2017, Vol. 37
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2. 福建农林大学, 福州 350002
2. Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002
农业和农村废弃物是农业温室气体的主要排放源之一.据统计, 中国近年来每年产生的农作物秸秆近9亿t, 畜禽粪污38亿t(农业部发展计划司, 2016).另据文献报道, 随着农业生产的发展和人口的进一步增加, 农业废弃物会以年均5%~10%的速度递增(王义祥等, 2016).因此, 如何实现农村废弃物处理的减废减排和高效利用的统一, 成为我国农业废弃物资源化研究和技术发展面临的重要挑战.
堆肥是最合适的处理农业废弃物的技术之一, 是在一定的人工条件下, 有控制地促进可生物降解的有机物进行矿化和腐殖化的过程, 并以其成本廉价、操作简单等优点得到了广泛使用, 特别是在发展中国家.据报道, 截至2013年, 我国有机肥生产企业大约有4100家, 每年生产有机肥5000万t左右, 但堆肥产生的有害气体排放也造成了严重的环境问题(江滔等, 2015；孙永明等, 2005).由于硝化和反硝化作用的结果, 约0.02%~9.9%的总氮(TN)以N2O的形式排放；由于供氧不足, 0.1%~12.6%的总有机碳(TOC)以CH4的形式排放(Jiang et al., 2011).近年来也有越来越多的研究关注堆肥过程中温室气体的排放(Brown et al., 2008), 很多因素比如堆料C/N、水分含量、翻堆频率及过磷酸钙和生物炭添加等(黄华等, 2013；罗一鸣等, 2012；陶金莎等, 2014；赵晨阳等, 2014；施林林等, 2012)都会对堆肥过程产生影响, 如较低的C/N比猪粪堆肥造成了较高的甲烷排放(Jiang et al., 2011), 低翻堆频率增加了N2O和CH4排放, 而生物炭添加可减少堆肥过程中N2O和CH4的排放(贾兴永, 2015).实际上堆肥的矿化和腐殖化过程都和堆料的微生物性质有关, 同时, 堆料的微生物组成与性质又被堆料的底物性质和环境条件所决定(张阅等, 2015).此外, 强制通风静态垛堆肥作为我国常见的好氧堆肥方式之一, 而该方式下相关报道还很缺乏.因此, 本文利用强制通风反应箱研究垫料和菌渣堆肥对温室气体排放的影响, 以及其与微生物间的相互作用关系.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 供试材料养猪废弃垫料源自福清渔溪部队农场, 主要原料为椰丝、谷壳等；菌渣来自福州罗源县华源公司秀珍菇废弃菌袋, 主要原料有棉籽壳、木屑、麦皮等；不同物料的基本性质见表 1.
| 表 1 不同物料的基本性质 Table 1 The properties of composting materials |
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堆肥发酵利用自制的强制通风静态堆肥反应箱(图 1), 反应箱主要由发酵箱、通气口、进料口、排水管、筛板、鼓风机等组成, 箱体大小为高120 cm、长100 cm、宽100 cm, 总体积为1200 L.试验共设计了4个不同堆肥处理, 其中, T1、T3处理原料以垫料为主, 占总质量的60%；T2和T4处理以菌渣为主(占比60%), 各处理的原料配比见表 2, 含水率为60%~65%, 每处理重复3次.利用尿素来调节不同堆料处理的C/N使其均为30 : 1.其中, T3和T4处理以溶液形式添加EM菌剂, 添加的EM菌剂购于河南农富康生物科技有限公司.各处理的堆料按相应配比充分混匀后装箱.在前期预备试验的基础上, 根据堆体内氧气浓度变化确定了堆肥通风控制条件.通风采用时间控制法, 800 L · min-1的鼓风量从箱体底部透过筛板向箱内通风.堆肥前1~7 d, 风机每隔30 min吹风30 min；第8~36 d鼓风机每隔1 h吹风30 min；第37~45 d, 鼓风机每隔75 min吹风15 min.试验堆肥发酵分两个阶段, 一次发酵为第1~30 d, 二次发酵为第31~45 d, 第30 d时进行翻堆处理.每天利用数显温度计测定并记录空气环境和料堆温度的变化.
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| 图 1 试验用堆肥反应箱示意图 Fig. 1 Schematic diagram of a lab-scale composting reactor |
| 表 2 不同试验处理原料配比 Table 2 Material ratio of different treatments |
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在堆肥的第0、10、20、25、30、35、40、45 d采集堆肥样品.每个箱子用采样器采集5个点, 每个样点采集样品50 g左右, 在箱外充分混匀后用四分法取样.微生物群落结构的分析采用磷脂脂肪酸分析方法, 具体分析步骤按照刘波等(2010)的方法.温室气体包括CO2、CH4和N2O, 利用静态箱-气相色谱法测定(秦晓波等, 2012).发酵过程中每隔5 d测定一次, 即第5、10、15、20、25、30、35、40、45 d, 测定时间在上午9:00－10:00之间.采集气体样品时, 关闭鼓风机打开堆肥反应箱顶盖, 自然通风10 min, 然后盖上顶盖和打开安装在顶盖下面的气体搅动扇并开始计时, 密闭条件下每隔3 min从反应箱顶部预留的采集口处利用60 mL注射器采集气样1次, 共采集4次, 同时记录箱内温度和环境温度, 并采集环境空气样品作为空白.种子发芽指数的测定参照韩玮等(2015)的方法.
2.4 数据处理根据IPCC 2014年第5次报告中温室气体增温潜势表示方式, 堆肥过程中产生的CH4和N2O统一用CO2当量表示, 其中, CH4和N2O折算CO2当量系数分别为25和298, 且有机废弃物分解排放的CO2不包括在内(IPCC, 2014).采用Sigma Plot 10.0、SPSS18.0软件对数据进行处理及相关性分析.
3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 温度变化试验过程中发酵分为一次发酵(第1~30 d)和二次发酵(第31~45 d)两个阶段, 且各处理总体的温度均表现为先升后降的趋势(图 2).就不同处理而言, T2和T4处理大于50 ℃的高温期(11~13 d)多于T1和T3处理(7~8 d), 这是因为相对废弃垫料为主料的T1和T3处理而言, 以菌渣为主的T2和T4处理含有更丰富的碳源, 有助于提高微生物代谢活性(王义祥等, 2016).添加菌剂处理大于50 ℃的高温期也高于未添加菌剂处理, 但差异不显著.
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| 图 2 不同处理堆肥过程中堆温的变化 Fig. 2 Changes in temperature during composting |
种子发芽指数(GI)作为评价堆肥腐熟度的优选指标已经得到广泛认可.在发酵结束后(45 d后), 4个处理的种子发芽指数均大于80%, 可认为堆肥已达到腐熟, 其中, T4处理的种子发芽指数最高, 分别比T1、T2和T3处理高10.2%、9.0%和14.1%, 但各处理间的差异不显著(p > 0.05).
| 表 3 堆肥结束后种子发芽指数 Table 3 Germination index after composting |
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图 3显示, 4个堆肥处理的CO2排放速率总体表现为先降后升再降的趋势, 4个处理的峰值均出现在堆肥的第5 d, 但T1和T3处理在第40 d出现第2个小高峰, 这是因为以垫料为主料的T1和T3处理堆料相对紧实, 通过二次发酵阶段翻堆改善了通气条件, 进一步促进了CO2的排放(贾兴永, 2015).方差分析表明, 堆肥第5 d时各处理间CO2排放速率均存在显著性差异(p < 0.05)；堆肥第40 d, T1和T3处理与T4处理间的差异也达到显著性水平(p < 0.05).就CO2平均排放速率而言, 各处理的大小顺序为T3 > T2 > T1 > T4, 其中, T3处理CO2平均排放速率比T1处理高出5.65%, 比T2和T4处理高出4.32%和10.73%.
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| 图 3 不同处理堆肥过程中CO2排放速率的变化 Fig. 3 CO2 emissions during composting |
4个处理的N2O排放速率变化趋势相似, 整体上呈下降趋势, 4个处理的峰值均出现在堆肥第5 d时, 且各处理间的差异均达到显著性水平(p < 0.05).在堆肥第15 d后, T1和T3处理的N2O排放速率总体上高于T2和T4处理.T1和T3处理在堆肥第43 d至堆肥结束几乎无N2O排出，T2和T4处理在堆肥第20 d以后N2O排放速率接近零值.就N2O平均排放速率而言, 各处理的大小顺序为T1>T2>T3>T4, 说明添加EM菌剂降低了N2O排放(王斌等, 2014).其中, T1处理的N2O平均排放速率分别比T2、T3处理高7.66%和17.89%, T2处理比T4处理高27.45%.
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| 图 4 不同处理堆肥过程中N2O排放速率的变化 Fig. 4 Nitrous oxide emissions during composting |
堆肥物料局部厌氧可能导致CH4产生.本试验条件下, 仅在堆肥第5 d时, 各处理均有甲烷产生, 这是由于堆肥升温期微生物活动剧烈, 消耗氧气产生CO2速率快, 导致缺氧而产生CH4(刘俊专等, 2014)；后期随着CO2排放速率降低, 氧气供应充足, CH4排放速率降低.添加菌剂的堆肥处理CH4平均排放速率高于未添加菌剂的处理, 其中, T3处理比T1处理高101.19%, T4处理比T2处理高38.89%.
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| 图 5 不同处理堆肥过程中CH4排放速率的变化 Fig. 5 Methane emissions during composting |
为了综合评价不同物料处理对堆肥过程中温室气体排放的影响, 根据相邻两次气体排放速率平均值和间隔时间计算在间隔时间内排放的气体总量, 进而求出堆肥期间温室气体累积排放量(李艳春等, 2016), 结果见表 3.不同堆肥处理温室气体排放贡献的大小顺序为T1 > T2 > T3 > T4, 其中, 添加菌剂处理温室气体排放贡献高于未添加菌剂处理, T3处理温室气体减排9.6%, T4处理比T2处理减排4.5%.
| 表 4 不同堆肥处理温室气体累积排放量 Table 4 The cumulative emissions of greenhouse gases from different composting treatments |
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图 6为不同堆肥处理微生物脂肪酸标记总量, 4个堆肥处理微生物脂肪酸标记总量总体变化趋势为先增后降, 但至堆肥结束时(第45 d), 各处理微生物脂肪酸标记总量分别较初始值上升了5.5%、7.0%、1.0%和7.9%.添加菌剂的T3处理高于T1处理, 添加菌剂的T4处理高于未添加菌剂T2处理, 但它们间的差异不显著(p > 0.05).不同堆肥处理中平均微生物脂肪酸标记总量以T4处理最高, 分别比T1、T2和T3处理高3.5%、2.5%和2.27%, 其与T1处理间差异达显著性水平(p < 0.05)
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| 图 6 不同堆肥处理微生物脂肪酸生物标记总量 Fig. 6 Total microbial markers in different composting treatments |
在堆肥过程中, 不同处理微生物脂肪酸标记种类随时间的变化不尽相同(图 7).T1处理的种类数为51~58, T2处理为56~60, T3处理为53~58, T4处理为55~60.堆肥发酵结束(第45 d)时, 4个处理的种类数分别比初始值增加了13.7%、1.2%、4.8%和4.6%.整个堆肥期间, 添加菌剂的T3、T4处理脂肪酸生物标记种类数分别高于未添加菌剂的T1、T2处理, 但两者间的差异不显著.
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| 图 7 不同堆肥处理微生物标记种类 Fig. 7 Microbial markers species in different composting treatments |
4个堆肥处理不同微生物类群磷脂脂肪酸生物标记含量的大小顺序为细菌>真菌>放线菌(图 8), 但整个堆肥过程中不同微生物数量的变化规律不同.在堆肥的起始阶段细菌和真菌首先快速增长, 迅速成为这一阶段优势微生物群落.在细菌、真菌的强烈增殖活动下, 堆体的温度迅速上升, 堆肥快速进入高温期.由于温度的升高和营养物质的消耗, 细菌和真菌的数量开始下降(曹云等, 2015).Tiquia(2012)研究认为, 大多数真菌在堆肥温度高于50 ℃时均消失, 但当温度低于45 ℃后一些真菌群落开始恢复.高温期过后随着温度的降低, 细菌和真菌的
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| 图 8 不同堆肥处理微生物类群数量的变化 (a.真菌，b.细菌，c.放线菌，d.甲烷氧化菌) Fig. 8 Changes of microbial groups in different composting treatments |
数量又有所上升(图 8a、8b).放线菌数量变化则与细菌和真菌的变化相反(图 8c), 这可能是由于堆肥前期和后期细菌与真菌的含量较多, 由于种群之间的竞争关系抑制了放线菌的生长(李昂等, 2014).甲烷氧化菌随堆肥时间的变化与甲烷排放速率变化趋势相反, 甲烷氧化菌数量增加可氧化消耗更多CH4, 从而降低了堆肥过程中CH4的排放(图 8d).就不同处理而言, T1和T3处理的各微生物类群总量变化较稳定, 而T2和T4处理的微生物类群总量变化较大, 这与温度的变化规律相似, T1和T3堆肥处理温度波动比T2和T4处理小.
3.8 微生物菌群与温室气体排放速率的相关关系相关分析表明, 真菌和甲烷氧化菌与CO2和N2O排放间存在显著的正相关性；细菌与CO2和N2O排放间具有显著的正相关关系, 且与细菌的相关系数高于真菌.CH4排放与特征微生物间没有显著的相关性(表 5).
| 表 5 温室气体排放速率与微生物菌群间的相关系数 Table 5 Correlation coefficient between greenhouse gas emission rate and microbial flora |
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堆肥过程是一个微生物生态群落消长演替的过程, 在这一过程中, 随着环境条件的变化, 微生物种群数量也发生变化, 并在不同时期形成不同的优势菌群(Mondini et al., 2003).于安等(2009)研究表明, 在堆肥的各个阶段, 居于主导地位的微生物群落是不同的.在堆肥的初期和高温期, 微生物的数量较少；而随着堆肥温度的下降, 微生物大量繁殖.本研究结果表明, 不同堆肥处理细菌数量最大, 而后依次是真菌>放线菌>甲烷氧化菌.细菌、真菌和甲烷氧化菌在堆肥腐熟期高于前期, 而放线菌在降温阶段较高.相对传统堆肥, 通过接种微生物菌剂可以增加堆肥初期微生物的群体数量来加速有机物质的分解活动, 产生大量的热量, 使堆体迅速升温.本研究结果也表明, 添加EM菌剂处理较未添加处理升温更快.目前, 有关微生物接种对堆肥影响的研究结论仍存在分歧.一些研究认为, 接种微生物对堆肥进程和堆肥品质没有显著作用, 并认为堆肥原料中本身含有微生物, 并可以在较短时间繁殖到较大的数量(李国学等, 2000).但大量的研究结果也表明，向堆肥中添加接种剂会产生良好的效果(李平等, 2002；劳德坤等, 2015；徐莹莹等, 2015; Wei et al., 2007).本研究结果表明, 相对未添加EM菌剂处理, 添加菌剂处理微生物脂肪酸标记总量较高, 但微生物脂肪酸标记和种类变化不大，与未添加EM菌剂处理无显著性差异.由于堆肥中微生物菌系复杂, 在整个堆肥过程中菌种组成变化较大, 而微生物研究方法的科学与否将直接影响到对于客观规律的准确把握(叶劲松等, 2008).本研究所采用的磷脂脂肪酸的方法虽然快速、方便、准确, 但不能鉴别属、种, 下一步还需综合运用现代生物化学与分子生物学方法来分析堆肥过程和不同微生物菌剂处理间特定功能微生物菌群结构和数量的变化.
堆肥过程中堆料的碳水化合物在适宜的环境条件下, 在微生物的作用下会迅速分解成CO2和H2O, 并释放大量的热能.堆肥初始时氧气和微生物所必需的营养元素比较充裕且温度适宜, 好气微生物活动开始占优势, 易分解的可溶性物质(淀粉、糖类)首先迅速氧化分解成CO2和H2O, 产生CO2排放高峰, 其中, T1、T2和T3处理的CO2在堆肥前5 d即达到最大排放量, 而T4处理的最高值出现在第10 d, 可能是由于堆肥初期温度迅速上升, 加之堆肥内部湿度较大, 抑制了微生物的活动；而后期由于通风和湿度降低, 微生物活跃, CO2排放速率增加(高凌飞, 2015).在堆肥过程中, 堆肥内部氧气浓度是影响甲烷产生的重要因子, 缺氧状态下导致甲烷产生.各处理CH4排放主要集中在堆肥第5 d, 这是由于有机物质的大量分解造成堆体供氧不足, 最终导致堆体氧化还原电位下降, 产生甲烷, 这与Sun等(2014)的研究结果一致.各处理间CH4排放速率无显著差异且均处于较低的水平, 说明本试验条件下通风条件不易产生厌氧状态.N2O产生于堆肥过程中铵态氮的硝化和硝态氮的反硝化过程(Philippe et al., 2012).目前, 堆肥过程中N2O排放规律尚存在争议.Kader等(2007)认为堆肥初期N2O排放产生于物料堆存期, 堆肥开始后随温度升高而排放, 而Yamulki等(2006)研究认为过高的温度会抑制硝化细菌的活性, 因此, N2O不会产生于高温期.本研究结果表明, 堆肥过程中N2O排放速率在堆肥第5 d最高, 此时堆肥中CH4排放也达到高峰, 说明该时期堆体内已出现供氧不足；在供氧不足的条件下, 堆肥中的NOx-N和硝化作用生成的NOx-N通过不完全反硝化途径产生N2O (Peigne et al., 2004), 这与Yang 等(2013)和江滔等(2011)的研究结果一致.实际上, 堆肥过程的氮素转化和N2O排放与堆肥各阶段的微生物群落及功能性微生物密切相关.以垫料为主成分的堆料的N2O排放速率高于以菌渣为主成分的堆料, 添加EM菌剂可减少N2O的排放.这是因为EM菌剂是一种混合菌, 主要包括光合菌、乳酸菌群和酵母菌群等, 能与产甲烷菌和硝化反硝化菌竞争获取养分, 从而影响N2O的产生(王斌等, 2014).相关分析表明, 细菌和真菌与N2O排放呈正比, 其中与细菌的相关系数最大.
5 结论(Conclusions)1) 菌渣、垫料堆肥过程中CO2、CH4和N2O的排放速率均呈现为前期排放速率最大, 中后期排放量减少的规律, 其中，3种温室气体排放量的大小顺序为CO2 > N2O > CH4, CO2排放量占总排放量(以CO2排放当量计)的89.1%~91.2%.以垫料为主的堆肥处理3种温室气体排放量高于比以菌渣为主的堆肥处理, 添加EM菌剂可降低N2O排放量4.5%~9.6%.
2) 堆肥过程中, 微生物脂肪酸标记总量表现为先增后降的趋势, 接种EM菌剂可增加堆料中微生物脂肪酸标记总量, 这与温室气体排放速率的变化规律基本一致, 其中，真菌、细菌、甲烷氧化菌与CO2和N2O排放速率呈现正相关关系, 其中以细菌的影响最大.
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