1 引言(Introduction)

土壤重金属污染是当前土壤环境污染问题中最严重的问题之一.常见的重金属种类有汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)、铬(Cr)和铜(Cu)、镍(Ni)、钴(Co)、锌(Zn)、锰(Mn)等, 其多来源于工矿“三废”排放、金属冶炼、交通运输和农业面源等人类活动(秦樊鑫等, 2015；陈奕云等, 2016；陈卫平等, 2018).有研究表明植物根系分泌的低分子量有机酸可以酸化土壤、改变土壤中重金属的赋存形态、提高土壤重金属的生物有效性, 是植物修复方法中重要的影响因素之一(李韵诗等, 2015；罗有发等, 2015；Antoniadis et al., 2017).

低分子量有机酸(Low mass weight organic acids)是一类至少含有一个羧基基团(—COOH)、分子量低于300的碳链类脂肪族化合物, 如苹果酸、甲酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、丁二酸等, 是植物-土壤界面上碳循环的最活跃形式, 低分子量有机酸主要来源于植物根系分泌、植物凋落物的降解和土壤微生物的代谢等过程(Bais et al., 2006；Haichar et al., 2014；赵宽等, 2016).低分子量有机酸通过自身吸附作用改变土壤胶体的表面电荷、与重金属形成有机络合物等机制影响土壤重金属的吸附-解吸特征, 对土壤-植物界面的许多生理生化进程也有促进作用.因此, 低分子量有机酸的浓度、种类、羧基基团数目和土壤重金属的浓度、存在形态等因素对植物-土壤界面重金属生物有效性具有重要影响(赵雨森等, 2010；傅晓萍等, 2010；刘世亮等, 2012；黄国勇等, 2014；刘江等, 2014；刘江等, 2016).

众多研究表明低分子量有机酸能提高重金属的生物有效性, 增强植物吸收土壤中重金属的能力, 然而低分子量有机酸的浓度与其提取的重金属含量之间的具体关系尚不明确(陈英旭等, 2000；倪才英等, 2004；王淑君等, 2008；杨杰文等, 2011).因此, 明确低分子量有机酸浓度与其提取的重金属含量之间的变化关系并建立拟合模型是十分必要的, 可以借此确定外源低分子量有机酸添加的最低浓度, 有助于促进植物修复土壤重金属污染的技术的设计和使用.本文选择了两种土壤中常见的低分子量有机酸：苹果酸和甲酸, 以从安庆市某铜矿区采集的土壤样品为例, 研究了不同浓度苹果酸、甲酸对采样点及其周围土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb提取能力的影响, 并验证方程对于苹果酸、甲酸提取土壤中重金属含量拟合的可行性.

2 材料和方法(Material and methods) 2.1 供试土壤的采集与处理

供试土壤采自安徽省安庆市某铜矿区周围10 km以内的0~20 cm表层土壤, 共采集10个采样点的土壤, 每个采样点按“×”采集5处土壤样品混合成一份, 分别标记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10, 将采集的土壤样品挑出植物根系、碎屑、动物残体和砂砾后, 放在室内通风区自然风干, 用研磨设施将风干后的土壤样品碾压、磨碎后过200目的土壤筛, 保存备用.这10个土壤采样点的基本理化性质如表 1所示, 表 1中pH的测定、有机质含量的测定、阳离子交换量(CEC)和重金属总量的测定方法根据鲍士旦的方法进行分析(鲍士旦, 2000).试验于2018年4—6月开展, 每组试验重复3次, 分析计算采用3次试验数据的平均值.

土壤中有机酸含量的提取与测定：主要测定草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和丁二酸等5种有机酸.将采集的新鲜土样去除其中的根屑、杂质等, 称取5 g置于50 mL的三角锥形瓶中, 加入25 mL 0.1%的H₃PO₄溶液, 用玻璃棒搅拌使土壤溶液均匀混合后, 在往复振荡机上振荡2 h, 之后将溶液整体转移至50 mL的离心管中, 在离心机中以10000 r·min^-1离心10 min, 取出上清液过0.22 μm的水相滤膜.参考有机酸的相关参考文献(叶思诚等, 2013黄天志等, 2014；Kong et al., 2018；), 利用Waters Acquity H-Class UPLC (ultra-performance liquid chromatography)超高效液相色谱仪, 配置四元超高压溶剂系统、样品自动进样器、柱温箱、可调紫外检测器和Empower 3色谱工作站分析有机酸的含量.确定紫外检测波长为210 nm和色谱柱为反相色谱柱(BEH C18色谱柱, 2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)之后, 其他的相关分析条件经过优化之后确定如下：进样量：1 μL；流动相：10 mmol·L^-1 KH₂PO₄(用1 mmol·L^-1的H₃PO₄调节pH至(2.20±0.10)；流速：0.30 mL·min^-1；柱温：30 ℃.

土壤中铁铝氧化物含量的测定参考相关文献(郭杏妹等, 2007；衡利沙等, 2010；)；碳酸盐含量的测定选取文献中的改良气量法(王莲莲等, 2013).

2.2 苹果酸和甲酸溶液的配制

实验所用的苹果酸、甲酸均为国药试剂公司提供的分析纯试剂, 配制浓度为0.5 mol·L^-1的两种有机酸储备液, 分别稀释到0、1、2、5、10、20、50、100 mmol·L^-1等8个浓度的有机酸标准使用液, 定容后标记待用.实验用水为去离子水.

2.3 苹果酸和甲酸提取土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb的过程及重金属含量检测

称取2.0 g采样点S1的土样置于锥形瓶中, 依次分别加入50 mL已配制好的0、1、2、5、10、20、50、100 mmol·L^-1这8个浓度的苹果酸、甲酸标准使用液, 充分混合, 振荡2 h后, 离心, 分别取各自上清液, 利用原子吸收分光光度计分析各自的上清液中的重金属Cu、Mn、Zn、Pb含量.苹果酸、甲酸提取采样点S2、S3、S4……S10及检测重金属Cu、Mn、Zn、Pb含量的方法同上所述.

2.4 苹果酸和甲酸对土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb提取能力的拟合模型

根据有机酸浓度及其所提取出的重金属含量, 建立有机酸浓度与其所提取的重金属含量之间的模型, 该模型方程如下：

(1)

式中, N表示有机酸的浓度(mmol·L^-1)；M表示有机酸提取的土壤重金属含量(mg·kg^-1土样)；M₀表示有机酸浓度为0 mmol·L^-1时提取的重金属含量, 即重金属含量的本底值；M_max表示重金属含量被有机酸浓度饱和时的提取量, 即最大提取量；b为常数.

2.5 确定土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb最大提取量时有机酸浓度阈值

根据拟合方程(1)中的M_max表示重金属含量被有机酸浓度饱和时的提取量, 将M=M_max代入方程(1)中, 可得方程(2).

(2)

从而可以求出提取土壤中重金属所用的低分子量有机酸的浓度阈值|N_max|, 如方程(3)所示.

(3)

3 结果与分析(Result and analysis) 3.1 苹果酸和甲酸对土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb释放能力的影响

由图 1可知, 随着苹果酸浓度的升高, 所有土壤中的4种重金属Cu、Mn、Zn、Pb的释放量都会增加.苹果酸对S6采样点处土壤表层中重金属Mn、Zn的提取率最高, 达70.02%和81.74%, S8采样点处重金属Cu的提取率最低, 为4.43%, 这可能是与土壤中重金属的总量及赋存形态及土壤pH等因素有关.随着苹果酸浓度的增加, Cu的释放量增加的最大区间在苹果酸浓度为0~20 mmol·L^-1, 其最大释放量出现在苹果酸浓度为50~100 mmol·L^-1(图 1a)；当苹果酸浓度升高至5 mmol·L^-1以上时, Mn的释放量快速增加(图 1b)；当苹果酸浓度升高至10 mmol·L^-1以上时, 采样点土壤S6的Zn的释放量快速增加, 其他采样点土壤增加速率较慢(图 1c)；随着苹果酸浓度的升高, Pb的释放量增加, 但增加的趋势缓慢(图 1d).

由图 2可知, 随着甲酸浓度的升高, 所有10个采样点土壤中的4种重金属Cu、Mn、Zn、Pb的释放量越来越多.甲酸对S6采样点处土壤表层中Mn的提取率最高, 达42.03%, Zn次之, S10处Cu的提取率最低, 为3.99%.当甲酸浓度为0~20 mmol·L^-1时, 4种重金属元素的释放量随着甲酸的浓度大致呈线性增加的趋势；当甲酸浓度为20~50 mmol·L^-1时, 重金属的释放量持续增加, 但增加较为缓慢；当甲酸浓度为50~100 mmol·L^-1时, 重金属的释放量达到最大.

研究表明, 低分子量有机酸提取土壤重金属的能力与有机酸本身的性质有关, 如有机酸的种类及羧基数目、浓度、有机酸-重金属络合物的稳定性等(倪才英等, 2004；宋金凤等, 2010；赖彩秀等, 2016).本实验研究发现, 苹果酸和甲酸这两种低分子量有机酸对土壤中的Cu、Mn、Zn、Pb 4种重金属具有较强的释放能力.其中, 随着有机酸浓度升高, 10个采样点土壤中Cu的释放量也在增加.两种有机酸在低浓度时(有机酸浓度＜10 mmol·L^-1)对采样区土壤中Cu的提取增加量不明显；当有机酸浓度逐渐升高, Cu的提取量显著增加, 50 mmol·L^-1的苹果酸对土壤中Cu的释放量最为明显, 该浓度时苹果酸提取的S2、S3和S4土壤Cu的释放量是甲酸处理的土样的2倍、2.692倍和3.962倍(图 1a和图 2a), 此时苹果酸对土壤中Cu的解吸附能力最强.Mn最大提取量出现在两种有机酸浓度为100 mmol·L^-1时, 此浓度时苹果酸对10个土壤采样点的最大提取量均显著高于甲酸的最大提取量, 其中以S3和S4土壤Mn释放量的差异最大, 苹果酸提取的S3和S4土壤Mn的释放量比甲酸处理的土样分别高出2.389倍和2.346倍(图 1b和图 2b).两种有机酸对土壤Zn的提取能力呈相同的变化趋势, S6和S8土壤Zn释放量最大, 其它土样点则增加趋势缓慢(图 1c和图 2c).两种有机酸对土壤Pb的释放能力都不显著, 但苹果酸对土壤Pb的提取能力大于甲酸(图 1d和图 2d).这说明苹果酸和甲酸浓度的升高能显著提升土壤中重金属的含量, 但苹果酸和甲酸对同种重金属元素的提取能力的不同, 具体表现为苹果酸对于重金属的提取能力大于甲酸, 这与两种有机酸的性质有关.由表 2可知, 苹果酸含有2个羧基基团, 可两步解离, 其离解常数分别为K_a1=4.0×10^-4, K_a2=8.9×10^-6；甲酸只有1个羧基基团, 其离解常数K_a=1.8×10^-4, 即甲酸解离出的可与土壤中重金属进行络合的有机酸离子较少, 对重金属提取能力的影响较小；而苹果酸能解离出较多的游离的低分子有机酸离子, 再加上其较强的络合能力, 使得苹果酸可以从土壤中提取出更多的重金属.另外, 苹果酸与土壤中的重金属形成的络合物的稳定性高于甲酸与土壤中的重金属形成的络合物.因此, 苹果酸与甲酸相比具有更大的从土壤中提取重金属的能力, 这与前人的研究结果一致(王淑君等, 2008；李鹏等, 2010；杨杰文等, 2011；李玉姣等, 2014).

3.2 苹果酸、甲酸提取土壤重金属Cu、Mn、Zn、Pb的拟合方程

随着有机酸浓度升高, 土壤重金属的释放量呈现有规律的变化趋势(胡浩等, 2008).本实验研究经过多种拟合曲线的拟合、比较并结合实验数据的分析, 得到方程可用于拟合低分子量有机酸浓度与土壤中重金属提取量之间的关系.以从安徽省安庆市某铜矿区采集的土壤样品和低分子量有机酸中的苹果酸、甲酸为例, 进行不同浓度低分子量有机酸与土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb提取量的拟合方程验证实验, 结果如表 3所示.利用该拟合方程表征低分子量有机酸浓度与土壤重金属提取量之间的关系具有较好的可行性, 其决定系数R²在0.8293~0.9990之间, 都具有显著性意义(p＜0.05).其中苹果酸、甲酸提取土壤中重金属Mn、Pb的拟合性具有极强的显著性意义(p＜0.005).胡浩等(2008)研究表明Pb、Cu和Zn等土壤重金属的释放量随着柠檬酸、草酸、酒石酸等低分子量有机酸浓度的增加而增加, 其累积释放曲线特征与本文曲线变化趋势一致.

3.3 苹果酸和甲酸提取土壤中重金属Cu、Mn、Zn、Pb的浓度阈值

根据2.4和2.5节中的拟合方程可以计算出低分子量有机酸提取土壤重金属的浓度阈值, 使得不同土壤重金属的提取结果具有可比性.由表 4可知, 苹果酸和甲酸提取的土壤中的重金属Cu、Mn、Zn、Pb的浓度阈值中, 提取重金属Mn、Zn所需要的低分子量有机酸的浓度阈值较大, Pb最小.S6和S10采样点处的提取重金属Mn所需的甲酸的浓度阈值普遍高于其他采样点, 而苹果酸的浓度阈值在S2和S3采样点处最高, 苹果酸和甲酸提取土壤中重金属的顺序均为Mn>Zn>Pb.

4 讨论(Discussion)

低分子量有机酸在提高重金属活性、强化植物修复效果方面发挥重要作用(宋金凤等, 2010).随着有机酸浓度的增加, 提取的重金属含量也在缓慢增多.在一定浓度范围内低分子量有机酸浓度对土壤中重金属的提取量随着有机酸浓度的升高, 呈现有规律的变化趋势(倪才英等, 2004；胡浩等, 2008；王淑君等, 2008；杨杰文等, 2011).本文首次提出利用拟合方程来表征不同浓度低分子量有机酸与其提取的土壤种重金属含量之间的关系.以采集自安庆市某铜矿区中低分子量有机酸含量大致相同, 但重金属活性和含量差异较大的土壤样品进行实验研究, 并结合线性方程、多项式和幂指数等公式, 通过sigmaplot 12.5软件进行数据拟合, 发现方程对于不同浓度低分子量有机酸与提取的重金属含量之间的关系具有较好的拟合性, 其决定系数R²在0.8293~0.9990之间, 都具有显著性(p＜0.05).在植物修复土壤重金属污染工程中, 通过该拟合模型不仅可以定量表征不同浓度低分子量有机酸和提取土壤重金属的含量之间的关系, 还可以计算出土壤中各重金属最大提取量时的有机酸浓度阈值, 使得同种低分子量有机酸对土壤中不同种重金属间的提取结果具有可比性, 苹果酸和甲酸提取的土壤中重金属含量大小均为Mn>Zn>Pb.另外, 确定外源有机酸添加的最低含量.有利于控制外源低分子量有机酸的添加, 有助于深化植物修复土壤重金属污染理论基础, 提高工程实施效率.

不同浓度苹果酸和甲酸对采样点土壤中重金属的提取量不同, 100 mmol·L^-1苹果酸和甲酸对重金属Mn的提取量最大, 分别为322.5 mg·kg^-1和193.58 mg·kg^-1, 提取率达70.02%和42.03%, Zn、Pb次之, Cu最低, 分别为20.90、15.23、5.45和13.40、12.38、2.73 mg·kg^-1.同浓度的苹果酸和甲酸对于不同种重金属的提取能力表现为：苹果酸>甲酸, 这可能与低分子量有机酸的化学结构、羧基数量和离解常数以及形成的络合物的稳定性有关.由表 2可知, 苹果酸的羧基数量和离解常数都大于甲酸, 换言之, 同浓度下苹果酸能解离出较多的游离的低分子有机酸离子, 使得苹果酸可以从土壤中提取出更多的重金属.再加上苹果酸与土壤中的重金属形成的络合物的稳定性高于甲酸与土壤中的重金属形成的络合物.因此, 苹果酸与甲酸相比具有更大的从土壤中提取重金属的能力, 即同浓度相同含量的苹果酸在植物修复过程中提取的重金属Cu、Mn、Zn和Pb含量多于甲酸的提取量.赵雨森等(2010)和宋金凤等(2010)在研究了不同浓度柠檬酸和草酸对复合土壤重金属有效性的影响时也有相同的发现.在植物修复土壤重金属污染工程中, 外源苹果酸的加入会促进植物富集效果的增加, 提高重金属的活性, 降低其的生物毒性, 为植物修复土壤重金属Cu、Mn、Zn和Pb的污染提供参考(黄国勇等, 2014).

5 结论(Conclusions)

1) 随着有机酸浓度升高, 土壤重金属的释放量呈现有规律的变化趋势；不同种低分子量有机酸对土壤中重金属的提取能力表现为：苹果酸>甲酸, 这与两种有机酸的化学结构、离解常数以及与土壤重金属形成的络合物的稳定性有关.

2) 在一定浓度范围内, 低分子量有机酸的浓度与其提取的土壤种重金属含量之间的有线性关系, 拟合方程可表征不同浓度低分子量有机酸与其提取的土壤种重金属含量之间的关系且具有较好的拟合性, 其决定系数R²在0.8293~0.9990之间, 都具有显著性(p＜0.05).

3) 该模型方程能定量表征低分子量有机酸对土壤重金属的提取能力, 使得同种低分子量有机酸对土壤中不同种重金属间的提取结果具有可比性, 苹果酸和甲酸提取土壤中重金属的顺序均为Mn>Zn>Pb.