环境科学学报  2017, Vol. 37 Issue (9): 3543-3552
二维电场中微生物群落动态及混合有机物降解特征    [PDF全文]
范瑞娟1,3 , 郭书海2 , 李凤梅2 , 张琇1,3     
1. 北方民族大学生物科学与工程学院, 银川 750021;
2. 中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016;
3. 国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室, 银川 750021
摘要: 以正十六烷、环十二烷和芘组成的混合有机污染物为研究对象,在二维对称电场修复平台上,采用电动-微生物联合修复(BIO-EK)的方式,通过分析微生物群落时空动态及混合有机物降解的时空特征,探讨了二维电场中电场强度、微生物群落和污染物降解特征之间的相关性.结果表明,BIO-EK处理过程中,土壤pH和温度在时间和空间上均没有发生明显的变化,微生物群落结构和数量均主要随处理时间而变化,未发生明显的空间上的变化;电场的施加可提高微生物数量,对污染物降解有积极影响,相对于单独的微生物(BIO)和单独的电动(EK)处理,BIO-EK对污染物处理效率最高;不同类型污染物去除率与电场强度均呈正相关.
关键词: 有机污染土壤     电动修复     二维电场     生物修复     微生物群落    
Dynamics of microbial community and degradation characteristics of mixed organics in a 2-dimensional electric field
FAN Ruijuan1,3 , GUO Shuhai2, LI Fengmei2, ZHANG Xiu1,3    
1. College of Biological Science & Engineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan 750021;
2. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016;
3. Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission, Yinchuan 750021
Received 11 December 2016; received in revised from 7 February 2017; accepted 7 February 2017
the Major Science and Technology Program for Water Pollution Control and Management of China(No. 2013ZX07202-007), the Scientific Research Project of Ningxia Institutions(No.NGY2016153), the Key Scientific Research Projects of Beifang University of Nationalities(No.2015KJ34) and the Scientific Research Projects of Beifang University of Nationalities(No. 2016skky07)
Biography: FAN Ruijuan (1985—), female, lecturer (Ph.D.), E⁃mail:fanruijuan@163.com
Abstract: This study evaluated the interactions among electric intensity, microbial community and degradation characteristics of contaminants in the bio-electrokinetics (BIO-EK), by analyzing the temporal and spatial dynamics of the microbial community and characteristics of mixed organics. n-hexadecane, cyclododecane and pyrene were used as mixed organic pollutants, and a 2-dimensional (2-D) symmetric electric field was applied as remediation platform. The results demonstrate that, during the experiments, the soil pH and temperature show little spatial and temporal variation.The microbial community changed significantly, whereas no significant spatial variation were noticed. The presence of the electric field improved the microbial quantity, having a positive effect on pollutants degradation, and the pollutants decreased most intensively in the BIO-EK test compared with bioremediation (BIO)-and electrokinetics (EK) -only tests. An obvious positive correlation between the degradation rates of different types of pollutants and electric intensity was detected.
Key words: organic contaminated soil     electrokinetic remediation     2-dimensional electric field     bioremediation     microbial community    
1 引言(Introduction)

目前, 关于生物修复技术在去除土壤有机污染物方面的研究已有大量报道(Moliterni et al., 2012; Lladó et al., 2013; 李凤梅等, 2016).土壤pH、温度、含水率、污染物类型和分子结构对微生物的生长乃至污染物的生物降解效率都有重要影响.对于复杂的混合有机污染物来说, 一个分散均匀、具有良好代谢潜能的微生物群落是促使微生物发挥效能的关键驱动力, 是实现不同成分去除的重要基础(Lors et al., 2010).然而, 一些疏水性有机污染物的生物可利用性很差, 严重阻碍了微生物的修复效率(Sarkar et al., 2005).近年来, 人们开始使用电动-微生物耦合技术以提高土壤中有机污染物尤其是一些顽固性有机物的去除速率(Gomes et al., 2012; 张灿灿等, 2014; 魏巍等, 2015; Fan et al., 2015; Guo et al., 2014).

电动技术对土壤的修复作用依赖于一系列的电化学过程, 包括电迁移、电渗析、电泳及电化学氧化在土壤中所诱导的氧化还原反应(Acar, 1993; Probstein et al., 1993).在电动处理过程中, 土壤中的营养物质、电子受体、污染物(强疏水性污染物除外)和微生物的迁移率得以促进, 从而使污染物的生物可利用性得到加强(Wick et al., 2004; Wick et al., 2007).一些难迁移的疏水性有机物很难通过电渗析、电迁移或电泳的方式去除, 对于这种类型的污染物往往需要依靠电化学的方式得以去除(Xu et al., 2014).在一定范围内, 电场强度的增大可使反应区域扩大, 从而使污染物的去除率得到提高(Jin et al., 2010).在电动处理过程中需要维持土壤孔隙水以保证电极反应的进行, 而在电极附近由于水的电解作用会导致极端pH的发生, 对微生物的生长具有负面影响(如使微生物活性、数量降低), 进而削弱污染物的降解(Lear et al., 2007; Kim et al., 2010).然而, 周期性切换电极极性可消除土壤含水率和pH的大幅变化, 可降低对微生物的危害(Harbottle et al., 2009; 赵庆节等, 2009; Klankeo et al., 2009).近年来, 已有一些关于电场作用下微生物群落变化及污染物去除率与电极距离之间的关系方面的研究(Li et al., 2012; Huang et al., 2013).然而, 这些研究都是基于一维电场作用下的, 还不能系统、完整地阐明电场强度、微生物群落和污染物降解之间的相互关系.

本研究以正十六烷、环十二烷和芘组成的混合有机污染物为研究对象, 在二维对称电场修复平台上, 采用电动-微生物联合修复的方式, 通过分析微生物群落时空动态及混合有机物降解的时空特征, 探讨二维电场中电场强度、微生物群落和污染物降解之间的相关性.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 试验材料 2.1.1 污染物

正十六烷(纯度>98%, 东京化成工业株式会社), 密度为0.773 g · cm-3, 熔点为18.2 ℃, 沸点为286.8 ℃;环十二烷(纯度>99%, 东京化成工业株式会社), 密度为0.871 g · cm-3, 熔点为61 ℃, 沸点为247 ℃;芘(纯度>99%, 百灵威科技有限公司), 密度为1.271 g · cm-3, 熔点为150 ℃, 沸点为393.5 ℃.

2.1.2 试验土壤

试验土壤采自中国科学院沈阳应用生态研究所生态站附近0~30 cm表层, 理化性质为:pH=6.22, 有机碳6.43 g · kg-1, 阳离子交换量21.25 cmol · kg-1, 速效氮73.43 mg · kg-1, 速效磷7.23 mg · kg-1.将土壤自然风干2周后过2 mm筛.将正十六烷、环十二烷和芘分别以5000、1000和50 mg · kg-1的剂量均匀混入土壤中, 配制成混合烃污染土壤, 室温状态下平衡1周.经过气相色谱分析, 土壤中正十六烷、环十二烷和芘的实际含量分别为4744.54、947.22和48.81 mg · kg-1.将土壤pH调为7, 采用NaNO3、(NH4)2SO4和K2HPO4将土壤C : N : P比例调整为100 : 5 : 1.

2.1.3 降解菌

以筛选自大庆油田石油污染土壤的6株菌B1、B2、B3、B6、B7和B9组成的混合菌为供试细菌, 其中, B2和B3对直链烷烃、环烷烃和芳烃均具有降解能力, B1、B6、B7和B9对直链烷烃和环烷烃具有降解能力.根据初步的鉴定结果, 菌株B1、B2、B6和B7分别属于Hydrogenophaga sp.、Phenylobacterium sp.、Sphingobium sp.和 Bacillus sp., B3和B9属于Arthrobacter sp..将细菌活化后, 接入到牛肉膏蛋白胨培养基(含5 g · L-1牛肉膏, 10 g · L-1蛋白胨, 5 g · L-1 NaCl, pH 7.0~7.2) 中, 用10 L发酵罐在150 r · mim-1、35 ℃条件下发酵培养, 3 d后低温条件下离心收集(8000 r · mim-1, 2 min).将收集到的菌体悬浮于无机盐培养基(含1.5 g · L-1 NaNO3, 1.5 g · L-1 (NH4)2SO4, 1.0 g · L-1 K2HPO4, 0.5 g · L-1 MgSO4 · 7H2O, 0.5 g · L-1 KCl, 0.01 g · L-1 FeSO4 · 7H2O, 0.002 g · L-1 CaCl2, pH 7.0) 中备用.

2.2 试验装置及试验设计

试验装置如图 1所示, 包括1个土壤室(100 cm× 100 cm×25 cm)、25根圆柱形不锈钢电极(20 cm×1 cm)、1个直流电源、1支土壤温度计、1个控制系统及1个实时监测系统.25根电极以矩阵的形式排列, 电极间距为20 cm;控制系统可对电极极性按设定的时间间隔进行阴阳极的极性切换, 并可将电极极性以行/列转换的形式进行旋转切换, 以此形成一个二维的对称电场;监测系统可对土壤温度进行实时监测.

图 1 试验装置示意图 Fig. 1 Schematic of the experimental set-up

试验共设4组不同的处理, 分别为BIO-EK、EK、BIO及CK.其中, BIO-EK为电动-生物联合修复, EK为电动修复, BIO为生物修复, CK为空白对照(既不施加电场也不添加石油降解菌).BIO-EK和EK均施加1.0 V · cm-1的直流电场, 电极极性每5 min切换一次, 每10 min进行行/列转换.BIO-EK和BIO中将已培养好的降解菌与污染土壤均匀混合, 使微生物数量达到约1.0×106 CFU · g-1.用蒸馏水均匀喷洒土壤并不断翻动搅拌, 使土壤的湿度达到16%~19%(质量比).将土壤分层铺放在土壤室内并压实, 每个土壤室中约100 kg.每10 d采样进行分析, 采样点根据电场强度分布(图 2), 试验共进行100 d.试验过程中, 定期向土壤箱中喷洒蒸馏水以保持土壤湿度.

图 2 采样点分布等高线图(●电极;a.电极处;c.两电极中间;e.对角线中心) Fig. 2 Contour plots signifying the distribution of sampling positions
2.3 分析方法 2.3.1 土壤理化性质的测定

土壤理化性质的测定参照《土壤农业化学分析方法》(鲁如坤, 2000).土水比为1 : 2.5(m/V, g · mL-1), 用pH计对pH进行测定;土壤有机碳含量的测定采用K2Cr2O7氧化-容量法;土壤速效氮含量的测定采用碱解扩散法;土壤速效磷含量的测定采用Olsen法;土壤阳离子交换量的测定采用乙酸铵法.

2.3.2 微生物群落分析

微生物群落采用PCR-DGGE法进行分析, 土壤基因组DNA采用快速提取试剂盒提取(MP Biomedicals, LCC., Ohio, USA), 16S rRNA采用PCR仪(MJ Research Inc., Waltham, MA, USA)扩增后用于后续的DGGE分析, 所用引物为GC-341F(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGC AG-3′)及907R(5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′).采用Dcode基因突变检测系统(Bio-Rad)对PCR反应产物进行分析, DGGE电泳所用胶浓度为6%聚丙烯酰胺, 变性剂梯度为40%~60%, 60 ℃、70 V条件下运行16 h, 电泳完成后用0.01% Genefinder染色45 min, 在紫外灯下将凝胶中较亮的条带用洁净的刀片切下;将目的条带置于1 mL灭菌的超纯水中清洗后再放入30 μL TE缓冲液中, 4 ℃放置过夜;以DNA浸出液为模板按照上述同样的方法进行PCR扩增.扩增产物再用DGGE电泳确认所回收条带的正确位置, 然后进行PCR扩增纯化后, 交由测序公司进行测序, 序列信息输入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行BLAST分析.用凝胶成像系统捕获凝胶数字图象, 并用图形分析软件Quantity One 4.4.0进行图像分析, 各泳道图谱的相似性通过计算Dice系数进行比较, 聚类树状图用非加权配对算术平均法(UPGMA)生成.泳道光密度曲线上的峰面积代表条带密度, 每个条带密度所占比例用来比较各种群丰度.采用香侬指数H′来表示微生物多样性:

(1)

式中, Pi为DGGE图谱中第i条带的峰密度与所有条带(S)总峰密度的比值.

2.3.3 微生物数量分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法对土壤中总细菌数量进行测定.将已测知浓度的质粒DNA进行10倍梯度稀释, 以此为模板采用ABI Prism 7000实时荧光检测系统(Applied Biosystems, USA)进行PCR扩增, 所用酶为SYBR Premix Ex Taq II (2×), 所用染料为ROX Reference Dye (50×) (TaKaRa, China).以模板起始拷贝数的对数为横坐标, 以PCR过程中每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数Ct为纵坐标绘制细菌丰度的标准曲线.所用引物为8F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′), 扩增程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性15 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 40个循环;72 ℃延伸5 min.将从污染土样中提取的基因组DNA进行扩增, 将Ct值代入标准曲线方程, 计算得到土样中微生物基因拷贝数.

2.3.4 土壤中正十六烷、环十二烷及芘含量的测定

将土样风干后研磨, 过40目筛, 称取10 g于250 mL磨口三角瓶中, 加入30 mL二氯甲烷和丙酮混合溶剂(1 : 1, 体积比), 170 r · min-1振荡提取30 min后再超声萃取10 min, 将提取液转入50 mL离心管中, 8000 r · min-1低温离心2 min, 收集上清液, 沉淀物再用30 mL二氯甲烷和丙酮混合溶剂以同样的方法提取3次, 合并提取液.将提取液用旋转蒸发仪浓缩至干, 用正己烷溶解并定容至5 mL, 用0.22 μm有机滤膜过滤后, 采用气相色谱法测定正十六烷、环十二烷和芘的含量, 其定量采用外标法.

工作条件和升温程序为:初始温度80 ℃, 保持1 min, 再以20 ℃ · min-1升至300 ℃, 保持5 min;进样口温度为250 ℃, 检测器温度为300 ℃;所用检测器为氢火焰离子检测器;色谱柱为非极性毛细管柱(TR-1 MS, 30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气为99.99%高纯氮, 流量1.0 mL · min-1;不分流进样, 进样量为1 μL.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 土壤pH、温度变化

对土壤pH的测定结果表明, 在试验过程中, 土壤pH在一定范围(6.85~7.02) 内保持稳定, 同时在BIO-EK和EK试验中, 各采样点pH之间也没有明显差异(p>0.05)(图 3).在电动修复过程中会发生电极反应, 阳极产生的H+使阳极区呈现酸性, 阴极产生的OH-使阴极区呈现碱性, 同时带正电的H+向阴极运动, 带负电的OH-向阳极运动, 分别形成酸性迁移带和碱性迁移带(Azzam et al., 2001).而在常规的电动修复基础上周期性切换电场极性, 能够避免土壤pH值发生急剧变化(Luo et al., 2006).本研究中采用二维对称电场, 可对电极极性周期性切换, 还可将电极极性以行/列转换的形式进行旋转切换, 有效地消除了土壤pH的大幅变化.

图 3 土壤pH的变化(数据为3次重复的平均值) Fig. 3 pH changes in soil (data are averages from triplicate tests)

对土壤温度的监测结果表明, 与未施加电场的BIO与CK相比, 施加电场后的BIO-EK和EK处理土壤温度并未发生明显变化(数据未列出).在电动处理过程中, 部分电能可转化为焦耳热, 从而引起土壤温度升高(Baraud et al., 1999).而本研究中, 所采用的电流密度较小, 因此, 在实验过程中并未观察到热效应.

3.2 微生物群落变化

选取BIO-EK和BIO中不同时间(0、10、30、50、70和100 d)a点、c点和e点(从图 2所示的所有位点进行采样, 将相同位置的土样混匀, 分别形成a点、c点和e点的混合土样)土样进行微生物群落分析.微生物群落变化如图 4a所示, 共切取了7个条带进行测序, 每条序列与基因库中细菌基因序列相似度均在98%以上(表 1).Massilia sp.(条带1) 出现在10 d后, Phenylobacterium muchangponense(条带2) 的丰度在70 d后明显增大, Limnobacter sp.(条带3) 和Bacillus acidiceler(条带7) 随处理时间逐渐降低, Uncultured Gemmatimonadetes bacterium(条带4) 和Pseudoxanthomonas spadix(条带5) 主要存在于50 d后c点和e点的土样中, Brevundimonas kwangchunensis(条带6) 存在于所有土样中.Massilia sp.对多环芳烃有良好的降解作用, 研究表明, 菲可通过被动跨膜运输进入微生物细胞内(Gu et al., 2016), 在对污染土壤的处理过程中, 对多环芳烃污染物降解的需要可能诱使了该菌的产生.从石油污染土壤中往往可获得Phenylobacterium sp.、Bacillus sp., 它们可以多种多环芳烃为碳源生长, 且Bacillus sp.在石油烃类污染物的降解过程中起着积极作用(Alkindi et al., 2016).Limnobacter sp.中含有多环芳烃降解基因簇, 其对多环芳烃的降解存在巨大潜力(Perezpantoja et al., 2012).Gemmatimonadetes sp.对干燥具有较高的耐受力, 其常被发现于低湿的土壤中 (Debruyn et al., 2011), 这对于场地土壤修复来说具有重要的意义.Pseudoxanthomonas sp.能产生一种生物表面活性剂—鼠李糖脂, 其对多种脂肪烃和芳香烃具有良好的乳化作用, 可促进脂肪烃和芳香烃类污染物的降解(Nayak, 2009; Klankeo et al., 2009).Brevundimonas sp.对脂肪烃和多环芳烃也具有良好的降解作用(Vázquez et al., 2013), 该菌存在于所有土样中, 表明其在不同污染物的降解过程中均起着重要作用.微生物群落会随着污染物组成成分的改变而发生变化(Viñas et al., 2005; Lors et al., 2010).随着试验的进行, 微生物群落结构发生了变化, 可能的原因是, 在对混合有机物处理的过程中, 各污染物组成比例发生了变化, 导致微生物群落结构发生了变化.不同污染物在降解过程中均会产生相应的中间产物, 也可能会诱发微生物群落的变化(卫昆等, 2016; 陈丽华等, 2016).

图 4 不同时间(0、10、30、50、70和100 d)和不同采样点(a、c和e点)土壤中微生物群落变化(a)及聚类分析(b) Fig. 4 Microbial community shifts (a) and cluster analysis (b) at different sampling times (0, 10, 30, 50, 70 and 100 d) and positions (a, c and e site)

表 1 DGGE电泳主要条带测序结果 Table 1 Sequences of predominant bands in DGGE gels

通过计算香侬指数H′分析了微生物多样性的变化情况, 10 d后, 土样中微生物多样性明显升高, 可能的原因是微生物混合菌与营养物的投加使得土壤微生物多样性上升.100 d时, 多样性有所降低, 但仍高于或等于初始土样中的多样性, 说明在试验过程中, 土壤环境适宜微生物的生长, 使土壤微生物多样性保持良好.

根据聚类分析图(图 4b), 微生物群落主要随时间变化, 而随空间的变化较小.在诸多的影响因素中, pH是影响土壤微生物的主要因素, 可影响微生物的活性、数量、细胞膜的完整性及对污染物的生物可利用性(Aciego Pietri et al., 2009).电动处理土壤中, 电极周围由于电解作用产生的极端pH会使微生物群落结构发生改变(Lear et al., 2004; Wick et al., 2010).本研究中, 二维电场的使用消除了土壤中极端pH的产生, 因此, 微生物群落结构并未发生明显的空间上的变化.

3.3 微生物数量的变化

通过测定BIO-EK和BIO处理土壤中总微生物16S rRNA基因拷贝数(G)的变化, 分析了微生物数量的变化, 结果如图 5所示.在整个过程中, 微生物数量呈先上升后下降的趋势, 与微生物多样性变化趋势一致.前期微生物数量逐渐上升, 至30 d时达到最大值, 而后则呈逐渐下降的趋势, a点、c点和e点之间微生物数量没有显著性差异(p>0.05).BIO-EK处理中微生物平均数量明显高于BIO处理(p < 0.01).

图 5 BIO-EK及BIO处理土壤中总微生物数变化(数据为3次重复的平均值) Fig. 5 Changes of total microbial numbers in the BIO-EK and BIO tests (data are averages from triplicate tests)

试验初期调整了土壤中C/N/P比例, 其符合微生物生长的需要, 故土壤中微生物数量迅速上升, 而后期随着营养物质的消耗, 加之C/N/P比例的失衡, 可能导致微生物数量下降.生长环境的压力, 如电场的施加, 可能导致微生物数量的减少, 但弱的电场条件对微生物的生长发育没有负面影响(Tiehm et al., 2009).微生物数量与其呼吸速率呈正相关, 当向土壤中施加电场时, 阳极附近由于水的电解作用所产生的氧气会促进微生物细胞的呼吸速率, 从而引起微生物数量的增加(Lear et al., 2004), 这可能是BIO-EK中微生物数量高于BIO中的一个原因.另外, 本研究中采用二维对称电场, 使得土壤中不同位点pH均一, 营养物质分散均匀, 而且电场方向的周期性改变驱使微生物在土壤中来回移动(Luo et al., 2005a), 故BIO-EK处理土壤中微生物数量在空间上没有明显的变化.

3.4 正十六烷、环十二烷和芘含量随时间的变化

不同修复过程中正十六烷、环十二烷和芘的含量随时间变化情况如图 6所示.经过100 d的修复, 除对照组外, 各处理方式下正十六烷、环十二烷和芘的浓度均有明显的降低.100 d后, BIO、EK及BIO-EK处理土壤中的正十六烷平均含量由初始的4744.54 mg · kg-1分别降至2802.46、3256.16和1169.59 mg · kg-1, 环十二烷平均含量由初始的947.22 mg · kg-1分别降至553.72、490.34和89.06 mg · kg-1, 芘则由48.81 mg · kg-1分别降至27.26、30.70和8.36 mg · kg-1.EK处理中, 在未添加降解菌的情况下, 正十六烷也发生了明显的降解, 说明正十六烷的去除在很大程度上也依赖于电化学氧化作用(Wang et al., 2016).BIO-EK对正十六烷、环十二烷和芘的处理效率均最高.有研究表明, 电场中正十六烷的降解按照单末端氧化的方式进行, 正十六烷分别在醇脱氢酶、醛脱氢酶和酸脱氢酶的作用下依次生成正十六醇、正十六醛和正十六酸, 生成的正十六酸通过β-氧化的过程被继续降解, 电场不仅可以促进正十六烷的单末端氧化, 还可促进正十六酸的β-氧化过程(Yuan et al., 2013).环十二烷在降解过程中脱氢后先后生成环十二醇和环十二酮, 再生成相应的十二元环内酯, 其在水解酶作用下迅速开环, 再经历两步脱氢后生成十二烷二酸, 接着进入β-氧化阶段, 电场不仅可以加速环十二酮的开环进程, 还可促进后续相应酸的β-氧化过程(Yuan et al., 2016).电场的施加所引起的氧化还原反应也会促使土壤中多环芳烃的去除(Xu et al., 2014).可见, BIO-EK中, 正十六烷、环十二烷和芘的去除一方面源于微生物的降解作用, 另一方面依赖于电化学氧化和电场的刺激作用, 因此, 相对于单独的BIO和单独的EK处理, BIO-EK对污染物的处理效率更高.

图 6 不同处理方式下正十六烷(a)、环十二烷(b)和芘(c)的残留量(数据为3次重复的平均值) Fig. 6 Concentrations variation of n-hexadecane (a), cyclododecane (b) and pyrene (c) during the treatments(Data are averages from triplicate tests)

在试验进行的前10 d, 各污染物降解速率最快, 后期则逐渐降低, 可能由于试验初期, 微生物混合菌与氮磷营养物的投加解决了土壤中营养缺乏与微生物活性低下的问题, 使土壤降解菌数量和污染物去除率迅速上升;另外, 可能由于试验初期土壤中积累的中间产物较少, 故污染物减少速率较大.后期随着营养物质的消耗, 使得微生物数量和活性降低, 并且随着中间产物的积累, 不但要进行原有烃类的转化, 还要进行中间产物的进一步氧化, 使得污染物减少速率降低(Chu et al., 2007).

3.5 正十六烷、环十二烷和芘去除率随空间的变化

图 7所示为100 d后正十六烷、环十二烷和芘的去除率的空间分布特征.BIO-EK及EK处理土壤中, 正十六烷、环十二烷和芘的降解速率与电场强度呈正相关, 相关系数(Pearson correlation coefficient)均在0.9以上(p < 0.05).最大去除率均发生在场强最大的电极附近, 且去除率随电场强度的减弱而逐渐降低, 对角线中心去除率则最小.已有研究表明, 电场强度越大, 污染物与微生物之间的传质作用越强, 污染物去除率越高(Luo et al., 2005b; Fan et al., 2007).另外, 电极附近所发生的电化学反应较为剧烈, 这也是导致电极附近污染物去除率较高的一个原因(Jin et al., 2010).

图 7 BIO-EK及EK中正十六烷(a, d)、环十二烷(b, e)和芘(c, f)的去除率随电场强度变化等高线图(●电极;图中数据表示去除率, 为百分数) Fig. 7 Contour plots signifying the distribution of the degradation extentsof n-hexadecane(a, d), cyclododecane(b, e) and pyrene(c, f) within the BIO-EK) and EK chambers as a function of electric intensity
4 结论(Conclusions)

在二维对称电场处理过程中, 土壤pH和温度在时间和空间上均没有发生明显的变化, 微生物群落结构和数量主要随处理时间而变化, 空间上未发生明显的变化, 表明二维对称电场有助于维持微生物群落分布的均匀性.因此, 在二维电场中, 不同污染物去除率与电场强度呈正相关, 可能是由电极附近较强的电化学反应和污染物与微生物之间较强的传质作用引起.不同处理中, 正十六烷、环十二烷和芘均得到了不同程度的去除, 而相对于单独的BIO和单独的EK处理, BIO-EK对污染物去除效率最高, 原因为BIO-EK中, 正十六烷、环十二烷和芘的去除一方面源于微生物的降解作用, 另一方面依赖于电化学氧化和电场的刺激作用.

参考文献
Acar Y. 1993. Principles of electrokinetic remediation[J]. Environmental Science and Technology, 27(13): 2638–2647. DOI:10.1021/es00049a002
Aciego Pietri J C, Brookes P C. 2009. Substrate inputs and pH as factors controlling microbial biomass, activity and community structure in an arable soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 41(7): 1396–1405. DOI:10.1016/j.soilbio.2009.03.017
Alkindi S, Rmm A. 2016. Effect of biostimulation using sewage sludge, soybean meal, and wheat straw on oil degradation and bacterial community composition in a contaminated desert soil[J]. Frontiers in Microbiology, 7(2836): 240.
Azzam R, Oey W. 2001. The utilization of electrokinetics in geotechnical and environmental engineering[J]. Transport in Porous Media, 42(3): 293–314. DOI:10.1023/A:1006753622691
Baraud F, Tellier S, Astruc M. 1999. Temperature effect on ionic transport during soil electrokinetic treatment at constant pH[J]. Journal of Hazardous Materials, 64(3): 263–281. DOI:10.1016/S0304-3894(98)00190-3
Chu H, Lin X, Fujii T, et al. 2007. Soil microbial biomass, dehydrogenase activity, bacterial community structure in response to long-term fertilizer management[J]. Soil Biology and Biochemistry, 39(11): 2971–2976. DOI:10.1016/j.soilbio.2007.05.031
陈丽华, 孙万虹, 李海玲, 等. 2016. 石油降解菌对石油烃中不同组分的降解及演化特征研究[J]. 环境科学学报, 2016, 36(1): 124–133.
Debruyn J M, Nixon L T, Fawaz M N. 2011. Global biogeography and quantitative seasonal dynamics of Gemmatimonadetes in soil[J]. Applied and Environmental Microbiology, 77(17): 6295–6300. DOI:10.1128/AEM.05005-11
Fan R, Guo S, Li T, et al. 2015. Contributions of electrokinetics and bioremediation in the treatment of different petroleum components[J]. Clean-Soil, Air, Water, 43(2): 251–259. DOI:10.1002/clen.v43.2
Fan X, Wang H, Luo Q, et al. 2007. The use of 2D non-uniform electric field to enhance in situ bioremediation of 2, 4-dichlorophenol-contaminated soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 148(1/2): 29–37.
Gomes H I, Dias Ferreira C, Ribeiro A B. 2012. Electrokinetic remediation of organochlorines in soil:Enhancement techniques and integration with other remediation technologies[J]. Chemosphere, 87(10): 1077–1090. DOI:10.1016/j.chemosphere.2012.02.037
Gu H, Lou J, Wang H, et al. 2016. Biodegradation, biosorption of phenanthrene and its trans-membrane transport by Massilia sp.WF1 and Phanerochaete chrysosporium[J]. Frontiers in Microbiology, 7(38): 1–12.
Guo S, Fan R, Li T, et al. 2014. Synergistic effects of bioremediation and electrokinetics in the remediation of petroleum-contaminated soil[J]. Chemosphere, 109: 226–233. DOI:10.1016/j.chemosphere.2014.02.007
Harbottle M J, Lear G, Sills G C, et al. 2009. Enhanced biodegradation of pentachlorophenol in unsaturated soil using reversed field electrokinetics[J]. Journal of Environmental Management, 90(5): 1893–1900. DOI:10.1016/j.jenvman.2008.12.012
Huang D, Guo S, Li T, et al. 2013. Coupling interactions between electrokinetics and bioremediation for pyrene removal from soil under polarity reversal conditions[J]. Clean-Soil, Air, Water, 41(4): 383–389. DOI:10.1002/clen.v41.4
Jin S, Fallgren P H. 2010. Electrically induced reduction of trichloroethene in clay[J]. Journal of Hazardous Materials, 173(1): 200–204.
Kim S H, Han H Y, Lee Y J, et al. 2010. Effect of electrokinetic remediation on indigenous microbial activity and community within diesel contaminated soil[J]. Science of the Total Environment, 408(16): 3162–3168. DOI:10.1016/j.scitotenv.2010.03.038
Klankeo P, Nopcharoenkul W, Pinyakong O. 2009. Two novel pyrene-degrading Diaphorobacter sp.and Pseudoxanthomonas sp.isolated from soil[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 108(6): 488–495.
Lear G, Harbottle M J, Sills G, et al. 2007. Impact of electrokinetic remediation on microbial communities within PCP contaminated soil[J]. Environmental Pollution, 146(1): 139–146. DOI:10.1016/j.envpol.2006.06.037
Lear G, Harbottle M J, van der Gast C J, et al. 2004. The effect of electrokinetics on soil microbial communities[J]. Soil Biology and Biochemistry, 36(11): 1751–1760. DOI:10.1016/j.soilbio.2004.04.032
Li F, Guo S, Hartog N. 2012. Electrokinetics-enhanced biodegradation of heavy polycyclic aromatic hydrocarbons in soil around iron and steel industries[J]. Electrochimica Acta, 85(15): 228–234.
Lladó S, Covino S, Solanas A, et al. 2013. Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 248: 407–414.
Lors C, Ryngaert A, Périé F, et al. 2010. Evolution of bacterial community during bioremediation of PAHs in a coal tar contaminated soil[J]. Chemosphere, 81(10): 1263–1271. DOI:10.1016/j.chemosphere.2010.09.021
Luo Q, Zhang X, Wang H, et al. 2005a. Mobilization of phenol and dichlorophenol in unsaturated soils by non-uniform electrokinetics[J]. Chemosphere, 59(9): 1289–1298. DOI:10.1016/j.chemosphere.2004.11.043
Luo Q, Zhang X, Wang H, et al. 2005b. The use of non-uniform electrokinetics to enhance in situ bioremediation of phenol-contaminated soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 121(1/3): 187–194.
Luo Q S, Wang H, Zhang X H, et al. 2006. In situ bioelectrokinetic remediation of phenol-contaminated soil by use of an electrode matrix and a rotational operation mode[J]. Chemosphere, 64(3): 415–422. DOI:10.1016/j.chemosphere.2005.11.064
李凤梅, 郭书海, 张灿灿, 等. 2016. 多环芳烃降解菌的筛选及其在焦化场地污染土壤修复中的应用[J]. 环境污染与防治, 2016, 38(4): 1–5.
李婷婷, 郭书海, 王加宁, 等. 2016. 周期切换电极极性对电动-微生物修复石油污染土壤的影响[J]. 环境工程, 2016, 34(1): 159–163.
鲁如坤. 2000. 土壤农业化学分析方法[M]. 北京: 中国农业科技出版社.
Moliterni E, Rodriguez L, Fernández F J, et al. 2012. Feasibility of different bioremediation strategies for treatment of clayey and silty soils recently polluted with diesel hydrocarbons[J]. Water, Air, & Soil Pollution, 223(5): 2473–2482.
Nayak A S. 2009. Characterization of biosurfactant produced by Pseudoxanthomonas sp.PNK-04 and its application in bioremediation[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 63(1): 73–79.
Perezpantoja D, Donoso R, Agullo L, et al. 2012. Genomic analysis of the potential for aromatic compounds biodegradation in Burkholderiales[J]. Environmental Microbiology, 14(5): 1091–1117. DOI:10.1111/emi.2012.14.issue-5
Probstein R F, Hicks R E. 1993. Removal of contaminants from soils by electric fields[J]. Science, 260(5107): 498–503. DOI:10.1126/science.260.5107.498
Sarkar D, Ferguson M, Datta R, et al. 2005. Bioremediation of petroleum hydrocarbons in contaminated soils:Comparison of biosolids addition, carbon supplementation, and monitored natural attenuation[J]. Environmental Pollution, 136(1): 187–195. DOI:10.1016/j.envpol.2004.09.025
Tiehm A, Lohner S T, Augenstein T. 2009. Effects of direct electric current and electrode reactions on vinyl chloride degrading microorganisms[J]. Electrochimica Acta, 54(12): 3453–3459. DOI:10.1016/j.electacta.2009.01.002
Vázquez S, Nogales B, Ruberto L, et al. 2013. Characterization of bacterial consortia from diesel-contaminated Antarctic soils:Towards the design of tailored formulas for bioaugmentation[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 77(1): 22–30.
Viñas M, Sabaté J, Espuny M J, et al. 2005. Bacterial community dynamics and polycyclic aromatic hydrocarbon degradation during bioremediation of heavily creosote-contaminated soil[J]. Applied and Environmental Microbiology, 71(11): 7008–7018. DOI:10.1128/AEM.71.11.7008-7018.2005
Wang S, Guo S, Li F, et al. 2016. Effect of alternating bioremediation and electrokinetics on the remediation of n-hexadecane-contaminated soil[J]. Scientific Reports, 6: 1–13. DOI:10.1038/s41598-016-0001-8
Wick L, Shi L, Harms H. 2007. Electro-bioremediation of hydrophobic organic soil-contaminants:A review of fundamental interactions[J]. Electrochimica Acta, 52(10): 3441–3448. DOI:10.1016/j.electacta.2006.03.117
Wick L Y, Buchholz F, Fetzer I, et al. 2010. Responses of soil microbial communities to weak electric fields[J]. Science of the Total Environment, 408(20): 4886–4893. DOI:10.1016/j.scitotenv.2010.06.048
Wick L Y, Mattle P A, Wattiau P, et al. 2004. Electrokinetic transport of PAH-degrading bacteria in model aquifers and soil[J]. Environmental Science and Technology, 38(17): 4596–4602. DOI:10.1021/es0354420
卫昆, 陈烁娜, 尹华, 等. 2016. 蜡状芽胞杆菌对芘的降解特性及降解酶研究[J]. 环境科学学报, 2016, 36(2): 506–512.
魏巍, 李凤梅, 杨雪莲, 等. 2015. 电动修复过程中电压对土壤中芘降解及微生物群落的影响[J]. 生态学杂志, 2015, 34(5): 1382–1388.
Xu S, Guo S, Wu B, et al. 2014. An assessment of the effectiveness and impact of electrokinetic remediation for pyrene-contaminated soil[J]. Journal of Environmental Sciences, 26(11): 2290–2297. DOI:10.1016/j.jes.2014.09.014
Yuan Y, Guo S, Li F, et al. 2016. Coupling electrokinetics with microbial biodegradation enhances the removal of cycloparaffinic hydrocarbons in soils[J]. Journal of Hazardous Materials, 320: 591–601. DOI:10.1016/j.jhazmat.2016.07.043
Yuan Y, Guo S H, Li F M, et al. 2013. Effect of an electric field on n-hexadecane microbial degradation in contaminated soil[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 77: 78–84.
张灿灿, 郭书海, 李婷婷, 等. 2014. 焦化厂高环PAHs污染土壤的电动-微生物修复[J]. 环境工程, 2014, 32(7): 150–154.
赵庆节, 沈根祥, 罗启仕, 等. 2009. 土壤电动修复中电极切换对土壤微生物群落的影响[J]. 农业环境科学学报, 2009, 28(5): 937–940.