环境科学学报  2017, Vol. 37 Issue (10): 3629-3634
反渗透膜面细菌胞外多聚物提取方法研究    [PDF全文]
孙浩1 , 于童1 , 胡洪营1,2     
1. 清华大学环境学院, 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室, 国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室, 北京 100084;
2. 清华-伯克利深圳学院, 环境与新能源技术工程实验室, 深圳 518055
摘要: 城市污水脱盐系统的反渗透(RO)膜面生物污堵问题严重影响了该技术的稳定运行,解析生物污堵机理的关键因素是微生物胞外多聚物(EPS)特征分析,然而目前细菌EPS提取方法多样,无统一标准,制约了EPS分析的可靠性和可对比性.基于此,本文以再生水厂RO膜面污堵物中分离的细菌为对象,采用水浴、超声、离子树脂、碱液4种方法提取EPS,以DOC和DNA含量表征提取的EPS总量和提取过程细胞破裂程度.结果表明,45℃水浴法不造成细胞破裂,提取总量多,是一种有效的提取方法.进一步对比不同提取时间条件下EPS溶液中多糖和蛋白含量变化,以及分子量、荧光特征等,综合认为提取1 h时,提取的EPS中多糖与蛋白相对含量稳定,不同分子量化合物均溶于水中,能客观地反映EPS特征.研究表明,45℃水浴1 h可以作为细菌EPS提取的适用方法应用.
关键词: 反渗透膜     生物污堵     细菌     胞外多聚物     提取方法    
Study on extraction method of extracellular polymeric substances from bacteria on reverse osmosis membrane
SUN Hao1, YU Tong1, HU Hongying1,2    
1. State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, State Environmental Protection Key Laboratory of Microorganism Application and Risk Control(SMARC), School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084;
2. Shenzhen Environmental Science and New Energy Technology Engineering Laboratory, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, Shenzhen 518055
Received 16 February 2017; received in revised from 20 March 2017; accepted 20 March 2017
Supported by the National Key Research and Development Program of China (No.2016YFE0118800)
Biography: SUN Hao(1987—), male, E-mail: sunhao123@tsinghua.edu.cn
*Corresponding author: HU Hongying, E-mail: hyhu@tsinghua.edu.cn
Abstract: The biofouling of reverse osmosis (RO) membrane seriously affects the operational stability of municipal reclaimed water desalination system. Microbial extracellular polymeric substance (EPS) analysis is the key factor to dissect the biofouling mechanism. Despite that there are many methods for the EPS extraction, there is still no standard method at the moment. This restricts the uniformity and comparison of biofouling analysis. This study uses the bacteria isolated from RO membrane as the research object, and EPS was extracted using 4 different methods, namely water bathing at 45℃, ultrasound, ion exchange resin, and NaOH. The concentrations of DOC and DNA were measured in EPS solution, to characterize the EPS amount and the degree of cells lysis during the extraction processes respectively. The results suggest that 45℃ water bathing can effectively extract bacterial EPS without cell lysis. Furthermore, comparing the total amount of EPS, polysaccharide and protein compositions, molecular weight, and fluorescence characteristics in EPS solutions with different extraction time under the condition of 45℃ water bathing, suggest that when heating the sample for 1 h, the concentration of polysaccharide and protein is relatively stable. It was also found that different molecular weight compounds are dissolved in water, which is objectively reflected the characteristics of EPS. In conclusion, 45℃ water bath for 1h can be used as an effective method for EPS extraction in pure bacteria system.
Key words: reverse osmosis membrane     biofouling     bacteria     EPS     extraction method    
1 引言(Introduction)

污水再生利用是解决水资源危机的战略性选择(胡洪营等, 2015), 反渗透(Reverse Osmosis, RO)脱盐技术是目前污水深度处理中广泛应用的方法(范正虹等, 2005;汤芳等, 2013; Greenlee et al., 2009).但RO膜污堵问题严重影响了再生水厂的出水水质和运行成本(Dong et al., 2016; Falath et al., 2017), 其中, 生物污堵是主要的污堵形式且难以预测与控制.生物污堵是细菌在RO膜面形成生物膜, 导致膜通量、脱盐率下降, 同时造成膜面清洗困难等(Chu et al., 2005;Doumèche et al., 2007; Drews, 2010; Drews et al., 2006), 而生物膜的形成与细菌分泌的胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)密切相关(Drews et al., 2006), 因此, 细菌EPS特征分析是研究RO膜生物污堵机理和控制污堵的重要基础.

目前为分析EPS特征所使用的提取方法多样, 总体可分为物理和化学方法(D′Abzac et al., 2010).物理方法是通过外力作用使EPS与菌体分离, 溶解于水中, 包括加热、超声、离心等方式(Kunacheva et al., 2014).化学方法则是通过添加化学试剂破坏EPS内部及与细胞间的连接结构使得EPS溶于水中, 如添加树脂(Frolund et al., 1996) 或螯合剂(EDTA等)(Comte et al., 2006), 置换EPS中的二价阳离子(Ca2+、Mg2+等), 使EPS聚合体失去原有稳定性后溶解于水中;或添加酸性/碱性溶液改变pH值(Liu et al., 2002), 使EPS中碱性/酸性基团分子化合物分离, 同时增加EPS在水中的溶解度.以上方法各有利弊, 在活性污泥或纯菌样品研究中均有使用(Sheng et al., 2005;Comte et al., 2006), 但缺少对提取过程中细胞破坏的评价(Pellicer Nacher et al., 2013), 导致细菌EPS分析结果的可靠性降低.此外, 不同方法提取的EPS中多糖、蛋白含量差别明显(Liu et al., 2002), 导致分析结果难以相互比较, 因此, 也制约了对RO膜生物污堵的认识和污堵机理的分析.

本研究以再生水厂RO膜面上典型污堵细菌为研究对象, 比较不同提取方法的有效性, 并进一步优化提取条件, 提出适合纯菌体系下EPS的提取方法, 以期为RO膜面纯菌体系下EPS组成分析和生物污堵机理解析提供科学依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 细菌培养与预处理

实验所用细菌从实际运行的再生水厂污染RO膜面分离纯化得到.菌种经16S rRNA基因序列测序, 以长度为700 bp的序列与EZTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon) (Kim et al., 2012) 进行比对, 与数据库中Pseudomonas vancouverensis ATCC 700688T相似度最高, 相似度为100%.

细菌接种于300 mL R2A液体培养基中, 于1 L锥形瓶中振荡培养(25 ℃、150 r·min-1)至对数期末期.菌液于4 ℃条件下4000 g离心20 min, 弃掉培养基, 加入等量高纯水洗涤后, 再次于4 ℃条件下4000 g离心20 min, 弃掉上清液以进一步去除培养基, 最后将细菌重悬于30 mL高纯水中用于EPS提取.

2.2 EPS提取方法对比

选用4种常用的物理、化学提取方法进行对比:① 水浴法, 选用文献报道中常用的高温(80 ℃)条件(Frolund et al., 1996; Li et al., 2007; Wingender et al., 1999), 同时参考微生物菌落测定标准(GB 4789.2—2010), 选用了防止细胞死亡的温度(45 ℃)条件; ② 超声法, 具有时间短的优点, 但文献报道中对于超声条件不尽相同(Comte et al., 2006; Kunacheva et al., 2014; Liu et al., 2002), 分别选用50 W小功率与130 W大功率超声对比; ③ 离子树脂法, 是较早提出的经典方法(Frolund et al., 1996), 选用Na+型阳离子树脂(Sigma-Aldrich), 使用前进行酸洗和碱洗以去除树脂中有机物; ④ 甲醛-NaOH提取法, 具有EPS提取总量多的优点(Liu et al., 2002), 首先加入少量甲醛溶液固定细胞, 防止细胞破裂, 再加入一定量的NaOH溶液用于提取EPS; ⑤ 设置一组对照试验, 将细菌浸泡于高纯水中24 h(4 ℃), 用于对比各方法的提取效率.

以上各方法所得到的溶液于4 ℃条件下12000 g离心20 min, 所得上清液经0.2 μm滤膜过滤后得到EPS溶液.具体提取步骤如图 1所示.

图 1 EPS提取方法流程图 Fig. 1 Flow chart of EPS extraction method
2.3 EPS组成分析

溶解性有机碳(DOC)使用岛津TOC-VCPH型总有机碳分析仪测定.DNA含量使用二苯胺(DAPI)法(Brunk et al., 1979) 测定, 以鲑鱼精DNA为标准样品.蛋白含量使用Lowry法(Lowry et al., 1951) 测定, 使用Thermo公司Modified Lowry蛋白试剂盒.多糖含量使用蒽酮-硫酸法(Rondel et al., 2013) 测定, 以葡萄糖为标准样品.三维荧光测定使用日立F-7000型荧光分光光度计(Wang et al., 2010).分子量测定使用岛津LC-20AD型液相色谱仪, 配置SPD-M20A PDA检测器, 串联TKSgel G3000PWxl和G2500PWxl色谱柱, 外接GE Sievers M9便携式总有机碳分析仪(吴艳芳等, 2012;岳兰秀等, 2005;Huber et al., 2011).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 提取方法有效性分析

有效提取EPS的标准是在不破坏细菌菌体的条件下, 尽可能使EPS从菌体表面脱落溶解于水中.如果提取过程中细胞破裂, 会释放出DNA, 因此, 通过检测DNA含量是较为便捷的判断细菌菌体破坏程度的指标.EPS总量则以提取溶液中DOC值来表征.

表 1可以看出, 80 ℃水浴和130 W超声法EPS提取总量多, 提取溶液DOC值分别为201.8 mg·L-1和314.0 mg·L-1, 但也明显造成了细菌菌体破裂, 提取溶液中检测到较高的DNA含量, 分别达到35.7 mg·L-1和171.4 mg·L-1, 说明提取细菌EPS应使用温和条件.50 W超声和离子树脂提取方法虽不会造成菌体破裂, 但提取溶液DOC值较低, 分别为15.0 mg·L-1和16.4 mg·L-1, 而对照实验中将细菌浸泡于高纯水中24 h后, DOC值也达到11.3 mg·L-1, 因此, 这两种方法的提取效率较低, 也不能有效提取纯菌的EPS.甲醛-NaOH法提取的EPS溶液DOC值虽达到696.6 mg·L-1, 但通过理论计算发现添加的甲醛DOC值为700 mg·L-1, 同时, 甲醛-NaOH法提取的EPS溶液中DNA含量为4.3 mg·L-1, 说明即便在甲醛保护细胞的情况下, 碱性环境不仅未能使EPS大量溶解于水中, 还会造成菌体破裂.45 ℃水浴条件下, 提取溶液DOC值为83.7 mg·L-1, 且检测不到DNA, 说明45 ℃水浴30 min不会造成菌体破裂, 且提取总量相对较多, 是细菌EPS提取的较好方法.

表 1 不同提取方法EPS溶液中DOC和DNA含量 Table 1 DOC and DNA concentrations in EPS solutions with different extraction method
3.2 水浴提取条件优化

为进一步明确45 ℃水浴法提取的合适时间, 比较了10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h时间条件下提取的EPS特征.从图 2可以看出, 随提取时间的延长, 提取总量(DOC值)增加, 但增加趋势逐渐减缓, 而提取1 h后在EPS溶液中检出DNA, 且DNA含量随时间增加呈对数增长趋势, 即长时间的45 ℃水浴虽然增加了提取总量, 但也会造成细胞的破裂.

图 2 45 ℃水浴不同时间EPS提取液中DOC和DNA含量变化 Fig. 2 Variation of DOC and DNA concentrations in EPS solutions with different extraction time of 45 ℃ water bath

提取的EPS中蛋白、多糖类物质含量也均随时间延长而增加, 10~60 min阶段多糖含量从9.3 mg·L-1快速增加到64.3 mg·L-1, 蛋白含量从4.2 mg·L-1增加到52.7 mg·L-1, 但增加幅度不如多糖类物质, 因此, 10~60 min阶段多糖与蛋白的比值是快速下降的(图 3).这可能与多糖较蛋白更容易溶解于水中有关, 也可能与开始阶段溶解的是菌体最外层EPS, 而其中多糖类物质含量更高有关.提取1 h后, 多糖与蛋白的增加均变缓, 提取3 h时多糖含量达到99.4 mg·L-1, 蛋白含量达到134.8 mg·L-1, 但从多糖与蛋白比值来看, 1~3 h提取的EPS溶液中多糖与蛋白比值基本稳定在0.8左右, 说明EPS中不同组分化合物均溶解于水中, 更为客观地反映了EPS组成特征.

图 3 45 ℃水浴不同时间EPS提取液中多糖与蛋白比例变化 Fig. 3 Ratio variation of polysaccharide vs. protein in EPS solutions with different extraction time of 45 ℃ water bath

根据活性污泥中溶解性微生物分泌物典型荧光峰的最大激发和发射波长与可能的物质(氨基酸、腐殖酸等)组成的对应关系, 可将EPS三维荧光图划分为6个荧光区域, 分别代表 6种物质种类(图 4)(陈诗雨等, 2015; Stedmon et al., 2003; Wang et al., 2010).从图 4可以看出, 不同时间(10 min~3 h)条件下45 ℃水浴提取的EPS荧光峰特征并没有明显差别, 均在酪氨酸、色氨酸蛋白(λEx/λEm=280 nm/350 nm)和酪氨酸、色氨酸区域(λEx/λEm=220 nm/350 nm)有较强的荧光响应.说明随水浴时间增加, 并不会有其它荧光特征的物质溶出.

图 4 45 ℃水浴不同时间EPS提取液三维荧光特征 Fig. 4 Fluorescence characteristics in EPS solutions with different extraction time of 45 ℃ water bath

采用高效体积排阻色谱(HPSEC)法测定EPS分子量.水体中腐殖质类大分子有机物及含C=C双键和C=O双键的芳香族化合物在254 nm处有较强的紫外吸收(UV254), 在细菌EPS中基本对应了蛋白类物质, 但EPS中多糖类物质不具有紫外吸收特征峰, 因此, 紫外检测器不能完全反应EPS特征, 而TOC检测器能检测EPS中所有含碳有机物(Huber et al., 2011), 所以本研究分析仪器同时配置了TOC检测器.从实验结果看, 色谱柱保留时间为14~18 min时, 分离出10 kDa以上的大分子化合物, 水浴10 min提取的EPS中这些大分子化合物在TOC检测器上出峰不如30 min后提取的EPS中出峰完整(图 5a), 水浴30 min提取的EPS中这些大分子化合物在紫外检测器上出峰强度较弱(图 5b), 说明短时间内45 ℃水浴不能将蛋白、多糖类大分子化合物(Zhang et al., 2016) 完全从菌体上溶解出来.色谱柱保留时间为19~21 min时, 分离出100~5000 Da的小分子化合物, 水浴10 min和30 min提取的EPS中这些小分子化合物无论在TOC检测器, 还是紫外检测器上均响应较低, 水浴1~3 h提取的EPS中则有明显的出峰(图 5).因此, 短时间内45 ℃水浴并不能使不同分子量的化合物均溶解于水中, 提取物不能真实反映细菌EPS特征.这也与图 3中10~30 min阶段多糖与蛋白比值较高, 提取1 h后多糖与蛋白含量比值稳定的实验结果相吻合.

图 5 45 ℃水浴不同时间EPS提取液分子量分布特征(a. TOC响应; b.UV254响应强度) Fig. 5 Molecular weight distribution in EPS solutions with different extraction time of 45 ℃ water bath

因此, 综合以上实验结果, 可以认为45 ℃水浴1 h在保证菌体不破坏的条件下, 有效提取出了EPS, 且该时刻溶出的EPS中蛋白与多糖相对含量稳定, 不同分子量大小的化合物也均能检出, 客观反映了EPS的组成特征.

4 结论(Conclusions)

1)80 ℃水浴和130 W超声均会造成细菌细胞破裂, 50 W超声、离子树脂法提取的EPS总量低, 甲醛-NaOH法提取EPS不仅会造成细胞裂解, 且提取总量低, 45 ℃水浴是能有效提取纯菌EPS的方法.

2) 通过比较45 ℃水浴不同时间EPS特征表明, 提取总量随时间增加而增加, 但提取时间超过1 h后会造成细胞破裂, 而提取时间小于30 min时, EPS中部分大分子物质及蛋白类物质未完全溶出, 提取时间为1 h时, 不同组分化合物、不同分子量化合物均溶出, 能客观反映细菌EPS特征.

3)45 ℃水浴1 h可以作为提取RO膜面纯菌EPS的有效适用方法.由于实际污染情况更为复杂, 可以DNA、多糖、蛋白含量为依据, 确立不同条件下的特定提取时间.

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