1 引言(Introduction)

二氧化硫(SO₂)是最常见的大气污染物之一，环境中高浓度的SO₂可抑制植物的光合和呼吸过程，引起叶片失绿坏死，诱导细胞毒性，造成细胞核固缩、DNA断裂、细胞活力下降，甚至导致细胞死亡(Yi et al., 2012; Choi et al., 2014).SO₂气体遇水产生亚硫酸根(SO₃^2-)和亚硫酸氢根(HSO₃^-)，两种分子物质的量的比为3:1(Shapiro, 1977).大气中的SO₂经气孔进入植物体内，主要通过水解形成SO₃^2-和HSO₃^-对组织和细胞产生毒性.在研究SO₂对植物细胞的毒性效应时，常用衍生物(Na₂SO₃和NaHSO₃混合液，物质的量的比3:1)作为SO₂供体(付宝春等, 2015; Yi et al., 2012; Wei et al., 2013; 2015).目前关于SO₂对植物的毒性效应研究大多集中在草本植物中，课题组前期利用生长在我国西北地区的高大乔木树种—胡杨的细胞为材料，研究发现一定浓度的SO₂衍生物可诱导胡杨细胞死亡，并使胞内NO和H₂O₂水平升高(韩彦莎等，2016).

脱落酸(Abscisic acid，ABA)是一种植物激素，普遍存在于植物体内，在植物生长发育和响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用(Vishwakarma et al., 2017).外源施加ABA可明显提高植物抵抗干旱、盐渍、重金属等环境胁迫的能力(Zhu, 2002; Yang et al., 2014; Han et al., 2016).例如，干旱胁迫下，外源ABA可诱导植物气孔关闭，减少水分蒸腾(Desikan et al., 2004).近期本课题组发现，外源ABA能够提高镉胁迫下胡杨细胞的抗氧化酶活性，从而减少细胞中的活性氧积累，有效缓解镉诱导的氧化损伤(Han et al., 2016).有研究表明，外施ABA溶液可通过调节叶片气孔开度来控制SO₂气体进入，在一定程度上提高植物对SO₂的防御能力(Kondo et al., 1978；刘荣坤等，1983；韩素梅，2001).但迄今为止，关于ABA在植物细胞SO₂毒性缓解中的具体作用及相关机制尚未见报道.

本文通过研究外源ABA对SO₂胁迫下胡杨细胞死亡率、细胞电解质外渗率、胞内NO和H₂O₂水平的影响，旨在从细胞水平上揭示ABA缓解植物SO₂毒性的作用和机制，这对其应用于植物防御SO₂毒害具有重要意义.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 植物材料

以胡杨新鲜幼嫩叶片作为外植体，在含0.5 mg·L^-16-BA和0.5 mg·L^-1 NAA的Murashige & Skoog (MS)固体培养基(pH=5.7)上诱导产生愈伤组织，并在含0.25 mg·L^-1 6-BA和0.5 mg·L^-1 NAA的MS固体培养基上继代增殖.继代培养15 d后，选择颜色淡黄、生长旺盛的愈伤细胞进行处理和实验.

2.2 实验处理

采用SO₂衍生物处理(Na₂SO₃:NaHSO₃=3:1，mmol·L^-1/mmol·L^-1)，SO₂衍生物浓度以混合液中的总S含量计算.根据本课题组前期在胡杨细胞中的研究结果，用2 mmol·L^-1 SO₂衍生物处理胡杨细胞9 h后，细胞死亡率达45%~50%(韩彦莎等，2016)，本文使用该处理浓度和时间.将生长15 d的愈伤细胞转至MS液体培养基(pH=5.7)中，平衡6 h后，分别按以下方法进行处理.

① 分别用0 mmol·L^-1 SO₂、2 mmol·L^-1 SO₂、0.5 μmol·L^-1 ABA、5 μmol·L^-1 ABA、20 μmol·L^-1 ABA、2 mmol·L^-1 SO₂+0.5 μmol·L^-1 ABA、2 mmol·L^-1 SO₂+5 μmol·L^-1 ABA、2 mmol·L^-1 SO₂+20 μmol·L^-1 ABA处理细胞，9 h后检测细胞死亡率和电解质外渗率.

② 分别用2 mmol·L^-1 SO₂、5 μmol·L^-1 ABA、5 μmol·L^-1 ABA+2 mmol·L^-1 SO₂处理细胞，以MS液体培养基中的细胞作为对照，9 h后检测胞内H₂O₂和NO水平、抗氧化酶活性、硝酸还原酶活性及相关基因表达水平.

2.3 细胞死亡率检测

利用Fluorescein Diacetate(FDA, Sigma-Aldrich，USA)荧光染料检测胡杨细胞死亡率.将细胞在20 μg·mL^-1 FDA溶液中避光孵育5 min后，在荧光显微镜(BX51，Olympus，Japan)下检测细胞荧光.发亮绿色荧光的为活细胞，不发绿色荧光或绿色较暗的为死细胞.每个重复随机观察5个视野，每个视野至少观察100个细胞.细胞死亡率为死细胞数目与细胞总数之比.

2.4 电解质外渗率测定

取0.2 g胡杨细胞，在5 mL重蒸水中振荡培养30 min后，利用电导率仪检测水中的电解质电导率(C₁).之后在沸水中煮沸细胞30 min，待冷却后检测电导率(C₂).电解质外渗率E=C₁/C₂×100%.

2.5 抗氧化酶活性测定

具体方法参照文献(韩彦莎等，2016).利用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo，USA)检测细胞提取液的蛋白浓度.

2.6 H₂O₂和NO水平检测

分别利用2, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H₂DCFDA, Sigma-Aldrich，USA)、4-Amino-5- Methylamino-2, 7-Difluoro-fluorescein Diacetate(DAF-FM DA, Sigma-Aldrich，USA)荧光探针检测胡杨细胞内的H₂O₂和NO水平.具体方法参照文献(韩彦莎等，2016).利用Image-Pro Plus version 6.0软件分析细胞荧光强度.

2.7 硝酸还原酶(NR)活性测定

利用磺胺比色法检测胡杨细胞的NR活性，具体方法参照文献(刘洁等，2010).

2.8 基因表达水平检测

利用Trizol法提取胡杨细胞总RNA，通过M-MLV逆转录酶(Promega，USA)反转录合成cDNA.以cDNA为模板，使用SYBR Green Kit(Bio-Rad，USA)进行Real-Time PCR扩增.以Actin作为内参基因，引物序列见表 1.PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min.

2.9 数据统计分析

利用SPSS17.0软件对数据进行方差分析(ANOVA)，通过Duncan方法对不同处理组之间的数据进行多重比较，不同字母表示组间差异显著(p < 0.05).

3 结果(Results) 3.1 ABA缓解SO₂衍生物对胡杨细胞的毒性

植物细胞遭受逆境胁迫时，细胞膜破坏，膜透性增大，使电解质外渗.2 mmol·L^-1 SO₂衍生物处理胡杨细胞9 h后，电解质外渗率明显增加，为对照的2.1倍(图 1A)，细胞死亡率达到47.3%(图 1B).外源施加不同浓度的ABA(0.5、5、20 μmol·L^-1)后，与SO₂单独处理组相比，电解质外渗率和细胞死亡率均有不同程度的下降，其中，5 μmol·L^-1 ABA作用最为显著.以上结果表明，ABA(5 μmol·L^-1)能够明显缓解SO₂衍生物对胡杨细胞的毒性.在后续实验中，选取5 μmol·L^-1作为ABA处理浓度.

3.2 外源施用ABA对SO₂胁迫下胡杨细胞中的H₂O₂水平的影响

前期研究表明，H₂O₂和NO参与调控SO₂诱导的胡杨细胞死亡(韩彦莎等，2016).APX和CAT是植物细胞内负责清除H₂O₂的两种重要抗氧化酶.2 mmol·L^-1 SO₂衍生物处理胡杨细胞9 h后，与对照相比，细胞APX活性(以mg protein每分钟消耗的ASA量(nmol)表示)和CAT活性(以mg protein每分钟分解的H₂O₂量(nmol)计))显著下降(图 2)，胞内H₂O₂水平明显升高(图 3A)，H₂O₂荧光强度是对照的4.4倍(图 3B).与SO₂单独处理组相比，外源ABA的添加使细胞的APX和CAT活性分别提高了23.9%和48.0%(图 2)，胞内H₂O₂荧光强度降低了31.6%(图 3B).ABA单一处理组的APX和CAT活性、H₂O₂水平与对照组之间无明显差异(图 2、3).

3.3 外源施用ABA对SO₂胁迫下胡杨细胞中NO水平的影响

硝酸还原酶(NR)途径介导的NO合成是植物细胞内NO产生的重要来源.2 mmol·L^-1 SO₂衍生物处理胡杨细胞9 h后，与对照相比，细胞NR活性显著提高(图 4)，胞内NO水平明显增加(图 5A)，NO荧光强度是对照的3.3倍(图 5B).进一步的荧光定量PCR实验结果显示，SO₂胁迫下，硝酸还原酶的两个编码基因PeNia1、PeNia2表达显著上调(图 6).与SO₂单一处理组相比，ABA+SO₂处理组的细胞NR活性明显下降(图 4)，胞内NO荧光强度降低了24.2%(图 5B)，PeNia1和PeNia2基因表达水平分别比SO₂单一处理时下降了34.3%和25.8%(图 6).

4 讨论(Discussion)

SO₂是一种有毒的大气污染物.环境中高浓度的SO₂对植物具有毒害效应，可破坏叶绿体结构、分解叶绿素、干扰植物光合过程、引起叶片失绿坏死(刘荣坤，1989；Swanepoel et al., 2007)；还可诱发不可逆的遗传损伤，造成细胞核固缩、DNA断裂、染色体畸变率增高(Yi et al., 2012; Choi et al., 2014).研究表明，一定浓度的SO₂衍生物能够诱导蚕豆、萱草、万寿菊等植物的保卫细胞凋亡(Yi et al., 2012; Wei et al., 2013；2015).SO₂衍生物处理植物细胞时，进入胞内的SO₃^2-被氧化形成硫酸根(SO₄^2-)，该过程伴随活性氧产生，从而导致胞内活性氧水平升高.胞内活性氧水平升高后，一方面可引发膜质过氧化，破坏细胞膜结构，导致电解质外渗；另一方面能够激活下游的Caspase途径，诱导细胞死亡(Yi et al., 2012; Brychkova et al., 2013; Zhao et al., 2014).课题组前期研究发现，1~5 mmol·L^-1 SO₂衍生物暴露使胡杨细胞死亡率显著上升，且处理时间越长，细胞死亡率越高(韩彦莎等，2016).本文利用2 mmol·L^-1 SO₂衍生物处理胡杨细胞9 h后，电解质外渗率明显增加(图 1A)，细胞死亡率达到47.3%(图 1B).

ABA是一种逆境激素，能够通过调节气孔开度、诱导抗氧化防御系统、调控相关基因表达等过程来提高植物对干旱、盐渍、低温、重金属等多种胁迫的适应性(Zhu, 2002; Yang et al., 2014; Guo et al., 2012; Han et al., 2016).早期研究表明，叶片涂抹ABA溶液可明显提高植物对SO₂的抗性(Kondo et al., 1978；刘荣坤等，1983; 1985；韩素梅，2001).外源ABA一方面能够通过促进气孔关闭而减少SO₂气体进入植物(刘荣坤等，1983；韩素梅，2001)；另一方面还能够抑制叶片K⁺渗出，有效减轻SO₂对植物的损伤(刘荣坤等，1985).本研究发现，外源ABA对于胡杨细胞SO₂毒害也具有保护效应.外施ABA可明显缓解SO₂衍生物对胡杨细胞的毒性，显著降低胡杨细胞在SO₂胁迫下的电解质外渗率和细胞死亡率，但这种缓解作用具有浓度依赖性，其中，5 μmol·L^-1ABA的缓解效应最为明显(图 1)，这与镉胁迫下胡杨细胞中的研究结果类似(Han et al., 2016).较高的ABA浓度(20 μmol·L^-1)可能会抑制胡杨细胞在SO₂胁迫下的生理响应，导致缓解作用下降，但具体机制尚待进一步研究.

H₂O₂和NO是植物体内两种重要的信号分子.植物细胞遭受环境胁迫时，胞内H₂O₂和NO快速积累，诱导细胞毒性(De Michele et al., 2009; Jiao et al., 2013; Sun et al., 2014).本课题组的前期研究表明，H₂O₂和NO参与调控SO₂诱导的胡杨细胞死亡；使用外源H₂O₂清除剂、NO清除剂或合成抑制剂降低胞内H₂O₂、NO水平后，胡杨细胞死亡率明显降低(韩彦莎等，2016).APX和CAT是植物体内负责清除H₂O₂的两种关键抗氧化酶.本研究发现，SO₂胁迫下，外源ABA能够提高胡杨细胞的APX、CAT活性(图 2)，从而降低胞内H₂O₂水平(图 3).与此类似，本课题组前期在对胡杨细胞的研究中发现，通过外源施加ABA有助于增强镉胁迫下胡杨细胞APX、CAT等抗氧化酶的活性，减少胞内H₂O₂积累，从而缓解镉对细胞的毒性(Han et al., 2016).此外，Guo等(2012)在受冷害胁迫的辣椒中也发现ABA的类似作用.

硝酸还原酶(NR)途径介导的NO合成是植物细胞内NO产生的重要来源.课题组前期在拟南芥中的研究发现，SO₂胁迫可诱导拟南芥保卫细胞的NR途径增强，使NR的两个编码基因AtNia1、AtNia2表达上调，导致胞内NO水平升高(赵均等，2014).本研究显示，SO₂衍生物处理后，胡杨细胞中的NR活性明显提高(图 4)，NR途径中的关键基因PeNia1、PeNia2均转录上调(图 6)，导致胞内NO水平显著上升(图 5).外源ABA可抑制SO₂胁迫下胡杨细胞的PeNia1、PeNia2基因表达，降低细胞NR活性，从而减少胞内NO生成(图 4~6).

综上，本文初步证明了外源ABA缓解胡杨细胞SO₂毒性的作用，但对于其中具体的分子机制，以及内源ABA、H₂O₂、NO三者在SO₂诱导胡杨细胞毒性中的相互关系仍需进一步研究.

5 结论(Conclusions)

SO₂胁迫下，外源ABA一方面能够通过提高胡杨细胞APX、CAT活性来减少胞内H₂O₂积累；另一方面，还可以抑制细胞PeNia1、PeNia2基因表达，降低细胞NR活性，从而减少胞内NO生成.综上，外源施加ABA可有效降低胡杨细胞内H₂O₂和NO水平，缓解SO₂对胡杨细胞的毒性，降低细胞死亡率和电解质外渗率.