1 引言(Introduction)

生物淋滤技术具有处理成本低、可常温常压操作等优点, 在低品位矿石冶金(Johnson, 2013; Mauricio et al., 2016)、废催化剂回收(Mafi Gholami et al., 2012)等方面受到了广泛关注.研究发现, 淋滤菌株(如A.thiooxidans)可以吸附到矿物颗粒的表面, 并在吸附点位形成蚀刻, 而矿物的氧化及金属的溶释就发生在吸附点位, 胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)在此吸附过程中发挥着重要作用, 可以协助细胞吸附可溶性养分, 增强抵抗不利环境的能力, 有效地保护微生物, 促进淋滤金属的溶出(Govender et al., 2011).

目前, 废电池生物浸提的研究主要集中在淋滤条件的优化(Bahaloo et al., 2016; Ijadi Bajestani et al., 2014; Kim et al., 2016; Xin et al., 2016), 如固液比、能源底物、培养温度等, 鲜见探索浸提菌株EPS在浸提过程中的作用及浸出机制的研究.淋滤体系中, 既包含菌株、硫磺和黄铁矿等还原性能源底物, 又存在电池材料(Niu et al., 2015；2016).就本质而言, 废电池金属的溶释是在电池材料表面通过菌株及其EPS和代谢产物等的共同作用下发生的界面反应.因此, 探究淋滤过程中EPS的变化和特征, 将有助于揭示废电池的生物浸出机制, 这对该技术的应用具有重要意义.为此, 本研究通过模拟及提取菌株EPS进行废旧锌锰电池生物浸提实验, 借助扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、三维荧光等分析手段, 探究淋滤过程中EPS的作用及对锌、锰离子的溶出机制.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料准备

选用市面上常见的废旧锌锰电池, 拆除并收集电池电极材料, 研磨成粉状, 过100目筛, 在60 ℃下烘干后备用(牛志睿等, 2015).盐酸-硝酸-氢氟酸-高氯酸消解电池粉末样品, 通过原子吸收分光光度计测定, 电池粉末中Zn、Mn的含量分别为208、305 mg·g^-1.

2.2 淋滤实验设计 2.2.1 淋滤菌株培养

实验选A.thiooxidans和L.ferrooxidans为浸提混合菌株, 分别以元素硫和硫酸亚铁作为2种菌株的能量底物, 定期接种(牛志睿等, 2016), 其中, 基础培养液含有4种营养盐：(NH₄)₂SO₄ 2.0 g·L^-1、KH₂PO₄ 1.0 g·L^-1、MgSO₄·7H₂O 1.0 g·L^-1、CaCl₂ 0.25 g·L^-1.当菌浓度达到2×10⁸个·mL^-1, 进行淋滤液培养, 分别接种2种菌(体积比5%)于淋滤培养基(包括营养盐、S 10 g·L^-1、FeS₂ 4 g·L^-1(以Fe计)), 按100 mL每瓶分装于250 mL三角瓶中, 并在140 r·min^-1的摇床中恒温(35 ℃)培育；培养7~8 d之后, 待淋滤液pH降为1.0左右后, 精确调整体系pH=1.0(3 mol·L^-1 H₂SO₄或10%NaOH), 然后进行后续浸提实验.

2.2.2 外源模拟EPS浸提实验

为探究EPS是否有助于浸提, 预先进行模拟EPS浸提实验, 其组分包括(Gu et al., 2013)：鼠李糖(10.8%)、海藻糖(17.1%)、葡萄糖(15.2%)、硬脂酸(21.6%)和阿拉伯糖(0.7%).将5 g电池粉末加入到装有100 mL淋滤液的三角瓶中(电池质量与淋滤液体积比为5 g/100 mL, 以下均简称为5%固液比), 同时投加不同浓度梯度的模拟EPS(0、0.5、1.0、2.0和4.0 g·L^-1), 然后连续13 d摇床培养；期间监测淋滤液pH、ORP、Fe³⁺、Fe²⁺浓度和细菌数量, 定期取样离心测定溶液的Zn、Mn浓度.

2.2.3 菌株EPS提取及辅助浸提实验

EPS提取：淋滤菌株经15~20 d的培养, 当浓度达到10⁹个·mL^-1时, 进行菌株EPS的提取(Zeng et al., 2010), 取上清液于100 mL的离心管中, 置于80 ℃恒温水浴器中加热10 min, 室温静置冷却后, 在恒温高速离心机(4 ℃)内进行两步离心操作(16000 g、20 min；8000 g、10 min), 收集上清液, 即为EPS提取液.

EPS辅助浸提实验：将20 mL提取的EPS投加至培养好的淋滤液中, 并保持体系容积100 mL、pH=1.0, 然后进行5%固液比浸提, 过程监测各项指标；同时, 进行5%固液比空白生物浸提实验并提取体系EPS, 方法同上.

2.2.4 不同淋滤体系浸提实验

为了探讨淋滤体系菌株EPS直接参与浸提或间接参与的差异及生物产酸和Fe²⁺、Fe³⁺氧化还原反应对浸提的贡献, 设计了5%固液比下的H⁺、H⁺+Fe²⁺、H⁺+Fe³⁺、生物淋滤和半透膜包覆生物淋滤(电极材料包裹于截流量为8000 Da的透析袋, 不与菌株接触)5种体系(Xin et al., 2012), 设置5种体系的初始pH=1.0, Fe²⁺、Fe³⁺均为4 g·L^-1, 淋滤方法同上.以上所有实验均重复3次.

2.3 EPS组分特征及界面行为分析 2.3.1 菌株EPS组分及特征变化分析

为了解淋滤过程中菌株EPS含量对溶出效率的影响, 对提取的EPS样品进行三维荧光光谱分析, 利用Origin8.0软件计算荧光区域积分标准体积(FRI), 计算公式如下(Yu et al., 2015)：

(1)

(2)

(3)

式中, Φ_{i, n}为EPS荧光区域i的积分标准体积(au·nm²)；Φ_i为EPS荧光区域i的积分体积(au·nm²)；λ_ex为仪器激发波长(nm)；λ_em为仪器发射波长(nm)；I(λ_ex, λ_em)为激发、发射波长对应荧光强度(au)；Φ_{T, n}为EPS总荧光区域积分标准体积(au·nm²)；P_{i, n}为第i荧光区域积分标准体积的比例；MF_i为倍增系数.

2.3.2 菌株EPS界面行为分析

为探究淋沥过程菌株EPS的界面行为, 对淋滤体系菌株固定并进行SEM、TEM分析.样品制备方法：取10 mL淋滤菌液于5000 g离心10 min, 弃上清液后, 加2.5%戊二醛摇匀, 置于4 ℃冰箱固定4 h；用磷酸缓冲液洗涤2次并离心, 乙醇梯度(30%、50%、70%、80%、90%)脱水各1次, 100%乙醇脱水2次(15 min·次^-1, 7000 g离心5 min)；经乙酸异戊酯置换乙醇2次(20 min·次^-1, 7000 g离心5 min), 将样品分别在-20、-40和-80 ℃下冷冻12 h, 置于冷冻干燥机中干燥12 h后, 进行SEM、TEM测试.

2.4 主要仪器和条件

锌、锰离子浓度由原子吸收分光光度计(AA-6300C, Shimdzu)测定；菌株的微观界面形态由SEM(Hitachi S-4800) 和TEM(JEM-3100F)观察；EPS特征变化采用三维荧光(Hitachi F-7000) 测定, λ_ex=200~450 nm, λ_em = 200~550 nm, 扫描速度1200 nm·min^-1.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 EPS对生物浸出的影响

图 1是实施外源模拟EPS和菌株EPS辅助浸提后锌和锰溶出浓度的变化.在添加EPS的淋滤体系中, 监测的pH值始终低于空白淋滤体系, EPS增加了菌株活性, 其代谢产酸效果明显, 当添加量为2.0 g·L^-1时, 获得了最的大锌、锰溶出浓度(溶出率), 分别为5230 mg·L^-1(50.3%)和5810 mg·L^-1(38.1%), 高出空白体系25.4%和27.1%.淋滤菌株为化能自养菌, 有机物的大量加入会抑制自养菌的生长及活性(Donati et al., 2007), 因而没有获得进一步溶出提升.而当加入菌株EPS后, 锌、锰浸提效率得到了大幅提升, 分别达到80%(8318 mg·L^-1)和60%(9156 mg·L^-1), 相比空白增加了近100%, 特别是淋滤第1 d, 就获得了70%锌、35%锰的溶出率, 可见菌株EPS初始阶段的促进效果显著.

此外, 由图 2淋滤过程中体系Fe³⁺、Fe²⁺浓度的变化可知, 随着淋滤的进行, 投加EPS、空白体系中Fe³⁺、Fe²⁺和总铁均呈不同幅度的下降, 原因是形成了黄钾铁矾(KFe₃(SO₄)₂(OH)₆)沉淀(Yu et al., 2011; 2013; Niu et al., 2015).在添加EPS的淋滤体系, Fe³⁺、Fe²⁺浓度的下降较空白体系缓慢, 淋滤第1 d后, 含有123 mg·L^-1的Fe³⁺、95 mg·L^-1的Fe²⁺和218 mg·L^-1的总铁, 在浸提13 d后, 还存在一定量的Fe³⁺(8 mg·L^-1)和Fe²⁺(11 mg·L^-1)；而空白体系淋滤3 d后, Fe³⁺、Fe²⁺浓度已降为0 mg·L^-1.菌株EPS在浸提过程中可以螯合Fe³⁺, 并发生Fe³⁺/Fe²⁺生化循环反应(Zeng et al., 2010; Zhu et al., 2008).Donati和Sand(2007)认为, 可以将EPS看作是一种特殊的“反应室”, 大约为10~100 nm的尺度, 在“反应室”中发生着Fe³⁺/Fe²⁺的相互转化；Sand和Gehrke(2006)发现, 菌株EPS在淋滤过程中起着重要的接触作用, EPS相当放大了细胞的辐射和活动半径, 促进了生物浸提.在对淋滤前后样品的XRD、XPS及EDX的研究中发现, 难溶性的锌、锰主要依赖于Fe³⁺/Fe²⁺生化循环反应的溶释(Niu et al., 2015；2016), 即EPS“反应室”中可能发生的氧化还原反应包括(Johnson, 2013; Xin et al., 2012; Niu et al., 2016)：

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

3.2 EPS组分及浸提过程中特征变化 3.2.1 EPS组分分析

经蒽酮比色法和考马斯亮蓝法测定, 淋滤菌株EPS中糖和蛋白质的含量分别为527.3 mg·L^-1和129.4 mg·L^-1.Harneit等(2006)分析发现, A.thiooxidans产生的EPS含有约40%~50%的糖和40%~65%的脂肪酸(如二十烷酸)；而L.ferrooxidans的EPS主要含有中性糖、饱和脂肪酸、葡萄糖醛酸.图 3为消除拉曼散射影响后得到的EPS三维荧光图谱, 由图可知, 峰值1出现在λ_ex/λ_em=280 nm/340 nm处, 表明混合菌提取的EPS样品中含有大量微生物代谢的色氨酸；峰值2出现在λ_ex/λ_em=230 nm/330 nm处, 表明样品中还含有大量的芳香蛋白物质, 着与Gehrke等(1998)和Kinzler等(2003)的研究相一致.

3.2.2 EPS荧光光谱的变化

为探究淋滤过程中EPS特征变化与锌、锰浸提的关系, 对空白生物淋滤体系的EPS和锌、锰溶出进行了连续9 d的监测分析.从图 4中可以定性地看出, 荧光强度随时间的延长稍有增加, 表明体系中对抗不利环境的EPS变化不大, 尽管淋滤体系中还存在一定数量的菌株, 但由于缺乏EPS而降低了浸提能力(Gehrke et al., 1998), 无法实现其高效溶出, 这也与3.1节中菌株EPS对锌、锰溶出促进的研究结果相吻合.由此可见, 菌株的EPS保有量将直接影响锌、锰的生物浸提.

3.2.3 EPS荧光区域积分标准体积的变化

经FRI计算, 得到淋滤体系随时间变化的5个荧光积分标准体积(表 1).由表 1可知, 在投加电池样品的取样第1天Φ_{T, n}为28901.4 au·nm²；EPS主要以微生物代谢产物为主(区域Ⅳ), 其次为芳香性蛋白类物质(区域Ⅰ和区域Ⅱ), 还包括有腐殖酸和富里酸类等物质.EPS的Φ_{T, n}值经9 d后增长为32590.1 au·nm², 增幅仅为16.8%, 这源于高固液比下对菌株带来的毒性、剪切等影响.此外, 通过淋滤过程EPS荧光区域积分标准体积(P_{i, n})组分比例的变化可知(图 5), EPS区域Ⅰ和区域Ⅱ的芳香性蛋白类物质比例大约为25%, 区域Ⅳ代谢产物为30%, 在淋滤进程中组分比例的变化趋势不大.考察淋滤体系Φ_{T, n}和锌、锰溶出效率(浓度)的关系, 结果如图 6所示.由图可知, 体系中的与锌、锰的溶出效率之间的决定系数R²分别为0.942和0.981, 2种金属离子的浸出受Φ_{T, n}的显著影响, 即锌、锰溶出依赖于菌株的EPS保有量.

3.3 不同淋滤体系浸提实验结果分析

之前的研究中发现, 不同淋滤体系中Mn的溶出效率依次为(1%固液比)：生物淋滤＞H⁺+Fe²⁺≈半透膜包覆生物淋滤＞H⁺+Fe³⁺≈H⁺体系, Zn溶出基本一致, 这说明Mn(IV)的溶出在于生物酸溶下的Fe²⁺还原作用, 锌的溶出源于生物酸溶(Xin et al., 2012).以上的研究基于废电池材料中锌为ZnO, 锰由MnO、MnO₂和Mn₂O₃等物质组成(Xin et al., 2012).最近发现, 废电池材料中还含有大量的ZnMn₂O₄、Zn₅(OH)₂Cl₂(H₂O)和Zn₅(NH₃)₂Cl₂等物质, 特别是难溶ZnMn₂O₄的存在(牛志睿等, 2015), 可能会涉及更复杂的溶出机制.在本次5%固液比电池材料的5种淋滤体系实验中发现, 溶出效率为：生物淋滤>H⁺+Fe³⁺≈半透膜包覆生物淋滤>H⁺+Fe²⁺>H⁺体系, 与之前研究略有不同, 在生物浸提中影响因素的重要性依次为：菌株EPS>Fe³⁺>Fe²⁺, 即锌、锰的溶出源自微生物参与下Fe³⁺或Fe²⁺的生化氧化还原作用；Fe³⁺对电池材料的化学浸提源于反应(6) 及水解产酸酸释的联合作用, 较Fe²⁺的化学还原溶释贡献更大.

3.4 菌株EPS的SEM、TEM分析

由淋滤菌株3000倍的SEM图可以看出(图 7a), 菌株大量粘附在废旧锌锰电池材料表面, 材料表面出现了类似菌株大小的腐蚀坑, 应是淋滤菌脱离材料表面后所造成的, 说明菌株可以通过EPS粘附在材料表面进而溶蚀材料, 实现锌、锰的溶出.在材料不光滑或不完整表面, 淋滤菌株数量明显增多(如图中的白色箭头所示), 说明菌株会优先吸附在材料表面具有明显缺陷的位置, 而这些易于吸附的区域往往是物质结晶化较低的区域(Gehrke et al., 1998; Kinzler et al., 2003), 更容易被淋滤菌株攻击.从25000倍下的SEM谱图还可以看出(图 7b), 淋滤菌株通过EPS而彼此粘附在一起, 其细胞边缘开始变得模糊, 材料表面还附着着一层膜状物质, 而这种裹于材料表面的物质即为菌株EPS.

此外, 通过TEM图谱(图 8)也可以看出, 一方面菌株之间通过EPS团聚在一起, 粘附了大量的电池材料或能源底物(图 8a中箭头所示)；另一方面, 游离的单菌附着的EPS同样也粘附材料的微小颗粒(图 8b中箭头所示), 可见在淋滤过程中, EPS的吸附作用是淋滤菌株接触并溶出电池材料的主要方式.Kinzler等(2003)进行了A.f.菌株R1和SPIII/3的黄铁矿淋滤机理研究, 通过AFM谱图发现, 2种菌株均是通过EPS实现了对金属硫化矿的吸附, 进而氧化浸提出Fe³⁺.还有学者认为(Zhu et al., 2008; Perry et al., 2005), 这种EPS的吸附优先发生在易于形成微小“原电池”的阳极或阴极的位置, 菌株EPS吸附黄铁矿后可以发生阳极的溶解反应, 从而将黄铁矿中的Fe²⁺和硫代硫酸盐溶解进入到溶液中, 经过菌株的氧化实现Fe³⁺的浸出.

综上, 废旧锌锰电池生物浸提中EPS的溶出作用主要体现在：① 直接接触浸提, 淋滤菌株通过EPS粘附在废旧锌锰电池材料表面, 其中, 螯合的Fe³⁺对电池材料进行攻击, 同时Fe²⁺和H⁺也参与反应, 通过生物化学反应溶释出锌锰, 涉及的主要反应见式(6)~(8)；② 间接接触作用, 菌株在EPS的参与下氧化能源底物, 生成代谢产物如H⁺, 与电池材料发生酸溶化学反应(式(9)~(12)).

(9)

(10)

(11)

(12)

4 结论(Conclusions)

1) EPS的加入促进了菌体与能源底物及电池材料的接触, 强化了Fe³⁺/Fe²⁺的循环, 特别是在初始阶段的促进效果尤为显著, 在5%固液比下增加了近100%溶出率.

2) 三维荧光分析和FRI计算发现, EPS的保有量直接影响锌、锰的浸提, 锌、锰离子溶出效率随Φ_{T, n}的增大而增大.

3) 半透膜包覆淋滤实验、SEM和TEM结果表明, 菌株通过EPS粘附在电池材料表面进而腐蚀材料, 且优先吸于附材料表面具有明显缺陷的位置.

4) 在生物浸提过程中, EPS两种溶释机制同时存在, 共同作用, 难溶的锌、锰主要通过菌株EPS的直接接触机制溶释, 而易于酸溶的锌、锰在间接接触机制的化学反应中迅速溶出.