环境科学学报  2018, Vol. 38 Issue (10): 4133-4141
引用本文
王冰, 郭书海, 李凤梅, 等. 2018. 电动-微生物修复对胶质结构的改变及毒性的削减[J]. 环境科学学报, 38(10): 4133-4141.
Wang B, Guo S H, Li F M, et al. 2018. The structure variation and toxicity reduction of resin via electrokinetic-bioremediation[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 38(10): 4133-4141.
电动-微生物修复对胶质结构的改变及毒性的削减    [PDF全文]
王冰1,2,3 , 郭书海1,2 , 李凤梅1,2 , 王卅1,2 , 吴波1,2     
1. 中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016;
2. 污染土壤生物-物化协同修复技术国家地方联合工程实验室, 沈阳 110016;
3. 中国科学院大学, 北京 101407
收稿日期: 2018-03-29; 修回日期: 2018-05-04; 录用日期: 2018-05-04
基金项目: 国家自然科学基金（No.21677150）；石油污染土壤电动-微生物修复有机碳代谢机制与调控研究（No.21707150）；大型油气田及煤层气开发重大专项（No.2016ZX05040005-002-004）
作者简介: 王冰(1992-), 女, E-mail:wangbing0619@qq.com
通讯作者（责任作者）: 郭书海, E-mail:shuhaiguo@iae.ac.cn
摘要: 我国开采原油的稠油比重大、胶质含量高、环境风险突出，亟需解决石油污染土壤中胶质组分的解毒问题.由于胶质结构复杂、难以降解，所以对胶质结构变化的研究较少，其降解率也并不足以说明胶质污染土壤的修复效果，因此本文着重分析了修复过程中胶质结构与毒性的变化，为污染土壤修复体系提供重要指标.本文从辽河油田原油中提取胶质配制污染土，并加入构建的混合菌群.设计微生物修复（Bio）、电动-微生物修复（EK+Bio1）、电动-微生物补充营养修复（EK+Bio2）及间断电动-微生物修复（EK+Bio3）共4种处理.结果表明，胶质平均降解率EK+Bio2 > EK+Bio3 > EK+Bio1 > Bio，降解率最高为9.67%，为Bio处理的3.05倍（3.15%）.元素分析结果表明，修复前后胶质平均化学式为C106H157N、C96H174N，碳氢比降低，不饱和度降低.光谱分析与1H-核磁共振结果表明，修复后胶质碳链变短，芳香环、羧基与酚类结构数量减少.根据B-L法计算胶质芳碳率（fA）由0.28减少到0.11，可推测胶质的结构模型.MicroRespTM与小麦种子发芽实验结果表明，修复后土壤中微生物活性增强，小麦种子发芽率大大提高，说明结构的变化使胶质毒性降低.因此，电动-微生物修复使胶质结构发生变化，并在一定程度上有效削减了胶质毒性，较好的对胶质污染土壤进行了修复.
关键词: 胶质     电动-微生物修复     结构     毒性    
The structure variation and toxicity reduction of resin via electrokinetic-bioremediation
WANG Bing1,2,3, GUO Shuhai1,2 , LI Fengmei1,2, WANG Sa1,2, WU Bo1,2    
1. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016;
2. National-Local Joint Engineering Laboratory of Contaminated Soil Remediation by Bio-physicochemical Synergistic Process, Shenyang 110016;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101407
Received 29 March 2018; received in revised from 4 May 2018; accepted 4 May 2018
Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21677150), Research on Mechanism and Regulation of Organic Carbon Metabolism In Petroleum Contaminated Soil Remediated by Electrokinetics-Bioremediation(No.21707150) and the National Science and Technology Major Project(No.2016ZX05040005-002-004)
Biography: WANG Bing(1992—), female, E-mail:wangbing0619@qq.com
*Corresponding author: GUO Shuhai, E-mail:shuhaiguo@iae.ac.cn
Abstract: Heavy oil could expose high environmental risks attributed to one of the hazardous components known as resin. Researches of such contaminant is restrained due to its complicated structures and thus is hard to degrade. Since there are limited studies of the structure changes, current techniques that only implementing degradation rate of resin could not sufficiently reflect the remediation of petroleum-contaminated soil. This study focused on analyzing the changes of structure and toxicity of resin in order to provide significant index of the remediation system. Soil, obtained from Liaohe oilfield, was prepared by mixing bacterium and resin for the remediation experiments. There were four groups of treatments experiments designed for soil remediation including bioremediation (Bio), electrokinetic-bioremediation (EK+Bio1), electrokinetic-bioremediation with nutrient matters (EK+Bio2) and discontinuous electrokinetic-bioremediation (EK+Bio3). The results showed that the average degradation rate followed the order EK+Bio2 > EK+Bio3 > EK+Bio1 > Bio, among which the best degradation rate achieved by EK+Bio2 was 9.67%, which was 3.05 times higher than Bio (3.15%). Elemental analysis indicated that the average chemical formulas of resin before and after remediation were C106H157N, and C96H174N, respectively. The carbon hydrogen ratio, as well as the degree of unsaturation, was reduced after the treatment process. In addition, Spectral analysis and 1H-NMR analysis showed that there were less aromatic nucleus, carboxyl and phenolic groups and carbon chains were shorter as well. B-L method could be used to calculate the aromatic carbon rate (fA), which was reduced from 0.28 to 0.11 after remediation. Potential structure models of resin could be obtained based on the above-mentioned results. Meanwhile, combined MicroRespTM analysis with wheat seed germination rate, the results showed that both the microbial activity and germination rate have been increased. Thus, it indicated that the change of structure has efficiently reduced the toxicity of resin. As a result, electrokinetic-bioremediation could change the structure and reduce the toxicity of resin, which was beneficial for remediation of resin-contaminated soil.
Keywords: resin     electrokinetic-bioremediation     structure     toxicity    
1 引言(Introduction)

胶质是石油污染土壤修复中最难削减的组分, 长期累积对环境有较大危害(马高红, 2015).胶质是一种杂散的、油溶性、极性较强且相对分子质量较大的芳、杂稠环非烃化合物, 其流动性差, 是粘稠状固体(陈兰萍等, 2012).胶质分子由缩合稠环芳香片层组成, 环上有丰富的脂肪性结构单元, 并带有O、N、S等杂原子(Boukir, 2001；王新伟等, 2013).石植真等(2016)研究表明胶质含有芳香稠环、羧基与酚类结构, 其性质类似于高分子, 并可形成胶体体系.胶质的结构特性决定了其生物可利用性较低, 并带有一定的毒性.我国开采原油中稠油比重较大, 且稠油中胶质含量较高, 如辽河油田原油中胶质占33.8%(潘银华, 2015), 胜利油田稠油中胶质占28.6%(盖平原, 2011).因此, 解决石油污染土壤中胶质组分降解或解毒问题, 具有重要的科学和实践意义.

电动-微生物联合修复作为一种绿色高效的修复技术, 广泛应用于石油污染土壤的修复中(范瑞娟等, 2018).电动修复技术一方面通过电渗析、电迁移、电泳及一些电化学氧化反应对污染土壤进行修复, 另一方面可为微生物提供较好的生存环境, 促进微生物活性, 增强其对污染物的降解效果(李佳等, 2017).边岩庆(2010)、李凤梅等(2006)筛选出可降解胶质的降解菌, 并发现修复后胶质中C＝O基团数量减少, R—OH基团增加；嵇婷婷等(2017)的研究结果表明电动-微生物联合修复对胶质污染土壤有较好的修复效果, 修复后胶质碳链变短, 支化程度升高.但目前对胶质结构与毒性变化的研究还较少, 分析手段也比较单一, 主要集中于红外光谱法(赵春晓, 2014).本研究选用电动-微生物修复技术对胶质污染土壤进行修复, 并使用多种分析方法, 如核磁共振、元素分析等, 综合探究胶质修复前后结构、生物可利用性以及毒性的变化, 完善胶质污染土壤修复指标体系, 为解决石油污染土壤中胶质组分降解问题提供科学依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料

实验用土为清洁土加入胶质人工配制而成.清洁土采自中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳生态实验站农田表层土壤(0~30 cm), 风干后过10目筛备用, 其理化性质见表 1；胶质提取自辽河油田稠油(胶质含量约20%), 提取方法参照岩石可溶有机物和原油族组分柱层析分析方法(杨小莉, 1999)：用正己烷提取石油中可溶组分、细孔硅胶吸附、苯冲洗、7%甲醇的二氯甲烷溶液洗脱, 旋转蒸发至溶剂挥干, 收集胶质；实验所用的微生物菌剂为本实验室从辽河油田长期污染土壤中筛选出的3种降解菌株(B2、B5、B6)按B2:B5:B6 = 2:3:1的比例配制而成.

表 1 土壤性质 Table 1 Soil properties

将提取出的胶质溶于二氯甲烷, 于通风橱中均匀混入过筛后清洁土中, 不断搅拌翻动至混匀, 平衡1个月后随机采样测定胶质含量, 混匀后胶质含量为3.62 g·kg-1, 符合实际中石油污染较重地区土壤胶质含量范围(李佳等, 2017).加入制备好的微生物菌剂, 投加量为2.0×107 cfu·g-1.

2.2 实验方案及样品采集

本研究共设计4组处理, 实验设计见表 2.实验装置见图 1, 土壤室中加入3 kg人工配制污染土, 土壤压实, 接近于自然土壤, 土壤湿度为17%, 并定期补水保持湿度；电动组选用两对石墨电极, 施加直流电, 电压梯度为1 V·cm-1；实验共运行60 d, 采样周期为10 d；每点采样50 g, 0 d、60 d采样200 g；电极与采样点分布如图 2所示.

表 2 实验设计 Table 2 Design of experiment

图 1 实验装置示意图(1.电极区1; 2.电极区2; 3.土壤室; 4.电源与控制系统) Fig. 1 Schematic of experimental set-up

图 2 Bio(a)、EK+Bio(b)的电极与采样点分布图 Fig. 2 Distribution of electrodes and sampling points of Bio(a) and EK+Bio(b)
2.3 样品分析 2.3.1 土壤理化性质测定

土壤pH测定以去离子水作为浸提剂, 样品风干后过10目筛, 水土比为2.5:1.土壤含水率测定采用重量法, 105~110 ℃在烘箱中烘干至恒重(袁野, 2013).

2.3.2 土壤中胶质提取及含量测定

土壤中胶质含量采用有机溶剂超声萃取法(范瑞娟, 2015)进行测定.土壤样品风干后过60目筛, 用二氯甲烷进行萃取.所得浸提液通风浓缩至干, 用重量法测定胶质含量.

2.3.3 胶质结构分析

胶质结构进行光谱分析、元素分析以及1H-核磁共振分析.光谱分析包括红外、紫外与荧光光谱分析.红外光谱分析使用红外光谱仪, 采取液体薄膜法, 以正己烷为溶剂涂在检测片上, 挥干后测定, 红外光谱峰归属见表 3；紫外光谱分析使用紫外-可见分光光度计, 以甲苯为参比液, 扫描范围为250~450 nm；荧光光谱分析使用荧光光谱仪, 溶剂为氯仿, 扫描范围为250~650 nm(关润伶等, 2007；黄燕山, 2010).元素分析使用元素分析仪进行C、H、N原子质量分数测定.1H-核磁共振分析使用核磁共振波谱仪, 以CDCl3作为溶剂, 采样次数500(董喜贵等, 2004), 核磁共振氢谱归属见表 4(戈丹妮, 2014).

表 3 红外光谱峰归属 Table 3 Assignments for IR

表 4 1H-核磁共振谱带归属 Table 4 Assignments for 1H-NMR chemical shifts
2.3.4 微生物活性分析

土壤中微生物活性分析测定微生物数量与微生物呼吸强度(陈波, 2008).土壤中微生物数量用平板计数法进行测定, 土壤样品稀释4~7倍, 每个稀释浓度做3个平行样；微生物呼吸强度用MicroRespTM-酶标仪(Drage S, 2012)进行测定, 将甲酚红、氯化钾和碳酸氢钠混合作为指示剂, 将样品加入MicroRespTM深孔板中, 并投加不同碳源, 碳源的底物种类和浓度如表 5所示, 密封培养6 h后, 用酶标仪在570 nm波长下测定培养前和培养后吸光值, 并根据下述公式进行计算(陈晓娟等, 2013)：

表 5 MicroRespTM深孔板中投加的碳源种类和浓度 Table 5 Concentrations of different carbon sources added into the deep-well of MicroRespTM
(1)

式中, A= -0.2265, B= -1.606, D= -6.771.

进一步将数据规范化如下：

(2)
(3)

式中, At6为样品添加碳源培养6 h后吸光值, At0为样品未添加碳源培养时的吸光值.

则CO2产生率(PCO2)可通过公式(4)进行计算：

(4)

式中, T为培养温度(25 ℃), L为检测板孔体积(945 μL), W为土壤鲜重, U为土壤含水率, t为培养时间(6 h).

2.3.5 小麦种子发芽

实验用小麦种子发芽实验(刘凤等, 2014)对修复前后胶质毒性变化进行分析.小麦种子为辽春18号, 购买自沈阳农业大学, 理想发芽率为98%.种子种植前用0.05%高锰酸钾溶液消毒.每个样品做3个平行.取风干后土壤样品100 g, 加入20 mL水混匀, 接种50粒消毒后小麦种子, 自然光照, 室温20~25 ℃进行培养(彭昆国等, 2012).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 土壤理化性质变化

修复后, 土壤pH变化如图 3a所示.从图中可以看出, 修复后土壤pH并没有较大波动, 没有发生酸化、碱化现象.李婷婷等(2015)研究中也表明, 周期性电极极性切换设计可以使土壤pH保持稳定, 为修复提供较好的土壤环境.EK+Bio2中电极区1处pH稍高, 电极区2处pH较低, 仅为4.16, 主要由于在EK+Bio2处理中, 定期补充无机盐培养基, 极大的提高了电导率, 使pH产生差异.马志强(2017)的研究中也表明盐的含量对土壤中电导率影响较大, 进而对土壤pH产生影响.

图 3 修复后土壤pH (a)和含水率(b) Fig. 3 Soil pH (a) and water content (b) after remediation

修复后, 土壤含水率保持稳定, 如图 3b所示, 没有干化、水化现象.这也与李婷婷等(2015)周期性电极极性切换使土壤水分均衡的研究得到了一致的结论.

3.2 胶质浓度变化

修复后胶质平均降解率EK+Bio2＞EK+Bio3＞EK+Bio1＞Bio, 电极区＞中间处(图 4).EK+Bio2组电极区1处降解率最高, 为9.67%, 是Bio组的3.05倍(3.15%)；电极区2处由于pH较低, 胶质的降解率比中间处低, 为5.81%.电动处理一方面起到电化学氧化作用, 另一方面促进微生物生长, 为微生物提供适宜的生存条件, 进而提高土壤中胶质的降解率.这与范瑞娟等(2018)研究结论一致.EK+Bio2处理中定时补充无机盐培养基, 一方面增加了电导率, 另一方面为微生物提供了大量营养物质, 李佳等(2017)的研究也表明, 增加营养物质含量可促进微生物新陈代谢活动, 提高微生物活性, 进而增强了对胶质的降解能力, 修复效果较好.间歇电动处理(EK+Bio3)中胶质的降解率稍高于非间断电动处理(EK+Bio1).袁立竹(2017)的研究中表明, 间断式供电可以减少电能消耗并略微提高污染土壤修复效果.除此之外, 间歇供电也为微生物提供了一定的缓冲时间, 使其修复效果略好于非间断电动处理.

图 4 修复后不同采样点土壤胶质降解率 Fig. 4 Degradation rate of different sampling points after remediation
3.3 胶质结构分析

电动-微生物联合修复技术提高了胶质的降解率, 但最高也仅有9.67%, 与石油中饱和烃、芳香烃的降解程度差别较大, 故进一步对胶质结构的变化情况进行分析.

3.3.1 光谱分析

对修复前后土壤中胶质进行红外光谱分析(图 5).从图中可看出：修复后—CH2—、—CH3基团特征区(波数2922、2852、1456、1377、756 cm-1)峰值降低, 说明在修复后胶质碳链变短；修复前胶质谱图在波数1705、1214 cm-1处出峰, 据表 3可知, 胶质中含有羧基基团和酚类结构, 修复后峰值明显减少, 说明羧基与酚类结构减少；1604、869 cm-1是芳香环和杂环结构的特征区, 修复后峰值降低, 说明胶质芳香环和杂环在修复后被降解成饱和环或者发生开环反应；修复后谱线在1030 cm-1处出峰, 峰值高于修复前, 说明胶质在修复后生成了新的官能团, 如R—OH、Ar—O—R等.边岩庆(2010)的研究中也提到, 胶质在降解过程中C＝O数目减少, 生成R—OH等官能团.

图 5 修复前后胶质红外光谱图 Fig. 5 Infrared spectra of resins before and after remediation

对胶质分别进行紫外、荧光光谱分析, 结果见图 6.修复前后胶质的紫外与荧光图谱谱线没有明显差异, 说明紫外与荧光光谱法对本实验修复前后胶质结构发生的变化不敏感.因此, 可以选用更精密的分析方法对胶质结构变化进行进一步分析.

图 6 修复前后胶质紫外光谱图(a)和荧光光谱图(b) Fig. 6 UV (a) and fluorescence (b) spectra of resins before and after remediation
3.3.2 元素分析

对修复前后土壤中胶质进行元素分析, 可得土壤胶质中C、H、N原子质量分数(表 6).修复后土壤胶质中C原子质量分数降低, H原子升高, 碳氢比由7.94降低到6.54修复后胶质的不饱和度降低, 说明胶质中一部分不饱和环被降解成为饱和环.根据胶质的C、H、N原子质量分数, 可以计算得修复前后胶质的平均化学式分别为C106H157N、C96H174N.

表 6 修复前后胶质元素分析结果 Table 6 Results of elemental analysis of resins before and after remediation
3.3.3 1H-核磁共振分析

对修复前后土壤中胶质进行1H-核磁共振分析, 结果见图 7.根据表 4中谱带归属情况, 可对胶质核磁共振谱图进行分析, 得到胶质中不同位置上H原子所占比例, 见表 7.修复后土壤中胶质HA、Hα所占比例降低, Hβ、Hγ所占比例升高, 即修复后芳香环上的H原子所占比例降低, 仅为修复前的1/2, 直链上H原子所占比例升高, 说明修复后胶质芳香环数量减少, 环状结构开环成链.

图 7 修复前(a)和修复后(b)胶质1H-NMR谱图 Fig. 7 1H-NMR spectrum of resins before remediation(a) and after remediation(b)

表 7 修复前后胶质1H-核磁共振结果 Table 7 Results of 1H-NMR of resins before and after remediation

进一步用B-L法可计算修复前后胶质的芳碳率(文萍等, 2013；刘丰秋, 2007), B-L公式为：

(5)

式中, fA为胶质芳碳率；CT、HT、Hα、Hβ、分别为C、H及α、β、γ位上的H原子所占比例.

根据公式计算可得, 修复前后胶质芳碳率分别为0.28和0.11, 修复后的芳碳率减少为修复前的0.36倍, 说明了修复后胶质中芳香环数量明显减少, 约为原来的1/3.

根据修复前后胶质的红外、紫外、荧光光谱、元素分析以及核磁共振的结果进行综合分析可知：修复前后胶质的平均化学式分别为C106H157N与C96H174N；修复后胶质C原子质量分数降低, H原子升高, 其中芳香环上的H原子比例降低, 直链上H原子比例升高.胶质碳氢比降低, 不饱和度降低, 修复后胶质芳香环和杂环数量减少, 一部分不饱和环可能被降解成饱和环或开环成链；修复后胶质中羧基与酚类结构数量减少, 并生成新的官能团, 如R—OH等.胶质是一类复杂的大分子非烃化合物, 已有研究表明, 胶质结构中的芳香环与杂环以3~5个环聚合为主(关润伶, 2007), 结合以上分析可推断, 修复前后土壤中胶质的近似结构模型如图 8所示.

图 8 修复前(a)、后(b)胶质近似结构模型 Fig. 8 Potential structure models of resins before(a) and after(b) remediation
3.4 胶质毒性分析

根据以上分析可知, 修复后胶质降解率并没有大幅度提高, 但胶质结构中一些难降解、毒性较大的基团(如芳香环、羧基)的数量明显减少, 所以进一步对胶质生物可利用性及毒性进行分析.

3.4.1 微生物活性变化

① 微生物数量变化：采样后对土壤中微生物数量进行计数, 得到微生物数量随时间变化情况(图 9).微生物数量EK+Bio2＞EK+Bio3＞EK+Bio1＞Bio, 后期微生物数量增长速率减慢, 逐渐趋于平稳.如图 10所示, 修复后不同采样点微生物数量差异与胶质降解率的趋势基本一致.修复后EK+Bio处理中微生物数量比Bio处理要高, 黄殿男(2012)的研究中也表明, 电动处理可以为微生物提供较好的生存环境, 促进微生物生长繁殖.除此之外, 胶质降解程度最大处理中, 微生物数量也相应增多程度较大, 说明胶质含量的降低与结构的变化也是微生物数量增多的重要因素.

图 9 土壤微生物数量随时间变化图 Fig. 9 Bacteria counts change with time

图 10 修复后土壤微生物数量 Fig. 10 Bacteria counts after remediation

② 微生物呼吸强度变化：综合土壤样品中微生物对18种碳源的利用率可得其呼吸强度变化趋势(图 11).土壤中微生物呼吸强度EK+Bio2＞EK+Bio3＞EK+Bio1＞Bio＞修复前.EK+Bio2电极区1处最高(34.02 μg·h-1), 是修复前的2.27倍(14.95 μg·h-1), 是Bio处理的1.77倍(19.27 μg·h-1).刘凤等(2014)研究中表明, 微生物呼吸强度是微生物活性的一种重要指标.通过微生物数量与呼吸强度的变化可知, 修复后土壤中微生物活性明显升高, 其趋势与胶质降解率基本一致, 说明修复后胶质的生物可利用性明显提高.

图 11 修复前后土壤的诱导呼吸CO2产生率 Fig. 11 Respirometric evolution of carbon dioxide before and after remediation
3.4.2 小麦种子发芽实验

对修复前后土壤进行小麦种子发芽实验(图 12).修复后小麦种子发芽率远高于修复前(20%)；EK+Bio处理中发芽率最高为90%, 是Bio处理的1.64倍(55%).陈波等(2008)对土壤生态毒理诊断研究中表示小麦种子发芽实验可直观、准确的表示土壤毒性.将小麦种子发芽结果(图 12)与胶质降解结果(图 4)对应可知, 修复后土壤小麦种子发芽率变化趋势与胶质降解情况变化趋势基本一致, 说明修复后胶质结构发生变化, 使胶质毒性降低, 土壤更适宜植物存活.胶质降解程度较大的处理, 其毒性削减程度也相对应较大, 小麦发芽率较高.

图 12 修复前后土壤小麦种子发芽率 Fig. 12 Seed germination rate of wheats in soils before and after remediation

修复后, 土壤中微生物活性与小麦种子发芽率明显增高, 其变化趋势与胶质降解趋势一致.综合胶质结构变化可知, 修复后胶质芳香环、杂环数量减少, 羧基与酚类结构被降解成羟基等基团, 大大提高了微生物可利用率, 土壤中微生物活性增强, 胶质毒性降低使小麦种子发芽率明显增高.电动-微生物联合修复技术使土壤中胶质的结构发生变化, 进而使其毒性得到了有效的削减.

4 结论(Conclusions)

1) 胶质是石油污染土壤修复中最难削减的组分, 但电动-微生物修复技术可提高胶质降解率, 最高为9.67%.

2) 电动-微生物修复促使胶质结构发生变化.碳链变短, 芳香环、杂环数量减少, 羧基与酚类被降解成羟基等结构, 修复前后平均化学式为C106H157N与C96H174N, 综上可推测胶质结构模型.

3) 电动-微生物修复可有效降低胶质毒性.修复后土壤中微生物活性增强, 小麦种子发芽率明显增高, 胶质生物可利用性提高, 毒性得到了有效的削减.对石油污染土壤修复具有重要的科学和实践意义.

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