2018, Vol. 38
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2. 中日友好环境保护中心, 国家环境分析测试中心, 北京 100029;
3. 中国环境科学研究院, 国家环境保护化学品生态效应与风险评估重点实验室, 北京 100012;
4. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 青岛 266100;
5. 浙江大学化学工程与生物工程学院, 杭州 310012
2. National Research Center for Environmental Analysis and Measurement, China-Japan Friendship Center for Environmental Protection, Beijing 100029;
3. State Environmental Protection Key Laboratory of Ecological Effects and Risk Assessment of Chemicals, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012;
4. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100;
5. Institute of Industrial Ecology and Environment, Zhejiang University, Hangzhou 310012
水质基准是制定水质标准的科学依据(孟伟等，2009)，目前针对我国水域的水质基准研究较少(闫振广等，2009)，我国现行水质标准主要依据国外水质基准数值确定(Yin et al., 2003；罗茜等，2009)，但水质状况与生物区系的不同会造成水质基准的明显差异(吴丰昌等，2008；闫振广等，2010).因此，依据我国国情开展水质基准研究已经成为我国水环境管理的迫切需求(Wu et al., 2010).
菲(Phenanthrene，PHE)，是多环芳烃中最具代表性的物质之一，属于内分泌干扰物质，由于它被广泛应用于合成树脂、农药、染料、医药、防霉剂和鞣料等工业里，因此在空气、水体、土壤和动植物体内的检出率较高(肖佰财，2015).目前在国内外许多水体中都曾检测出菲，如美国新泽西州河口PilesCree水域中菲含量为80~800 ng·g-1(Kelly et al., 1999)，尼日利亚Siokolo岛水域中菲含量为1.46 μg·mL-1(Anyakorra et al., 2005).有研究显示，菲对双壳贝类、甲壳类、鱼类、水生昆虫等动物都有潜在的毒性(Zhang et al., 2004)，原因是菲结构中的9、10双键具有高电子密度，易与细胞内的DNA、RNA等物质结合而引起致毒作用，并且菲的结构中还具有与致癌性相关的K区(K-region)和湾区(bayregion)(Marchal et al., 2013；陶雪琴等，2006；Wu et al., 2013).通过开展菲的水生生物基准阈值研究，可以填补我国本土水生生物菲的生态毒性数据空白，为我国菲的水生生物基准建立、环境管理工作提供技术支持.
本研究根据我国淡水生物区系特征综合考虑物种筛选原则及影响因素，同时结合美国的水质基准“指南”中“三门八科”最低毒性数据要求，选择具有代表性的“四门八科”9种本土水生生物(锦鲤、麦穗、泥鳅、泽蛙蝌蚪、大型溞、青虾、摇蚊幼虫、霍甫水丝蚓和水螅属)进行生态毒理学急性和慢性实验，在推导出菲本土水生生物基准阈值的同时，与美国水生生物已报道毒性数据进行本土与美国物种毒性敏感度分析比较，探究非美国水生生物毒性数据进行我国本土水生生物基准研究的可行性.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料学术界一般认为，鱼类、浮游生物、底栖动物和植物可表征复杂水生态系统的结构特征和功能(Jin et al., 2011；Wu et al., 2012).按照美国水质基准“指南”中“三门八科”最低毒性数据要求，参照《中国脊椎动物大全》(李明玉等，2000)和《中国生物多样性国情研究报告》(国家环境保护总局，1998)等文献资料，我国水质基准推导的试验生物基本可采用“指南”规定的物种选择原则，但必须包括鲤科鱼类；另外由于我国鲤科数量庞大(伍献文，1963)，因此本文选用两种鲤科鱼.根据我国淡水生物区系特征，结合美国和欧盟推导水质基准的物种选择，初步确定了菲基准研究所需本土生物物种，分别是脊索动物门鲤科(锦鲤、麦穗鱼)、鳅科(泥鳅)、蛙科(泽蛙蝌蚪)，节肢动物门溞科(大型溞)、虾科(青虾)、摇蚊科(摇蚊幼虫)，环节动物门颤蚓科(霍甫水丝蚓)，腔肠动物门水螅虫科(水螅属)，共“四门八科”9种本土水生动物.另外，本研究系统全面的搜集了菲的水生植物毒性数据，但满足毒性数据筛选原则(US EPA，1985)的数据十分匮乏，仅搜集到浮萍(Lemna minor)的LC50(Landrum et al., 2003)数据，本研究选用此数据进行基准阈值推导.
9种本土水生动物购自朝来春及大森林水产市场，正式试验前均在实验室驯养至少7 d；大型溞(Daphnia magna)，溞龄 < 24 h(Lee et al., 2002)，由中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室提供.水生生物培养条件为：pH为8.0±0.2，DO为(8.3±0.3) mg·L-1，温度为(22±2) ℃，试验类型采用换水式，每24 h换1次水，急性试验不喂食，慢性试验按照0.1%生物质量1 d喂食两次；溞类光照周期为12 h:12 h.
受试物种选择依据如下(US EPA，1985)：当受试物种为水溞或其他水溞类动物时，应使用龄期小于24 h的生物进行试验；当受试物种为蚊类时，应使用其第2代或第3代幼虫进行试验；当受试物种为鱼类或其他物种时，应使用幼龄期的生物(至少要先于性腺发育前60 d)进行试验.
实验用菲，C14H10，纯度≥98%(HPLC), 为色谱纯，购自美国Sigma Aldrich化学品公司；其他试剂均为分析纯.全部玻璃器具使用前经过高价酸液冲洗之后由气相色谱分析从而保证不会产生干扰，同时操作过程中实验员严格遵守操作规定.菲溶液配制使用的移液枪经中国计量科学研究院校准，各个浓度组第一次实验前由气相色谱检测确保浓度配制精准.在3组空白实验中加入内标菲-d10，96 h后测定其回收率，结果显示，菲-d10的回收率为74.3%~89.6%，满足70%~130%的US EPA(1985)公布的回收率要求，证明本实验结果可靠准确.
2.2 实验方法急性实验按照美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials，ASTM)标准方法执行(ASTM, 1993；Kevin et al., 1993)，设空白对照组、助溶剂(二甲基亚砜, DMSO)对照组、浓度组，每组3个重复.溞类急性毒理学实验进行48 h，其余8种水生生物要进行96 h；相关信息见表 1.
| 表 1 PHE 9种本土水生生物急性毒性实验信息 Table 1 Acute toxicity tests information of PHE to nine resident aquatic organisms |
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慢性实验根据菲对锦鲤、泥鳅和大型溞的急性毒性试验结果，空白对照组、助溶剂(二甲基亚砜, DMSO)对照组、浓度组，每组3个重复.其中最高浓度组低于急性毒性LC50值.采用静态更新试液法，每隔1 d更新1次受试液并喂食.锦鲤、泥鳅慢性毒理学实验进行至少28 d以上，溞类至少21 d以上，具体实验浓度设置如下：锦鲤为0.00、0.35、0.46、0.60、0.78、1.01和1.32 mg·L-1 PHE；泥鳅为0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1PHE；大型溞为0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1 PHE.试验中每天记录锦鲤和泥鳅体长、体重等生长指标，记录大型蚤第一窝产卵时间、数量，总产卵窝数量和总产卵数量等.
2.3 数据搜集与分析通过US EPA ECOTOX毒性数据库(http://cfpub.epa.gov/ecotox/)、ELSEVIER数据库(http://www.sciencedirect.com)和CNKI数据库(http://www.cnki.net)等进行数据搜集.筛选原则如下：①测试信息不完全、信息保密、受权限或其他原因不能传播的数据不得使用；②具有高度挥发性、易水解或降解的物质，一般只有流水式试验的结果可以使用；③测试终点为慢性NOEC或LOEC值，优先使用NOEC值；④一些有问题或有疑点的数据(如：没有设立对照组、试验生物曾经暴露于污染物、试验设计不科学的数据)均不能采用(Feng et al., 2012；Jin et al., 2012).
另外，在获得毒性数据后，首先应该对数据或对数转换的毒性数据进行正态分布检验，一般采用K-S检验或者t检验.本研究选用K-S检验(Two-sample Kolmogorov-Smirnov)PHE美国水生生物毒性数据(表 2)的正态分布，结果显示，p=0.08＞0.05，认为美国水生生物毒性数据对PHE毒性敏感的总体分布基本相同，符合正态分布.
| 表 2 PHE美国水生生物急性毒性数据 Table 2 Acute toxicity data of PHE to American aquatic organisms |
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EC/LCx计算方法：EC/LCx和95%置信区间采用概率单位直线回归法计算，急性毒性试验x为50，慢性毒性实验x为10.试验开始和结束后溶液中PHE浓度检测结果显示实测和名义浓度比率在91.68%~103.47%之间，即浓度差异在20%以内，符合测试标准对浓度的要求(Aldenberg et al., 2000)，因此本文中浓度采用名义浓度计算EC/LCx.
3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 急性毒性实验9种本土水生生物的急性毒性试验结果见表 3，空白对照组和助溶剂对照组均未出现死亡现象.结果显示水螅属的96 h LC50为0.096 mg·L-1，水螅属对PHE暴露的敏感性最高，其次是大型溞、摇蚊幼虫、麦穗鱼、泽蛙蝌蚪、霍甫水丝蚓、青虾和锦鲤，对PHE最不敏感的是泥鳅，其96 h LC50为3.684 mg·L-1.
| 表 3 PHE本土水生生物急性试验结果 Table 3 esults of acute toxicity tests of PHE to resident aquatic organisms |
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本文也进行了PHE对美国水生生物毒性的对比，前人研究发现蓝鳃太阳鱼(Call et al., 1986)、虹鳟(Call et al., 1986)和大鳞大麻哈鱼(Rossi，1978)的96 h LC50为0.234、0.375和0.478 mg·L-1 PHE，这和本文的试验结果比较接近.同时本文研究得到的浮游甲壳类水生生物大型溞96 h LC50为0.275 mg·L-1，这与前人研究的另外一种浮游甲壳类生物蚤状溞(0.350 mg·L-1)也极为接近(Smith，1988).本研究中本土底栖甲壳类生物青虾96 h LC50为1.079 mg·L-1，而美国底栖甲壳类生物俄勒冈虾96 h LC50为0.027 mg·L-1(Geiger，1982)，两者之间相差了40倍左右；环节动物之间同样存在着较显著差异，本土霍甫水丝蚓96 h LC50为0.799 mg·L-1，美国夹杂带丝蚓对PHE毒性更加敏感，96 h LC50为0.419 mg·L-1(Geiger，1982).由于缺乏相应的毒性数据，因此本文未进行昆虫类及两栖类对比.
3.2 慢性毒性数据对于慢性毒性数据(表 4)，Call等报道称大型溞的存活率21 d NOEC为0.163 mg·L-1，与本试验中大型溞总繁殖数量的21 d EC10(0.060 mg·L-1)处在一个数量级之内.同时所有试验浓度组中均未出现死亡现象，表中可见大型溞对PHE暴露的繁殖总数试验终点要比存活率更为敏感.本试验中锦鲤和泥鳅生长的28 d EC10分别为0.435和0.540 mg·L-1 PHE，前人研究发现PHE对虹鳟生长的28 d NOEC分别为0.66 mg·L-1(Geiger，1982).在慢性毒性试验中，大型溞仍然是对PHE暴露最敏感的物种.
| 表 4 PHE本土水生生物慢性试验结果 Table 4 Results of chronic toxicity tests of PHE to resident aquatic organisms |
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Davies等提出“灵活使用毒性数据”的设想(Davies，1994)，即使用一个地区的生物毒性数据去进行另一个区域的生态风险评估.不过该设想提出后受到多方面质疑，因为不同地区水温、水中溶解氧浓度不同，而且不同种类生物对同一有害物质的敏感性也存在差异(Hose et al., 2007).本研究针对本土(表 2)与美国(表 3)生物毒性数据拟合的SSD曲线进行比较，从而初步探索“灵活使用毒性数据”设想的可行性.由于慢性数据相对匮乏，因此本研究仅使用急性毒性数据.本研究针对PHE毒性数据共拟合出3条SSD曲线，分别是本土生物毒性数据(黑线)、美国生物毒性数据(红线)及本土+美国生物全部毒性数据(蓝线).如图 1所示，由左向右分别是美国数据、总体数据及本土数据，这意味着美国相对于本土生物对PHE暴露表现出更加敏感的趋势.经过计算，3条曲线的HC5值分别是0.0780、0.0785及0.0854 mg·L-1.
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| 图 1 PHE本土、美国及全部生物毒性数据SSD曲线拟合比较 Fig. 1 Species sensitivity distribution of native, American and all species toxicity data for PHE |
数学统计检验中，two-sample Kolmogorov-Smirnov(K-S test)检验通常用于推断两样本分别代表的两总体分布是否相同(Borja et al., 2000).因此借助Kolmogorov-Smirnov检验分析本土与美国毒性数据二者之间是否存在显著性差异具有十分重要的学术价值：①如果两者有显著性差异，那么验证了我们学术界有必要进行选取本土水生生物进行相关的基准阈值研究；②如果两者无显著性差异，那么证明在本土基准阈值推导过程中可以采用已经报道过的美国水生生物毒性数据，从而减少重复的人力物力投入及受试生物的消耗.K-S结果如下：(Ks = 1.342, n1 = 10, n2 = 9, p = 0.08).p =0.08＞0.05，按a=0.05水准，认为两组数据对PHE毒性敏感的总体分布基本相同，两组数据之间不存在显著性差异性(图 1).
3.4 PHE水生生物水质基准阈值推导本文采用USEPA“指南”推荐的SSR方法对基于实测数据的PHE水生生物基准阈值进行了计算(US EPA，1985)，本土物种SMAV值和GMAV值排序见表 5，计算得出我国PHE的急性基准阈值CMC为0.033 mg·L-1，该值是由FAV(0.066 mg·L-1)除以评价因子(通常取值为2)所得(吴丰昌等，2011；闫振广等，2011).由于我国PHE慢性毒性数据稀少，本文采用“指南”推荐的FCV=FAV/FACR方法计算FCV值，FACR(5.51)是通过3种水生生物SACR的几何平均值算出(本研究中大型溞、锦鲤和泥鳅的SACR分别是4.18、5.86和6.82)，最终得出FCV值为0.012 mg·L-1，而FCV值远远低于PHE植物毒性值(浮萍，0.658 mg·L-1)，因此能对植物起到保护作用(Verbruggen et al., 2012).“指南”指出，CCC是由FCV、FPV和FRV中较小的值确定(金小伟等，2009).由于我国相应的MPC和BCF值缺乏，而且植物的敏感性通常远远低于动物，因此在很多情况下可以不计算FRV，直接用FCV值计算CCC(吴丰昌等，2011).最终得出我国PHE的慢性基准阈值CCC为0.012 mg·L-1.
| 表 5 PHE水生生物种平均值及急慢性比 Table 5 Ranked GMAVs with SACRs |
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前人研究报道(Call et al., 1986)大型溞的96 h LC50为0.230 mg·L-1，这与本研究的结果(0.275 mg·L-1)相似.前人通过物种敏感性比较得出麦穗鱼对有机污染物特别是杀虫剂的敏感性较高，Yan等(2012)通过毒性试验发现麦穗鱼对溴代阻燃剂(TBBPA)的敏感性较高，因此，可以初步判断本土水生生物中，鱼类中的麦穗可能是一种对有机化合物相对敏感的物种.Edsall等(1991)研究发现虹鳟鱼苗对有机氯农药(OCPs)较为敏感.另外，Wang等(2013)通过毒性试验发现，泥鳅对广谱抗菌剂三氯生(TCS)的敏感性较高，但本文的试验结果发现泥鳅对PHE的敏感性最低，这可能是由于不同化合物对水体底层的水生生物产生毒性影响不尽相同导致的(Paolo et al., 2004).
由于美国生物毒性数据不包括昆虫和两栖类水生生物，将本土昆虫类摇蚊幼虫、两栖类动物泽蛙蝌蚪的毒性数据去除之后再次进行K-S检验，p=0.13＞0.05(Ks= 0.830, n1 = 8, n2= 7).因此，这表明PHE本土与美国生物的敏感性不存在显著性差异，这表明直接使用美国水生生物毒性数据来推导我国本土水生生物基准阈值是可行的，这与前人研究结果相符(Jin et al., 2011；Wang et al., 2014).
另外，借助荷兰RIVM公布的ETX2.0软件(RIVM，2004)及环保部《淡水水生生物水质基准制定技术指南》(环境保护部，2017)推荐的敏感度分布(SSD)(EU，2003)法求出HC5值，分别是0.102和0.0854 mg·L-1.因此当评价因子确定为2时，这两种SSD曲线计算得出的CMC分别为0.051和0.0427 mg·L-1，可以看出，与US EPA“指南”中推荐的SSR法求出的CMC(0.033 mg·L-1)相比较同在一个数量级.
5 结论(Conclusions)1) 采用US EPA“指南”推荐的方法对菲本土水生生物急性基准阈值(CMC)和慢性基准阈值(CCC)进行了推导，分别为0.033 mg·L-1和0.012 mg·L-1；另外，借助荷兰RIVM公布的ETX2.0软件及欧盟推荐的SSD方法进行基准阈值的验证，结果显示两种方法所得阈值与SSR法处在同一数量级.
2) 本土与美国物种之间敏感性不存在显著性差异，这表明存在使用美国水生生物毒性数据来推导我国菲水生生物基准阈值的可能性.
致谢: 感谢中国环境科学研究院闫振广研究员在文章修改中给予的帮助.
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