环境科学学报  2019, Vol. 39 Issue (9): 3180-3187
雌二醇、壬基酚和三丁基锡对草金鱼血浆卵黄蛋白原含量的联合效应    [PDF全文]
崔晓莹1 , 管博1 , 李正炎1,2     
1. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 青岛 266100;
2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室, 青岛 266100
摘要: 雌二醇(17β-estradiol,E2)是生物合成的天然雌激素,壬基酚(nonylphenol,NP)和三丁基锡(tributyltin,TBT)则是人工合成的环境拟雌激素和环境抗雌激素,这3种污染物在自然水体中均广泛分布,给多种水生生物的健康造成威胁,然而其共同存在下的联合效应尚不明确.本文以草金鱼(Carassius auratus)为受试生物,以鱼体血浆中卵黄蛋白原浓度为观测指标,研究雌二醇和壬基酚的雌激素活性及三丁基锡的抗雌激素活性.在单独暴露实验的基础上,研究3种污染物两两联合及三者联合条件下对雄性草金鱼卵黄蛋白原的联合诱导效应.结果表明,雌二醇和壬基酚均能显著诱导雄性草金鱼合成卵黄蛋白原,三丁基锡对雄性和雌性草金鱼卵黄蛋白原含量均无显著影响.雌二醇和壬基酚共暴露时,壬基酚能促进雌二醇的雌激素效应;雌二醇与三丁基锡共暴露时,后者可抑制雌二醇的雌激素效应;3种污染物共同暴露时,三丁基锡也表现为抗雌激素效应.但壬基酚与三丁基锡共暴露时,后者未能抑制壬基酚的雌激素效应.上述结果表明天然雌激素、拟雌激素和抗雌激素之间存在复杂的联合效应,拟雌激素和抗雌激素的毒性效应并非简单地相互抵消,因此在生态风险评价时需全面评估不同类型环境雌激素之间的复合效应.
关键词: 雌二醇     壬基酚     三丁基锡     卵黄蛋白原     联合效应    
The combined effects of estradiol, nonylphenol and tributyltin on plasma vitellogenin in goldfish Carassius auratus
CUI Xiaoying1, GUAN Bo1, LI Zhengyan1,2    
1. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100;
2. Key Laboratory of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100
Received 23 February 2018; received in revised from 12 April 2019; accepted 12 April 2019
Abstract: 17β-estradiol is a natural estrogen,whereas nonylphenol (NP) and tributyltin (TBT) are synthetic environmental estrogen mimic and antiestrogen,respectively. These three chemicals are widely distributed in natural waters,posing a threat to the health of many aquatic species. However,the combined effects of these chemicals are still unclear. In this study,the estrogenic effects of E2 and NP,and the antiestrogenic effects of TBT were investigated by using plasma vitellogenin (Vtg) induction in male and female goldfish as the endpoint. Based on the results of single exposure experiments,the combined effects of binary and ternary mixtures of E2,NP and TBT were also investigated. The results show that the plasma Vtg could be induced significantly in male goldfish by E2 and NP,but not by TBT in either male or female goldfish. In the combined exposure groups of E2 and NP,the estrogenic effect of E2 could be strengthened by NP. In the combined exposure groups of E2 and TBT,the estrogenic effect of E2 could be weakened by TBT. In the combined exposure groups of ternary mixtures,TBT inhibited the estrogenic effects of E2 and NP as well. However,in the combined exposure groups of NP and TBT,TBT could not inhibit the estrogenic effect of NP in male goldfish. It is supposed that the combined effects of estrogenic chemicals were complicated with the presence of natural estrogen,estrogen mimic and antiestrogen. The effects of estrogen and antiestrogen in combination could not be merely neutralized and comprehensive evaluation of combined effects of various categories of estrogens therefore requires further study for ecological risk assessment in natural environment.
Keywords: estradiol     nonylphenol     tributyltin     vitellogenin     combined effect    
1 引言(Introduction)

环境雌激素(environmental estrogens, EEs)是一种典型的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals, EDCs), 广泛存在于工农业废水、废气和生活污水中, 可以通过水、空气、食品及药品等途径进入有机体, 通过模拟天然雌激素作用干扰生物体内的激素调节过程, 从而危害人类及动物体的生殖、神经和免疫等系统(Kabir et al., 2015), 根据雌激素效应主要分为环境拟雌激素(estrogen mimic)和环境抗雌激素(antiestrogen)两大类.EEs种类复杂, 结构多样, 大多具有脂溶性, 进入生物体后降解缓慢, 因而容易在体内富集, 在极低浓度下就可产生有害作用(Madsen et al., 2004;Brian et al., 2007).EEs在环境中往往不是单一存在, 而是多种类型的污染物同时存在, 其联合作用包括相加、协同和拮抗等(Myers et al., 2009).目前, 关于EEs联合作用的研究已经取得了一定的进展, 但关于不同作用机制的环境雌激素之间的联合作用研究还比较欠缺.本文选取了3种具有代表性的环境雌激素, 环境拟雌激素壬基酚(nonylphenol, NP)、环境抗雌激素三丁基锡(tributyltin, TBT)以及天然雌激素雌二醇(17β-estradiol, E2)的单独及联合作用下的雌激素效应, 并进一步分析其联合作用机制.E2是目前环境中雌激素效应最强的物质之一, 也是生物体内最重要的雌激素, 许多环境激素通过拮抗生物体内E2水平发挥抗雌激素作用(汝少国等, 2015).环境中的E2除了对生物体的生殖系统、免疫系统及神经系统产生损伤外, 还有致癌作用.除了天然雌激素外, 酚类环境雌激素也因其大量使用和激素效应而受到关注.NP广泛存在于我国水环境中(Peng et al., 2006), 具有生物累积性和雌激素效应, 导致生物性别比例失调和繁殖能力下降等.TBT是迄今为止人为引入水环境中毒性最大的化合物之一, 在ng · L-1的浓度水平下就能对生物产生有害效应, 包括性畸变、神经系统和免疫系统损伤等(Morcillo et al., 2000; Graceli et al., 2013).尽管许多国家已限制TBT的使用, 但自然水体中仍广泛检出(Liu et al., 2011; Laitano et al. 2015).

近30年来, 关于环境雌激素的作用方式和对生物体的影响已有大量的体内和体外研究.体外实验因其简便快捷和成本较低等优点而广泛使用(Judson et al., 2010; Connolly et al., 2011), 如细胞增殖试验(李延等, 2003)、肝细胞卵黄蛋白原(Vtg)诱导法(王宏元等, 2011)和雌激素受体(estrogen receptors, ERs)介导的基因表达试验(Yang et al., 2015)等.体外实验可实现化合物的高通量筛选, 但忽略了生物代谢及生物可利用性等特征, 难以精准模拟污染物在生物体内的毒性效应和代谢过程(Folmar et al., 2002; Brandon et al., 2003), 因此筛选结果尚需进一步的体内实验验证.目前, 体内实验的主要受试生物为鱼类, 观测指标主要包括生殖激素水平(Min et al., 2018)、雌鱼产卵量(Länge et al., 2010)、雄鱼中Vtg含量(Staples et al., 2011)、性腺异常(Elias et al., 2010)以及双性鱼的出现等(Jobling et al., 2002).基于雄性动物血浆中Vtg水平的环境雌激素效应测试方法最初由Sumpter等提出(1995), 一直被广泛用作反映环境雌激素污染的重要的生物标志物(Valerio et al., 2008; Yang et al., 2014; 杨倩等, 2018).Vtg是在肝脏中雌激素的作用下合成的大分子磷酸脂糖蛋白, 通过血液循环输送到卵巢, 为胚胎发育提供营养(Mommsen et al., 1988; Bernanke et al., 2009).在雄性生物个体和幼体中Vtg含量极低, 但其肝脏中也存在Vtg基因, 在外源雌激素类污染物暴露下, 雄鱼和幼体也可以合成Vtg(Denslow et al., 1999;Leet et al., 2011).本研究以草金鱼为受试生物, 采用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定暴露于环境雌激素15 d的草金鱼血浆中Vtg含量, 研究3种环境雌激素的单独及联合雌激素效应.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料

草金鱼(Carassius auratus)购自青岛南山花鸟鱼虫市场, 平均体长(9.55 ± 0.65) cm, 平均湿重(28.57 ± 4.63) g, 在实验室暂养一段时间后, 挑选活泼健康的个体, 模拟实验条件驯养一周后进行毒性暴露实验.每天喂干饲料(Porpoise, 江门)1次, 在实验开始前24 h停止喂食.

试剂:17β-雌二醇(E2, >97.0%, TCI)、壬基酚(NP, 97.0%, Sigma-Aldrich)、三正丁基氯化锡(TBTCl, 99%, 百灵威), 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222, 98%)、抑肽酶(6000 U · mg-1)、肝素钠(170 U · mg-1)均购自北京百灵威科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、TMB单组份显色液均购自北京索莱宝科技有限公司.实验用金鱼Vtg标准品、金鱼卵黄脂磷蛋白(Lv)抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Lv抗体均由中国海洋大学海洋生命学院生态毒理学实验室所赠.由于Vtg性质不稳定, 不易保存, 在反复冻融过程中易降解, 但Lv有很高的热稳定性, 另外Vtg与Lv有相似的免疫源性, 因此本研究中利用Lv抗体来检测Vtg含量.

2.2 实验方法 2.2.1 草金鱼暴露过程

实验在水温(27± 1) ℃、光照14 h(L): 10 h(D)和连续曝气条件下进行.暴露容器为30 cm× 25 cm× 25 cm玻璃缸, 玻璃缸中加入10 L经24 h连续曝气除氯的自来水, 并在每个玻璃缸中添加受试物至对应暴露浓度, 混匀.每组随机放入实验用草金鱼7尾, 每天更换全部暴露液以保持药物浓度稳定, 并使用空气泵不间断曝气, 保证溶解氧浓度不低于饱和值的60%.实验暴露期为15 d.

2.2.2 受试化合物浓度设计

E2、NP和TBT的单独暴露:E2 5、15、50、150和500 ng · L-1;NP 5、15、50、150和500 μg · L-1;TBT 0.5、1.5、5、15 μg · L-1.

E2和TBT共暴露组:5 ng · L-1 E2 + 0.5 μg · L-1 TBT, 5 ng · L-1 E2 + 15 μg · L-1 TBT, 15 ng · L-1 E2 + 0.5 μg · L-1 TBT和15 ng · L-1 E2 + 15 μg · L-1 TBT.

NP和TBT共暴露组:5 μg · L-1 NP + 0.5 μg · L-1 TBT, 5 μg · L-1 NP + 15 μg · L-1 TBT, 15 μg · L-1 NP + 0.5 μg · L-1 TBT和15 μg · L-1 NP + 15 μg · L-1 TBT.

E2和NP共暴露组:5 ng · L-1 E2 + 5 μg · L-1 NP, 5 ng · L-1 E2 + 15 μg · L-1 NP, 15 ng · L-1 E2 + 5 μg · L-1 NP和15 ng · L-1 E2 + 15 μg · L-1 NP.

E2、NP和TBT共暴露组:5 ng · L-1 E2 + 5 μg · L-1 NP+ 0.5 μg · L-1 TBT, 5 ng · L-1 E2+ 5 μg · L-1 NP+ 15 μg · L-1 TBT, 15 ng · L-1 E2+ 15 μg · L-1 NP+ 0.5 μg · L-1 TBT和15 ng · L-1 E2+ 15 μg · L-1 NP + 15 μg · L-1 TBT.

每个实验组设两个平行.实验设置1个空白对照和1个溶剂(0.01%丙酮)对照.

2.2.3 实验步骤

暴露实验结束后, 随机选取3条雄鱼, 以200 mg · L-1的MS-222将鱼麻醉, 用1%肝素钠润洗的1 mL一次性注射器从尾静脉处抽取血液, 置于含10 μL 3%肝素钠溶液和10 μL抑肽酶的离心管内, 于4 ℃, 3000 r · min-1离心15 min后, 取上层血浆分装, -80 ℃保存待测.

向96孔酶标板中加入100 μL经碳酸钠包被缓冲液稀释的金鱼Lv抗体, 用封板膜封板后4 ℃包被过夜;次日揭开封板膜, 弃去孔中液体, 使用洗涤液(0.05% Tween-20的PBS)洗板3次后, 向每孔加入200 μL封闭缓冲液(2% BSA, 0.1% Tween-20的PBS), 37 ℃条件下封闭1 h以上;弃去液体, 洗板3次后, 加入100 μL标准品或者稀释一定倍数后的样品, 37 ℃温育1 h;洗板5次, 每孔加入100 μL HRP标记的Lv抗体, 37 ℃孵育1 h;洗板5次后, 每孔加入100 μL TMB单组份显色液, 37 ℃显色10 min后, 加入100 μL 2 mol · L-1的H2SO4终止反应, 使用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值.该方法Vtg检测限为1.95 ng · mL-1.

2.3 数据分析

各组数据均以平均值±标准偏差(Mean ± SD)表示, 并应用SPSS 20.0对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 采用Tukey法检验显著性差异, p ≤ 0.05为差异显著.

3 结果(Results)

15 d暴露实验结束后, 各暴露组草金鱼无行为异常也无死亡现象, 故3种受试化合物在实验暴露浓度范围内对草金鱼无显著急性毒性.

3.1 雌二醇、壬基酚和三丁基锡单独暴露对草金鱼血浆中Vtg的诱导效应

15 d暴露实验结束后, 空白和溶剂对照组的雄性金鱼血浆中均未检测到Vtg, 说明溶剂对草金鱼血浆Vtg无影响.实验选取的E2各暴露浓度对雄性草金鱼Vtg均有显著诱导效应(图 1a), Vtg浓度随E2浓度的增加而升高(1.47×103 ~ 1.95×106 ng · mL-1), 当E2浓度为500 ng · L-1时, 达到最大诱导效应.E2浓度与Vtg含量呈明显的剂量-效应关系(图 1b), 运用DoseResponse函数进行非线性拟合效果较好(R2=0.98).由拟合曲线可得E2的半效应浓度(EC50)为144.17 ng · L-1, 该结果与之前的研究结果相似(14 d EC50=225 ng · L-1, Sun et al., 2009a).

图 1 E2暴露对雄性草金鱼血浆中Vtg的影响 (**表示实验组与对照组相比差异极显著(p < 0.01), 每组数据样本量n=3, 下同) Fig. 1 Effects of E2 on plasma Vtg concentrations in male goldfish

实验选取的NP各暴露浓度对雄性草金鱼Vtg均有显著诱导效应(图 2), Vtg浓度随NP浓度的增加而升高(562.04 ~ 2.30×105 ng · mL-1), 当NP浓度为150 μg · L-1时, 达到最大效应, 继续增加NP浓度至500 μg · L-1时, Vtg浓度未继续升高.

图 2 NP暴露对雄性草金鱼血浆中Vtg的影响 Fig. 2 Effects of NP on plasma Vtg concentrations in male goldfish

对于抗雌激素TBT, 本研究分别探讨了其对雄性和雌性草金鱼血浆Vtg表达的影响, 结果表明, 各浓度组雄鱼血浆中均未检测到Vtg.对于雌性草金鱼, 各TBT暴露组中对Vtg含量介于6.82×104 ~ 1.16×105 ng · mL-1之间(图 3), 但与对照组相比均无显著性差异, 这可能是由于草金鱼对TBT的敏感性较弱或者暴露时间太短, 导致抗雌激素效应不明显.

图 3 TBT暴露对雌性草金鱼血浆中Vtg的影响 Fig. 3 Effects of TBT on plasma Vtg concentrations in female goldfish
3.2 雌二醇、壬基酚和三丁基锡对雄性草金鱼血浆中Vtg的联合诱导效应

在E2和TBT的联合暴露组(图 4a), 各实验组与空白对照组相比, Vtg含量明显上升.当E2浓度较低时(5 ng · L-1), 分别与0.5 μg · L-1 TBT和15 μg · L-1 TBT联合暴露, 雄鱼血浆中的Vtg浓度与E2单独暴露组相比无显著性差异, TBT抗雌激素效应不明显.当E2浓度较高时(15 ng · L-1), 分别与0.5 μg · L-1 TBT和15 μg · L-1 TBT联合暴露, 随着TBT浓度的增加, 血浆Vtg浓度下降, 在15 μg · L-1 TBT联合暴露组中, Vtg浓度与E2单独暴露组相比下降显著.

图 4 E2,NP和TBT两两联合及三者联合暴露对雄性草金鱼血浆中Vtg的影响 Fig. 4 Effects of binary mixtures and ternary mixtures of E2, NP and TBT on plasma Vtg concentrations in male goldfish

在NP和TBT的联合暴露组(图 4b), 与空白对照组相比, 各暴露组Vtg浓度均有所上升.当NP处于低剂量(5 μg · L-1)时, 与0.5 μg · L-1 TBT联合暴露, 雄鱼血浆中Vtg浓度与NP单独暴露组相比未出现显著性变化;与15 μg · L-1 TBT联合暴露, Vtg浓度显著升高.当NP处于高剂量(15 μg · L-1)时, 与0.5 μg · L-1 TBT联合暴露同样导致雄性草金鱼Vtg含量显著升高, 但随着TBT浓度继续增加至15 μg · L-1时, Vtg含量下降至NP单独暴露时的水平.

在E2和NP的联合暴露组(图 4c), 5 ng · L-1 E2分别与不同浓度的NP联合暴露, 雄鱼血浆中Vtg浓度与E2单独暴露相比, 均无显著性差异.在15 ng · L-1 E2 + 5 μg · L-1 NP联合暴露组, Vtg浓度较E2单独暴露无显著性差异.在15 ng · L-1 E2+15 μg · L-1 NP联合暴露组, Vtg浓度与E2单独暴露相比显著上升, 为E2单独暴露的9.67倍.

E2、NP和TBT三者联合暴露对雄性草金鱼血浆Vtg浓度的影响如图 4d所示.当E2和NP都处于较低浓度(E2=5 ng · L-1和NP=5 μg · L-1)时, 与两种浓度的TBT联合暴露, Vtg浓度相较于E2和NP两者联合暴露具有显著的下降.当E2和NP都处于较高浓度(E2=15 ng · L-1和NP=15 μg · L-1)时, 与TBT联合暴露, Vtg浓度相较于E2和NP两者联合暴露也显著下降, Vtg浓度降低了约一个数量级.该结果表明, 加入TBT后显著降低了E2和NP诱导的Vtg含量.

4 讨论(Discussion) 4.1 雌二醇、壬基酚和三丁基锡单独作用下对草金鱼血浆卵黄蛋白原含量的影响

本研究选用的草金鱼属于鲤科金鱼, 其地域分布广, 较易获得且易于饲养, 已作为实验动物用作毒理学研究(Toyoizumi et al., 2008; Nelson et al., 2016).本文以草金鱼为受试生物进行Vtg的诱导实验, 结果表明雄性草金鱼对雌激素的敏感性较强, 在E2和NP的实验浓度范围内均显著诱导Vtg的表达, 与前期研究报道结果相似(Sun et al., 2009a; 刘萍等, 2010).许多研究结果表明, 暴露于环境雌激素中会导致鱼类的生长和形态发生显著变化, 尤其是在雄性鱼中(Sun et al., 2009b).E2通过ER介导途径诱导雄鱼肝脏中产生Vtg, 且雄鱼体内不存在卵巢, 无法利用Vtg, 使其滞留在血液中.与E2相比, NP的雌激素活性低3~4个数量级(Seki et al., 2010), 这是因为NP对雌激素受体的亲和力远远小于E2, 但其生物效应不容忽视.Silva等(2002)研究表明, 8种环境弱雌激素以低于无可见效应浓度(NOEC)联合暴露时能够产生显著的雌激素效应, 因此, 仅测试单一污染物的雌激素效应可能忽略物质间存在的交互效应(Yang et al., 2017).而暴露于TBT各浓度组中的雄鱼血浆中均未检测到Vtg, 这与雄鱼体内卵黄蛋白原表达量较少有关, 正常情况下雄鱼或幼鱼体内Vtg水平很低, 只有受到外源雌激素的影响时才会产生Vtg.有研究表明, 罗氏沼虾暴露于不同浓度的TBT中10 d, 雄虾精巢中Vtg基因的表达无显著性变化(吴维福等, 2013), 这在一定程度上证实了上述结论.同时, 在实验浓度范围内雌鱼血浆Vtg含量也未产生显著性变化, 这可能与草金鱼对TBT的敏感性较弱有关.

4.2 雌二醇、壬基酚和三丁基锡对雄性草金鱼血浆卵黄蛋白原含量的联合效应

在E2和TBT联合暴露组中, 当E2浓度较高时, TBT可抑制E2的雌激素效应, 并且随TBT浓度的升高, 抑制作用增强, 该结果表明TBT的抗雌激素作用与E2浓度呈现了很强的相关性.同样地, 当E2和NP浓度较低时, 加入TBT可部分抑制E2和NP的雌激素效应, 当E2和NP浓度较高时, 加入TBT可使雄鱼血浆中Vtg的诱导量降到E2和NP联合暴露组的1/10, 其抗雌激素效应更加显著.有研究指出, TBT为芳香化酶抑制剂, 可明显抑制鱼类卵巢和脑部芳香化酶基因(cyp19a1a, cyp19a1b)的表达, 从而抑制芳香化酶活性而产生抗雌激素效应(Oberdörster et al., 2002; Tian et al., 2015).E2的合成需要多种类固醇合成酶的参与, 其中, 芳香化酶是雄激素睾酮(T)芳构化生成E2的重要催化剂, 是内源雌激素合成的关键酶.由此推测TBT可能通过抑制芳香化酶的活性而降低血浆中E2浓度, 使E2诱导Vtg含量降低, 表现出抗雌激素效应.Lv等(2008)研究发现, 将雄性泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)暴露于E2和TBT的混合物14 d后, TBT也可显著抑制E2诱导的Vtg产生.许多研究结果表明雌激素与抗雌激素的拮抗作用(Santos et al., 2006; Sun et al., 2009b), 但不表示对生物体的毒性效应减弱, 反而可能增强.

在NP和TBT的联合暴露中, TBT和NP以不同的浓度混合, TBT均未能抑制NP的雌激素效应, 相反, TBT和NP联合暴露后Vtg的含量较NP单独暴露时增大, 从而推测芳香化酶并不是TBT作用的唯一靶点.有研究表明, TBT的生殖毒性机制还与维甲酸X受体(RXR)、芳烃受体(AhR)等有关(Nishikawa et al., 2004; Kim et al., 2015), 因此, 仅凭Vtg的表达无法详细阐明TBT的抗雌激素效应机制, 需要补充如芳香化酶及其表达基因和其他受体的表达等实验.此外, 环境拟雌激素与环境抗雌激素间可能呈现复杂的交互作用, 扰乱鱼体内的正常内分泌效应.如向宵(2012)研究了环境雌激素o, p′-DDT和抗雌激素TAM共暴露对斑马鱼胚胎的联合效应, 发现高浓度的TAM显示出弱雌激素作用.Sun等(2011)研究了EE2与环境抗雌激素来曲唑(LET)的联合效应, 发现共暴露时LET下调了雄性青鳉鱼肝脏的vtg1的表达, 但当EE2与TAM共暴露时, vtg1的表达量比EE2单独暴露时都高.

在鱼体内, Vtg的表达受内源E2的调控(Iris et al., 2010), 并且E2浓度越高Vtg及其相关基因的表达越显著(Villeneuve et al., 2009).在E2和NP的联合暴露组, 当E2和NP浓度都较低或者其中一个较低时, 联合雌激素效应更接近于E2单独暴露时的效应.这是因为E2与雌激素受体ERs的亲和能力远远大于NP, 故E2对Vtg浓度的影响更明显.NP可模拟E2与ER结合形成复合物, 并与DNA结合区的反应元件结合, 诱导靶基因的转录, 启动一系列雌激素依赖性生理生化过程.在本实验中, 当E2和NP浓度均较高时, 联合暴露组的Vtg浓度远大于相同浓度的E2与NP单独暴露时Vtg浓度之和, 表明NP可明显增强E2的雌激素效应.吕雪飞等(2007)研究发现E2与NP的二元混合物对雄性泥鳅Vtg的诱导效应显著高于E2和NP单独暴露时诱导量的和, 且与暴露时间和剂量相关.杨丽丽等(2011)在研究E2和NP对唐鱼(Tanichthys)的联合雌激素效应时也得出类似结论, E2与NP表现为协同诱导作用.综上所述, E2和NP在一定浓度下的混合物与ER结合的亲和力提高, 或者使雌激素调节的生物反应活性提高, 从而表现出相加或协同作用.

5 结论(Conclusions)

1) E2和NP单独暴露均能显著诱导雄性草金鱼血浆中Vtg的表达, 而TBT单独暴露对草金鱼血浆中Vtg浓度无显著影响.

2) 当E2和TBT联合暴露时, TBT能够抑制E2的雌激素效应, 且随TBT浓度增加, 抑制作用增强.

3) 当NP和TBT联合暴露时, TBT未能抑制NP的雌激素效应.

4) 当较高浓度的E2和NP联合暴露时, NP能促进E2的雌激素效应.

5) E2、NP和TBT三者联合暴露时, TBT表现为E2和NP雌激素效应的抑制作用.

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