.87%~20.31%)(高洁等, 2015).表明植物降解初期及禽畜粪便初期产生的DOM的活性高于天然水体中存在的DOM(谢理等, 2013).而DOMz中的类蛋白组分多于DOMg, 则主要是来自饲养等人为活动(王齐磊等, 2016).与DOMz比较而言, DOMg的3个荧光峰强度都要低得多, 表明DOMg中含有较少的不饱和物质(Rui et al., 2010).
DOMg、DOMz的FI分别为1.186和1.744(表 2).FI>1.9表示DOM主要源于细菌和藻类活动, 属于内源生产；FI < 1.4表示主要源于陆生植物和土壤有机质, 属于外源(陆源)输入(Mcknight et al., 2001).因此, DOMg的来源以陆源输入为主, 自身生产力贡献相对较低, 这主要是因为植物是从土壤中吸收营养物质, 然后转化为自身的有机物质.而DOMz的来源则是介于陆源输入和内源生产间, 这是因为猪粪中不仅含有外源输入的有机饲料, 还有大量的微生物, 它们对有机质的分解利用也会影响DOM的产生.
DOMg的HIX和BIX分别为0.217、0.888, DOMz的HIX和BIX分别为0.838、0.983.其中, HIX是用于衡量DOM腐殖化程度的指标, BIX则表示自生源的相对贡献程度, 其值越大, 则自生源的贡献越大, 生物可利用性越高.两种DOM的BIX相差不大, 且均在0.8~1.0之间, 表明两种DOM均具有较高的生物可利用性, 易于被微生物分解利用, 从而增加DOM中的类蛋白组分, 这与前文的荧光光谱结果相对应.
3.2 各实验组中土壤MeHg含量与土样提取液中DOM、DTHg的相关性分析各实验组中土壤MeHg含量与DOM、DTHg的相关性分析结果如表 3所示.从表中可以看出, 随着添加的DOM浓度变大, 土壤中MeHg含量与DOM的相关系数也逐渐变大, 当DOM的添加浓度为200 mg·kg-1时, 土壤MeHg含量与土样中的DOM含量的相关系数分别为-0.857和-0.907, 呈显著负相关关系.这可能与汞的生物甲基化有关, 当DOM的添加浓度为200 mg·kg-1时, 汞甲基化微生物的活性显著增强, 将土壤中的二价汞离子转化成了甲基汞, 表明DOM对汞甲基化的影响与DOM的添加浓度有关.同时, 可以看出, 土壤中MeHg含量与DTHg无显著相关性, 这与陈瑞等(2016)的研究结果一致, 可能是因为生物可利用性汞所占总汞的比例较小, 而MeHg的含量又主要与生物可利用性汞相关.
| 表 3 各实验组中土壤MeHg含量与DOM、DTHg的相关系数 Table 3 Correlational analyses between MeHg and DOM, DTHg in treatments |
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图 2是各个处理中MeHg与DOM的变化趋势图.从图中可以看出, 在对照组中, 土壤MeHg含量随时间的延长略微增长, MeHg含量在(90.1±9.2)~(243.9±12.5) pg·g-1范围内变化, 而在实验组中, 土壤甲基汞含量逐渐增加, 培养结束时, 在添加50、100、200 mg·kg-1 DOMg的处理中, 土壤甲基汞含量分别为(310.9±154.8)、(456.3±33.4)、(1129.2±78.6) pg·g-1, 分别增长了234%、308%和646%.同样地, 在添加了相同浓度DOMz的处理中, 土壤MeHg含量分别为(463.0±27.0)、(743.1±68.5)、(1572.0±299.6) pg·g-1, 分别增长了425%、684%、1418%.表明两种DOM均能促进土壤的汞甲基化, 且增长幅度与添加浓度存在正相关关系.同时, 在实验的前80 h内, 土壤MeHg的含量增长缓慢, 可能是因为DOM吸附了土壤中的部分汞离子, 导致生物可利用的汞浓度减少(陈春羽, 2008).而在后40 h, MeHg含量大幅增加, 特别是在高浓度实验组中.这可能是因为在后40 h内, 汞甲基化微生物的活性比较强, 将土壤中的可利用态汞转化为了MeHg(Xiang et al., 2014).已有的研究表明, DOM对汞的甲基化有双重效应, 既能抑制汞的甲基化, 又可以促进汞的甲基化(陈春羽, 2008).DOM对汞甲基化的抑制作用主要是因为DOM可以通过吸附、络合等作用来影响Hg在土壤中的存在形式和迁移转化, 从而降低汞的生物可利用性；另一方面, DOM可以为微生物提供丰富的营养物质, 使微生物的活动增强, 从而促进汞的甲基化, 也有的研究发现部分腐殖酸可以直接参与汞的非生物甲基化(陈春羽, 2008).而在本次实验中发现, DOMg和DOMz这两种提取液均能促进消落带土壤中的汞甲基化.从图 2中还可以发现, 两种DOM提取液的含量均有所下降, 特别是在高浓度处理中, 说明有部分DOM被吸收利用, 一方面是作为营养物质被微生物吸收, 另一方面则可能是用于汞的非生物甲基化.并且从图中可以看出, DOM浓度越高, 其下降程度越大, 表明DOM的添加浓度能够影响微生物对DOM的吸收利用及其非生物甲基化过程.
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| 图 2 各处理中DOM及MeHg含量的变化趋势(a. DOMg, b. DOMz) Fig. 2 Trend charts of DOM and MeHg contents in different treatments |
在培养结束时, DOMg实验组中MeHg的含量为(1129.2±78.6) pg·g-1, 而DOMz实验组中为(1572.0±299.6) pg·g-1, 表明DOMz对土壤汞甲基化的促进作用更显著.一方面是因为芳香性越高的DOM越能促进汞的甲基化(梁俭等, 2016), 由前面的结果可知, DOMz的芳香性高于DOMg.另一方面则是因为DOMz中所含的疏水性组分较高, 导致与DOMz结合的Hg较少, 从而有更多的无机汞被甲基化.此外, 已有的研究已经表明DOM中的类蛋白组分是Hg2+的强有机配位体, 其配位能力强于类腐殖质(何小松等, 2010), 并且类蛋白质组分更易被生物利用, 因此, 类蛋白质组分与Hg2+配位结合后能提高Hg2+的生物可利用性, 通过三维荧光光谱的结果可知, DOMz类蛋白质组分的荧光强度远大于DOMg, 因此, 这也是导致DOMz比DOMg更能促进土壤中汞甲基化的一个重要原因.
培养结束后, 各实验组中土壤MeHg占THg的比例如图 3所示.MeHg/THg可以表征汞发生甲基化的程度(Weber, 1993), 同时也可以反映汞甲基化的速率(Kainz et al., 2006).从图中可以看到, 空白组中MeHg/THg比例较低, 仅为0.16%, 而在实验组中, 这个比例随着添加浓度的增大逐步增加, 当添加浓度达到200 mg·kg-1时, 该比例分别增长为1.03%和1.46%.说明两种DOM都可以加快汞甲基化速率, 促进土壤汞甲基化, 但甲基化程度还是相对较低, 且两种DOM的促进效果存在差异, DOMz的促进效果更为显著, 这与前面的实验结果相一致.
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| 图 3 各处理中土壤甲基汞含量占总汞含量的比例 Fig. 3 The proportion of methylmercury content in soil to total mercury content in each treatment |
1) 紫外-可见光谱特征参数表明两种DOM存在显著的差异, DOMz的CDOM浓度、芳香性及疏水性组分都高于DOMg.
2) 荧光光谱特征参数表明, 两种DOM都以类蛋白物质为主要成分, 但DOMz的生物可利用性要高于DOMg, 且DOMg以外源输入为主, 而DOMz则有内源和外源两种特征.此外, 与DOMg相比, DOMz的腐殖化程度更高, 生物可利用性更强.
3) 模拟实验的结果表明, 两种DOM均能促进库区消落带土壤中汞的甲基化, 同时, 甲基汞含量在培养的后期会急剧增加, 可能与生物甲基化有关.但两种DOM的促进效果存在差异, 造成这种差异的主要原因是两种DOM的芳香性、疏水性组分及所含类蛋白物质的比例不同.
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