2018, Vol. 38
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2. 浙江大学环境与资源学院环境工程系, 杭州 310058
2. Department of Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310058
基于上流式厌氧污泥床(Upflow Anaerobic Sludge Bed, UASB)、内循环反应器(Internal Circulation, IC)和膨胀颗粒污泥床(Expanded Granular Sludge Bed, EGSB)的厌氧消化技术常用于高浓度有机废水处理(盘爱享等, 2008;吴昌永等, 2011; Rittmann et al., 2001).其中, 具有良好沉降性和高生物活性的厌氧颗粒污泥(anaerobic granular sludge, AGS)是其高效稳定运行的基础和关键(李建金等, 2011;吴昌永等, 2011; Randall et al., 1996).
为快速获取高品质的厌氧颗粒污泥, 国内外学者开展了大量颗粒污泥形成影响因素和控制条件的研究(吴昌永等, 2011;梁家豪等, 2017).韩丰波(2008)和李婷等(2016)通过添加聚丙烯酰胺和聚乙烯醇(PVA)凝胶颗粒促进污泥颗粒化进程, 提高产甲烷活性；龚淑芬等(2014)研究了投加甲烷鬃菌对颗粒污泥形成、增殖与稳定的促进作用；Jung et al.(2013)和Jia et al.等(2015)采用控制反应器外循环的方式提高颗粒污泥性能和尺寸, 取得了良好的效果；Chen et al.(2009)和徐富等(2013)分别采用降低溶解氧和提高反应器容积负荷的方式成功加速污泥颗粒化形成.经过加速培养, AGS的培养周期显著缩短, 但仍需要1~3个月, 甚至更长时间, 且颗粒污泥活性在培养过程中易受外界条件影响, 延长了反应器的启动时间(吴昌永等, 2011;施云芬等, 2013).
厌氧反应器稳定运行过程中产生的剩余污泥是厌氧消化技术获取AGS的另一重要来源.相较于颗粒污泥培养, 储存后的颗粒污泥(剩余污泥)活化后可实现反应器的快速启动(袁向娟, 2011).据研究, 储存2个月的AGS, 活化5 d后比产甲烷活性即可恢复至储存前活性的60%~90%(韩丰波, 2008)；采用改变温度、pH值和投加营养元素的方法, 均可将储存的AGS恢复至标准活性范围内(施云芬等, 2013).因此, 储存AGS在废水处理领域实际应用中作用关键.
温度和储存基质是颗粒污泥储存过程中的重要控制因子, 其可通过影响颗粒污泥内细胞的水解和内源呼吸强度而影响污泥的活性和结构完整性(Rittmann et al., 2001).因此, 本文选取了某IC反应器内典型AGS为对象, 研究了温度和储存基质对长期储存后AGS理化性质、结构特征和微生物菌群组成的影响, 以期为AGS的经济有效储存提供理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 厌氧颗粒污泥(AGS)AGS取自浙江省某造纸厂IC反应器, 该反应器容积负荷为20 kg · m-3 · d-1, 日处理水量为27000 m3, 进水COD为2000 mg · L-1, pH值为6.8.反应器稳定运行10年以上, 运行温度为35~40 ℃.厌氧颗粒污泥呈黑色, 密度1.10 g · cm-3.颗粒污泥总固体(Total Solid, TS)值为(143.44±2.85) g · L-1, 挥发性固体(Volatile Solid, VS)值为(87.19±1.63) g · L-1, VS/TS为0.61.以质量百分比浓度为0.9%的NaCl溶液清洗富集培养物3次后用于试验.
2.2 实验设置取60 g AGS和50 mL蒸馏水/基质于120 mL血清瓶中, 通氩气15 min除去顶空氧气；基质以葡萄糖形式提供, 浓度为5000 mg · L-1(以COD值计).血清瓶用丁基橡胶塞塞紧, 然后用铝盖加固.将血清瓶置于恒温培养箱中静置储存.定期测定其理化性质、结构特性和微生物菌群结构.具体试验设置见表 1.所有试验设置3次重复, 并设置空白对照试验组(不添加厌氧颗粒污泥).
| 表 1 试验设置及试验目的 Table 1 Test setting and test purpose |
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取原始污泥、储存1.5个月和3个月的AGS 5 g污泥样品, 在QICPIC动态颗粒粒度仪(Sympatec GmbH公司，德国)测定污泥的粒径尺寸(包括面积平均粒径, surface area-weighed mean diameter, SMD; 体积平均粒径, volumetric-weighed mean diameter, VMD)和分布, 并分析其形状因子(包括球形度、粗糙度和长宽比)分布(Zhang et al., 2016).
2.3.2 三维荧光光谱分析取储存3个月的AGS上清液过0.45 μm滤膜过滤后, 用荧光分光光度计(日立F-4600, Japan)测定, 以蒸馏水和葡萄糖基质溶液为空白对照组.测定条件为：发射波长200~450 nm, 步长10 nm；激发波长250~550 nm, 步长10 nm.激发狭缝和发射狭缝的宽度均为10 nm, 扫描速度为1200 nm · s-1, 扫描电压为500 V.三维荧光光谱图使用Origin 8.0软件绘制.
2.4 污泥结构测定取原始污泥、储存1.5个月和3个月的AGS清洗后于2.5 %的戊二醛溶液中, 在4 ℃环境中过夜固定.采用0.1 mol · L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH约为7.0)漂洗3次, 每次15 min；采用1 %锇酸溶液固定1~2 h；采用0.1 mol · L-1磷酸盐缓冲溶液继续漂洗；采用浓度为50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液进行脱水.将上述样品采用体积比为1 : 1的乙醇和醋酸异戊酯混合液处理30 min, 采用纯醋酸异戊酯溶液处理1~2 h, 最后将样品置于临界点干燥仪中干燥、镀膜后, 采用SU8010型场发射扫描电子显微镜(FESEM, HITACHI, JAPAN)观察.将上述用乙醇梯度脱水后的样品, 采用100%丙酮处理30 min, 采用体积比为1 : 1、3 : 1的丙酮和环氧树脂包埋液渗透1~3 h, 采用纯环氧树脂包埋剂渗透12 h后, 将样品置于包埋聚合器(中兴百瑞, 北京)中, 在75 ℃下聚合12 h, 将样品超薄切片染色, 采用H7650型透射电子显微镜(TEM, HITACHI, Japan)观察样品(张萌, 2015).
2.5 微生物菌群结构测定取原始污泥、储存1.5个月和3个月的AGS, 采用FastDNA SPIN kit for soil(MP biochemical, USA)提取污泥样品的基因组DNA并于-20 ℃条件下储存备用.采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增细菌的16S rRNA基因.细菌引物为：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)/907R(5′-CCGTCAATT CMTTTRAGTTT-3′).PCR扩增反应体系(50 μL)为：灭菌超纯水37.75 μL, Taq酶(5 U · μL-1)0.25 μL, PCR反应缓冲液(10×)5 μL, dNTP(2.5 mmol)4 μL, 模板(20 ng · μL-1)1.0 μL, 正反引物(10 μmol · L-1)各1.0 μL.反应条件为：预变性(95 ℃)5 min, 变性(95 ℃)30 s, 退火(55 ℃)30 s, 延伸(72 ℃)60 s, 24个循环, 延伸(72 ℃)8 min.将PCR产物在2 %琼脂糖凝胶中进行电泳检测, 并使用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit试剂盒(TaKaRa)进行割胶纯化回收.高通量测序利用Ion Torrent PGM测序仪(浙江大学农生环测试中心)按操作手册建库测序.测序数据采用qiime程序(http://qiime.org/)分析.
2.6 其他COD采用快速消解法测定；TS和VS采用重量法测定, 具体参照《水与废水检测分析方法(第四版)》(2002).
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 污泥理化特性 3.1.1 污泥粒径和形状因子AGS相对规则的外形、较高的强度和稳定的结构是其良好沉降性能和生物活性的基础(吴昌永等, 2011).为了探明温度和基质对AGS长期储存的影响, 测定了不同条件下的污泥粒径和形状等性能.
根据Stokes沉降公式, 粒径是影响AGS沉降性能的重要因素(吴昌永等, 2011).由图 1可知, 经过储存后, AGS的粒径均有降低, 较初始污泥的(2283.8±167.9) μm(SMD)和(2581.5±207.9) μm(VMD), 降低幅度分别为5.57%~24.48%和5.30%~20.75%.具体来看, 污泥粒径在常温条件下下降幅度低于中温条件(S1、S2与S3、S4对比), 添加基质有利于减缓污泥粒径下降幅度(S1、S3与S2、S4对比).但储存时间由45 d延长至90 d过程中, 相同的储存条件下颗粒污泥粒径变化不显著.
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| 图 1 温度和基质对长期储存后AGS粒径的影响 (注:图中SMD为面积平均粒径, surface area-weighed mean diameter；VMD为体积平均粒径, volumetric-weighed mean diameter, 两者均为颗粒污泥的等效粒径；AGS为初始污泥, S1-1、S2-1、S3-1、S4-1为储存45 d污泥, S1-2、S2-2、S3-2、S4-2为储存90d污泥, 下同.) Fig. 1 Effect of temperature and matrix on the particle size of AGS after long-term storage |
球形度、长宽比和凹凸度可分别从污泥形状、表面粗糙性和结构紧实度等方面反映污泥的物理性能.温度和基质对长期储存后AGS形状因子的影响如箱线图(图 2)所示.经过储存后, AGS的形状因子的分布范围均有拓宽, 即污泥的物理性能趋于不规则化.具体来说, 中温条件下, AGS的球形度提高, 但变化范围更大(最大幅度增加1.72倍)(图 2a), 表面更加粗糙(最大幅度增加1.53倍)(图 2b), 污泥越紧实, 但变化范围小于常温(最大幅度增加1.50倍)(图 2c).添加基质降低了AGS的球形度, 同时减小了污泥形状变化范围(图 2a), 对污泥表面粗糙程度和紧实程度影响较小, 但减少了污泥整体的变化幅度(图 2b、2c).
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| 图 2 温度和基质对长期储存后AGS形状因子的影响 Fig. 2 Effect of temperature and matrix on the particle shape factor of AGS after long-term storage |
在储存过程中, 由于基质匮乏, 污泥内细胞会进行内源呼吸甚至水解, 释放代谢产物和水解产物至储存液中.为探明温度和储存基质对AGS长期储存的影响, 采用三维荧光光谱测定了污泥储存液中的物质组成.由图 3结果知, 经过储存后, AGS储存液中均出现明显的三维荧光峰, 即有新的物质产生.这些物质可能源于AGS中微生物的代谢产物排泄, 也可能源于胞外多聚物的溶解.对荧光峰进行分析知, 与蒸馏水(图 3e)和初始储存液(图 3f)相比, 不同条件储藏AGS后三维荧光光谱图中出现4个显著的峰, 其中峰A(Ex/Em=230 nm/340~360 nm)和峰B(Ex/Em = 280 nm/330~340 nm)分别为酪氨酸和色氨酸等芳香性氨基酸的荧光峰, 峰C(Ex/Em = 270 nm/450~460 nm)和峰D(Ex/Em = 330~370 nm/450~460 nm)均为腐殖酸的荧光峰(Chen et al., 2003).
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| 图 3 温度和基质对AGS长期储存后储存液的影响 (图中a、b、c、d分别为S1、S2、S3、S4储存90 d后储存液的三维荧光光谱图, e、f分别为蒸馏水和葡糖糖储存液的三维荧光光谱图.A、B、C、D分别为酪氨酸、色氨酸、腐殖酸Ⅰ和腐殖酸Ⅱ的特征荧光峰.) Fig. 3 Effect of temperature and matrix on the storage solution of AGS after long-term storage |
具体来说, 温度对酪氨酸(峰A)含量影响最大, 对色氨酸(峰B)和腐殖酸Ⅰ(峰C)含量影响较大.相较于常温, 中温条件下3种物质的含量分别下降了58.4%~58.6%、25.5%~34.8%和22.8%~33.1%.在中温条件下, AGS中微生物代谢强度高, 对有机物的消耗增加, 这与储藏液中COD值情况一致(未显示).温度对腐殖酸Ⅱ(峰D)的影响相对较小.相较于常温, 中温条件下腐殖酸Ⅱ含量增加了2.1%~10.1%, 表明该腐殖酸为生物难以降解利用的惰性物质.随着储存时间延长, 腐殖酸Ⅱ会不断积累, 且在微生物代谢较为活跃的中温条件下会凸显.因此, 在污泥储存液处置过程中需重点关注.
基质添加对4种物质的影响在常温条件下尤为显著.具体而言, 基质添加对色氨酸和腐殖酸Ⅰ含量的影响较大.相较于未添加基质实验组(S2), S1中色氨酸和腐殖酸Ⅰ的含量分别下降11.8%和上升23.2%.分析认为, 在储存无氮源情况下, 氨基酸难以生物合成, 因此AGS中微生物会利用储存液中细胞水解产生的含氮氨基酸为氮源进行代谢.色氨酸在微生物内的利用主要通过柠檬酸循环, 该过程需要草酰乙酸引导(Garrett et al., 2010), 因此葡萄糖的添加会打通该代谢途径, 增加色氨酸的消耗, 导致含量下降.另一方面, 葡萄糖作为碳源, 可减少微生物对储存液中细胞水解产生的腐殖酸Ⅰ的消耗, 导致含量增加.相较于未添加基质实验组, 基质添加对酪氨酸和腐殖酸Ⅱ的影响较小, 差异分别仅为2.3%和4.2%.
3.2 污泥结构特性颗粒污泥主要由微生物及其分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)组成.微生物的种类、数量和分布是颗粒污泥结构特性的基础, 而EPS构成了颗粒污泥的骨架, 维持结构稳定.为探明温度和储存基质对AGS短期和长期储存的影响, 采用电子显微镜技术(SEM和TEM)分别观察了颗粒污泥的表观结构和内部结构特性.
3.2.1 污泥表观结构特性如图 4a所示, 初始颗粒污泥表面较为平整光滑, 表面丝状菌和杆状菌交错分布, 菌体之间由大量EPS包裹缠绕和粘连(图 4b).
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| 图 4 SEM观察温度和基质对颗粒污泥表观结构的影响 (图中a、b为初始AGS；c和d分别为S3-1和S1-1, e和f分别为S1-2和S3-2, 白色箭头代表EPS, 白色虚线代表孔隙) Fig. 4 SEM observation of the effect of temperature and matrix on the apparent structure of granular sludge |
温度可通过调节细胞内生化反应中酶的活性而影响代谢反应速率.中温条件下, 整体酶促反应速率较高, 微生物可以利用外源基质或者内源营养物质代谢合成分泌更多的EPS.对比S1和S3, 短期贮存条件下, S3-1中表面大多分布为杆状菌, EPS含量较高, 成片或成块联结于菌体间(图 4c)；而S1-1中部分表面由丝状菌缠绕, 其上包裹有EPS(图 4d).长期贮存条件下, 微生物均处于饥饿状态, 现有基质不足以维持酶促反应的正常进行.在S1-2和S3-2中均可观察到部分菌体裂解, 表面无机物质增加, 微生物密度显著下降, 并且S3-2孔隙明显大于S1-2(图 4e和4f).
3.2.2 污泥内部结构特性如图 5a所示, 初始AGS中杆菌和球菌密集混栖分布, 细胞边界清晰, 细胞质充盈.
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| 图 5 TEM观察温度和基质对颗粒污泥内部结构的影响 (图中a为初始AGS；b和c分别为S3-1和S4-1, d和e分别为S4-2和S3-2, f和g分别为S2-2和S1-2) Fig. 5 TEM observation of the effect of temperature and matrix on the internal structure of granular sludge |
对比S3与S4可知, 短期储存条件下, S3-1中菌群形态与初始AGS类似, 细胞结构良好(图 5b)；而S4-1中菌群密度显著下降, 细胞间距增大, 群聚效应降低(图 5c).长期储存条件下, 在高倍数(80000x)下可观察到S4-2中部分菌体破裂, 细胞质外流, 细胞边界模糊(图 5d), 在S3-2中未观察到类似情况(图 5e).即中温饥饿培养对菌体的内部结构会产生较大破坏, 而添加基质更有利于AGS内部结构的完整与稳定.
反观常温条件培养下, 内部结构的维持均好于中温条件, 并且常温不添加基质最能保持菌群形态的完整性和群聚效应(图 5f), 其中细长型杆菌数量减少, 短粗型有所增加.S1-2较S2-2来说, 出现很多球菌团聚(图 5g).推测由于甲烷八叠球菌的最大增长速率高于甲烷鬃毛菌, 但其基质亲和力较低, 半饱和常数Ks=3~5 mmol · L-1, 而甲烷鬃毛菌基质亲和力较强, Ks=0.5~0.7 mmol · L-1 (王妍春等, 2002).因此导致有添加基质的条件下, 球状菌数量相对于杆状菌有所增加.
3.3 污泥菌群特性采用高通量测序技术对初始污泥和各储存条件下污泥中的微生物菌群进行分析.由多样性指数对比可知(表 2), 相较于AGS, 各储存条件下污泥的Chao 1指数增大, 而Shannon减小, 表明经储存污泥中微生物丰富度增加但多样性下降.
| 表 2 污泥多样性指数 Table 2 Sludge diversity index |
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对测序获得的优质序列进行比对, 可获得初始污泥和储存污泥在不同分类水平的菌群结构.经过储存, 在门水平(图 6a), 污泥优势菌群均为Chloroflexi、Bacteriodetes、Euryarchaeota和Hyd24-12, 其在菌群中相对丰度超过75%.在属水平(图 6b), 污泥优势菌群均为Anaerolinea、Bacteroidales(目水平)、T78、Methanobacterium、Methanosaeta, 其在菌群中相对丰度超过60%.
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| 图 6 温度和基质对AGS长期储存后微生物群落结构的影响 (图中a代表门水平, b代表属水平) Fig. 6 Effect of temperature and matrix on microbial community structure after long-term storage of AGS |
对污泥菌群结构进一步分析知, 经过储存, 功能菌群相对丰度变化显著.厌氧消化产甲烷过程相关的菌群多分布于古菌域, 其中Methanobacterium和Methanosaeta为常见产甲烷菌群, 可分别以H2/CO2和乙酸为底物进行产甲烷代谢(Boone et al., 2001).经过储存, 古菌在污泥中的相对丰度均有下降, 其中常温条件下变化显著, 由23.20%剧降至4.90%(添加基质)和3.30%(不添加基质), 而中温条件下分别微降至21.20%和20.20%.而在属水平, 产甲烷菌群相对丰度呈现相似规律, 即常温条件下变化显著, 由19.50%剧降至3.00%(添加基质)和2.70%(不添加基质), 而中温条件下变化为19.50%和17.00%.
厌氧消化发酵过程相关的菌群多分布于细菌域, 其中Anaerolinea和T78均属于Anaerolinaceae科, 其与Bacteroidales均为常见的发酵菌群, 可将有机物水解转化为能被产甲烷菌直接利用的小分子有机物(Whitman, 2011；Zhu et al., 2017).经过储存, 发酵菌群相对丰度在常温条件下由48.90%提高至67.40%(添加基质)和65.90%(不添加基质), 而中温条件下分别降至39.70%和44.00%.值得注意, Anaerolinaceae在常温条件下相对丰度(45.20%~46.80%)显著高于其在中温条件下丰度(21.80%~26.30%).由于Anaerolinaceae菌多为丝状菌, 对污泥颗粒化具有重要作用(Yamada et al., 2005; Zhu et al., 2017), 因此常温储存条件更利于维持污泥的结构稳定.该结果与污泥理化性质测定和结构特性观察结果相符.
4 结论(Conclusions)1) 在污泥理化特性方面, 常温(20 ℃)和添加基质可减缓储存过程中AGS粒径的下降, 维持形状性能稳定.长期储存(3个月), 储存液中会积累酪氨酸、色氨酸等芳香性氨基酸和难降解的腐殖酸等物质, 中温(35 ℃)可提高芳香性氨基酸削减22.8%~58.6%, 但会增加腐殖酸类物质积累.
2) 在污泥结构特性方面, 对于短期储存(1.5个月), 中温条件下添加基质可促进微生物合成较多EPS而维持颗粒污泥结构稳定；对于长期储存, 常温可减缓基质消耗和菌体水解, 利于颗粒污泥结构稳定.
3) 在污泥菌群特性方面, 储存后优势菌群在门水平和属水平具有相似性, 均为Chloroflexi、Bacteriodetes、Euryarchaeota、Hyd24-12和Anaerolinea、Bacteroidales、T78、Methanobacterium、Methanosaeta.功能菌群相对丰度受温度影响显著, 常温条件下产甲烷菌群丰度下降至2.70%~3.00%, 而发酵菌群丰度提高至65.90%~67.40%.中温和储存基质对污泥菌群结构影响较小.
4) 综合而言, 对于AGS长期储存, 常温利于维持理化性能和结构稳定, 中温利于维持污泥活性和菌群结构稳定, 添加基质利于增强AGS的综合性能, 但效果不显著.
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