1 引言(Introduction)

重金属镉具有潜伏期长、毒性高、难降解等特点(李婧等, 2015), 在20种严重威胁人体健康的元素中排名第7位, 是一种强致癌的重金属元素(Kumari et al., 2014; Mehta et al., 2016).在我国, 大量含镉工业"三废"的排放已导致严重的环境污染问题.我国部分地区的可耕地土壤镉污染物点位超标率达到7.0%(王玉军等, 2014), 全国镉污染的土壤面积已达2×10⁵ km², 占总耕地面积的1/6(顾继光等, 2002; 王艳娜等, 2014; Mori et al., 2016).同时, 因利用含镉污水进行灌溉, 东北等地已形成了土壤镉含量严重超标的灌污区(文秋红等, 2005).目前, 镉污染的治理方法主要有客土法、物理和化学法、超富集植物技术和微生物修复技术.客土法往往投资巨大, 后续处理污染土壤难度较大(周国华等, 2002); 物理和化学法治理镉污染水体和土壤往往会造成二次污染, 对水体和土壤的原始结构也会造成破坏(周东美等, 2003); 植物修复法可较好地保持土壤肥力和原始结构, 但存在周期较长、收割不便的缺点(Yang et al., 2005).微生物修复技术可以较好地避免以上方法存在的问题, 利用部分微生物的生物成矿作用, 使重金属离子形成稳定的矿物固定下来, 是微生物修复技术的重要手段(罗辉等, 2015).其中, 利用微生物诱导碳酸盐沉积(MICP)技术固定重金属离子已成为当前研究的热点.

产脲酶微生物可分泌脲酶, 脲酶水解尿素会形成CO₃^2-和NH₄⁺, 同时使环境的pH明显升高(许凤琴等, 2015; Fawzy et al., 2016).在偏碱性的条件下, Cd²⁺可与CO₃^2-形成CdCO₃, 进而使游离态Cd²⁺以碳酸盐的形式结晶富集, 最终固定下来(王瑞兴等, 2007; Mugwar et al., 2016), 从而达到治理镉污染的目的.Li等(2014)从土壤中分离筛选出了一株高效产脲酶菌株, 培养48 h后, 该菌株成功诱导溶液中的Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等重金属离子形成碳酸盐沉淀, 重金属离子的固化去除率达88%~99%.许燕波等(2013)筛选出的产脲酶菌株, 通过形成碳酸盐沉淀, 对土壤中游离态Cd²⁺的去除率达51%, 对溶液中Sr²⁺的去除率达99%.Lin等(2016)分离出一种产脲酶的铜绿假单胞菌, 对镉含量为3 mg·kg^-1的污染土壤进行修复后, 该土壤所产糙米中镉含量降低了31.2%.Hu等(2014)筛选的产脲酶芽孢杆菌, 对镉浓度为2 g·L^-1溶液中Cd²⁺的去除率为98%.虽然国内外对MICP技术研究较多, 但目前的研究多数仍以筛选高效产脲酶菌株为主要研究目标, 对MICP技术的研究仍存在机理研究不足的问题.

因此, 本研究从土壤中分离出一株高效产脲酶菌株, 并测试该菌株诱导游离态Cd²⁺形成碳酸盐沉淀的能力, 同时分析产物的特性, 验证该菌株诱导Cd²⁺形成碳酸盐的机理, 以期为利用产脲酶菌治理含镉废水奠定技术基础.

2 材料及方法(Materials and methods) 2.1 实验材料

菌株来源:采集武汉理工大学花木种植园中深度5~20 cm处的土壤样本, 经富集培养(李萌等, 2013)后, 从富集培养液中分离具有产脲酶能力的菌株.分离菌株培养24 h后, 检测培养液的菌浓度(OD₆₀₀)和氨氮浓度, 选取产脲酶能力最强的菌株进行研究, 并参考王洋洋等(2013)的实验方法对该菌株的生理生化特征进行研究.

产脲酶菌株筛选分离培养基:蛋白胨1 g·L^-1, 氯化钠5 g·L^-1, 磷酸二氢钾2 g·L^-1, 尿素2 g·L^-1, 葡萄糖0.1 g·L^-1, 0.2%的酚红溶液4 mL·L^-1, pH=7.固体培养基添加20 g·L^-1的琼脂.其中, 尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌后, 加入灭菌后的培养基(李萌等, 2013).

产脲酶菌株生长培养基:蛋白胨1 g·L^-1, 氯化钠5 g·L^-1, 磷酸二氢钾2 g·L^-1, 尿素2 g·L^-1, 葡萄糖0.1 g·L^-1, pH=7.尿素和葡萄糖灭菌方式与产脲酶菌株筛选分离培养基相同.

LB培养基:蛋白胨10 g·L^-1, 酵母浸出粉5 g·L^-1, 氯化钠10 g·L^-1, pH=7.

2.2 实验方法 2.2.1 菌株培养

从保存产脲酶菌株的LB培养基斜面上挑取部分菌苔, 接种到150 mL的产脲酶菌株生长培养液中, 置于37 ℃、140 r·min^-1的恒温摇床中培养.使用分光光度法和HACH哈希2100P便携式浊度仪, 每2 h测量一次培养液的OD₆₀₀和浊度.同时, 每4 h测量一次培养液中尿素和氨氮浓度, 检测方法分别为对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法(苗晓杰等, 2011)和苯酚钠-次氯酸钠分光光度法(郭立新, 2007).使用CT-6021A笔式酸度计和TP320便携式电导率仪, 每2 h测一次培养液的pH和电导率.

2.2.2 固化实验

从保存产脲酶菌株的LB培养基斜面上挑取部分菌苔, 接种到150 mL灭菌后的产脲酶菌株生长培养液中, 培养液中补加0.1 g·L^-1 Cd²⁺, 置于37 ℃、140 r·min^-1的恒温摇床中培养.每12 h检测一次培养液的Cd²⁺浓度和OD₆₀₀, 其中, Cd²⁺浓度检测采用高连斌等(2006)的检测方法.培养结束后, 将溶液过滤, 截留的固化产物用蒸馏水洗涤3次, 置60 ℃干燥箱中干燥12 h后备用.

2.2.3 固化产物的检测

固化产物的形貌特征采用场发射扫描电子显微镜系统(SEM, JSM-IT300型)进行检测, 其结晶性分析采用X射线衍射仪(XRD, D8 Adwance型), 其红外分析采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR, Nicolet6-700型).

固化产物的耐酸性检测参考Li等(2013)的实验方法.依次配制pH为0.5~5.5的盐酸溶液, 从pH为5.5的盐酸溶液开始, 滴3~5滴盐酸溶液于固化产物上, 用放大镜仔细观察2 min, 若有固化产物上有气泡产生, 则其耐受的酸度就为所使用盐酸溶液的pH值的上一个梯度值; 若无气泡产生, 则使用下一个pH梯度的盐酸溶液继续滴定检测.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 菌株的产脲酶能力及其生理生化特性

将从土壤中分离出的4株菌接种到产脲酶生长培养液中, 培养24 h后分别检测4组培养液的氨氮浓度和OD₆₀₀, 结果如图 1所示.由图 1可知, 4株产脲酶菌中, 菌株UR-2所分泌的脲酶的活性最高, 24 h后该菌株的培养液中氨氮浓度达0.77 g·L^-1, 尿素的水解率达72.3%.同时, 菌株UR-2的培养液最终的OD₆₀₀为0.873, 菌浓度也较高.因此, 选用菌株UR-2作进一步的研究.

菌株UR-2的部分生理生化特性见表 1, 检测结果显示, 菌株UR-2为革兰氏阳性菌, 生长过程中可利用单糖果糖、葡萄糖和多糖淀粉作为碳源, 有一定的产酸能力.

3.2 产脲酶菌株的生长特性

产脲酶菌株UR-2的生长曲线见图 2.由图可知, 初始的0~8 h是菌株UR-2生长过程的迟缓期; 8 h后菌株已适应培养液环境, 生长进入对数期, 细菌繁殖量呈几何级数增长, 培养液的OD₆₀₀和浊度都急剧变大; 24 h后菌株生长到达稳定期, OD₆₀₀和浊度达到最大值, 代谢产物的积累开始影响菌株的生长; 40 h之后, 菌株开始出现衰亡, OD₆₀₀和浊度开始下降.

3.3 培养进程中尿素和NH₄⁺浓度的变化

产脲酶菌株分泌的脲酶可水解尿素, 产物为CO₃^2-和NH₄⁺, 通过检测培养进程中尿素和NH₄⁺的浓度, 可确定培养液中脲酶活性.菌株UR-2培养过程中, 培养液中尿素和NH₄⁺浓度的变化情况见图 3.从图 3中可以看出, 随培养时间的延长, 尿素在不断水解, 培养液中NH₄⁺浓度从最初的0.022 g·L^-1逐渐上升.特别是在8~24 h的菌株生长对数期, 尿素的水解速率和NH₄⁺的生成速率达到最大, 预示对数期菌株产脲酶速率达到最大.28 h时, 菌株生长处于稳定期, 尿素水解率为82%, 培养液中NH₄⁺浓度达到最大值, 为0.82 g·L^-1, 相应的CO₃^2-理论产量为1.45 g·L^-1, 可为碳酸盐的形成提供足够的CO₃^2-.

3.4 培养进程中pH和电导率的变化

图 4为菌株UR-2培养进程中pH和电导率变化曲线, 由于菌株分泌的脲酶大量水解尿素, 培养液的pH和电导率随培养时间延长不断上升.由图 4a可知, 在4~24 h, 培养液的pH上升最快, 从7.11迅速提高到9.07.此段时间菌株处于生长的对数期, 菌株生长繁殖迅速, 脲酶产率最高, 因而尿素的水解速率最快, 水解产物CO₃^2-的大量产生使培养液的pH迅速上升.随着培养液中营养物质的消耗和代谢产物的积累, 细菌进入衰亡期, 培养液的pH逐渐趋于稳定.pH是影响碳酸盐形成的重要条件, 碱性条件有利于碳酸盐的形成, 产脲酶菌株最终可使培养液pH增加到9.15, 可为碳酸盐的形成提供有利条件.在图 4b中, 培养液电导率也同样随细菌的生长而上升, 并最终趋于稳定.在8 h后培养液的电导率迅速增长, 20 h时达到31.45 mS·cm^-1, 之后电导率基本稳定.电导率的提高显示了培养液中离子数量的增加, 电导率在8~20 h快速上升也与该时段尿素大量水解的实验现象互相验证, 即尿素在脲酶催化下水解为CO₃^2-和NH₄⁺, 从而使培养液的电导率上升.

3.5 产脲酶菌株固化Cd²⁺的进程

菌株UR-2固化培养液中Cd²⁺的进程见图 5.由图 5可知, 细菌的生长是其固化Cd²⁺的前提条件, Cd²⁺的固化与菌株产酶密切相关.溶液中初始Cd²⁺浓度低于投加值, 可能是部分Cd²⁺与培养液中磷酸盐形成沉淀所致.前36 h内, 细菌生长繁殖迅速, 但脲酶产量较低, 尿素水解产物CO₃^2-较少, Cd²⁺的固化率较低, 仅为4.5%.36 h后, 细菌生长进入稳定期, 随着尿素水解量逐渐增大, 培养液中CO₃^2-浓度提高, 细菌对Cd²⁺固化率迅速增大, 72 h时固化率已达63.5%.72 h后, 随着细菌开始衰亡, 固化率逐渐趋于稳定, 最终细菌对0.1 g·L^-1的Cd²⁺固化率达70.5%, Cd²⁺浓度预示该菌株对镉污染水体具有修复治理潜能.

3.6 固化产物的XRD分析

在标准谱图中, CdCO₃晶体(JCPDS 85-0989) 的XRD特征峰2θ为23.6°、32.6°和50.1°, 三者分别对应的晶面为002、100和101.图 6为固化产物的XRD图谱, 从图 6中可以看出, 固化产物的2θ吸收峰的位置与标准谱图中基本相同, 证明固化产物为CdCO₃.同时, 吸收峰也比较尖锐, 证明固化产物较纯, CdCO₃的结晶度很好.这一测试结果与唐鹏飞等(2014)的结果一致, 验证了产脲酶菌株水解尿素生成的CO₃^2-与溶液中Cd²⁺反应形成CdCO₃沉淀的观点.

3.7 固化产物的SEM分析

图 7为成矿产物的SEM图, 从图中可以看出, 成矿产物CdCO₃是以球形颗粒的形式包裹在细菌细胞壁表面, 细菌间相互聚合形成了较大的聚合体.图 7a中, 聚合体整体的直径约为2~3 μm, 远大于一般细菌的粒径, 证明被CdCO₃颗粒包裹的细菌相互间通过CdCO₃颗粒桥接的形式, 形成了较大粒径的聚合体.在图 7b中可进一步看到, 聚合体表面较为粗糙, 细菌细胞壁上形成的CdCO₃颗粒多为球形, 相互之间团聚现象较为普遍, 球形的粒径分布不均匀, 从10 μm到100 μm不等.之所以形成这种结构, 可能是细菌表面不同位置的pH和CO₃^2-浓度不同, 细菌周围形成CdCO₃过饱和溶液的程度也不相同, 析出的CdCO₃晶体结合在细菌细胞壁上不同的结合位点, 相互之间出现团聚, 从而CdCO₃晶体颗粒的粒径分布也会不同, 最终形成了图 7b中所示的不同粒径球形CdCO₃颗粒结构.

这一实验现象与成亮等(2008)的实验结果一致.针对国内MICP技术机理研究较为薄弱的问题, 本研究在国内相关研究的基础上提出了溶液中MICP过程机理:碳酸盐固化菌株产生的脲酶水解溶液中的尿素, 增大了溶液pH, 使溶液中CO₃^2-浓度不断升高, 同时菌体细胞壁带负电荷, 可吸附重金属离子, 使细菌周围环境中的Cd²⁺浓度增加, 直至细菌周围形成过饱和溶液并结晶富集, 最终析出重金属碳酸盐晶体颗粒, 在细菌表面形成了CdCO₃晶体, 具体反应式如下所示:

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

3.8 固化产物的FTIR分析

图 8为产脲酶菌株和固化产物的FTIR测试结果.图中的主要吸收峰简介如下:在3200~3600 cm^-1处出现的较宽的吸收峰, 主要是由蛋白质中—NH₂和样品水分的—OH基团引起的; 1654 cm^-1处吸收峰主要来自蛋白酰胺Ⅰ带的C O基团的伸缩振动; 1540 cm^-1处的吸收峰由蛋白酰胺Ⅱ带的N—H键弯曲振动和C—N键伸缩振动引起; 1446 cm^-1处是蛋白质碳骨架中—CH₃的C—H键不对称变形振动峰和—CH₂的变形振动吸收峰; 1416 cm^-1处主要为甲基—CH₃的伸缩振动吸收峰; 1032 cm^-1处为碳酸根的对称伸缩振动吸收峰; 570 cm^-1处主要为金属离子与氧原子的共价键振动吸收峰.

未与Cd²⁺反应的产脲酶菌株的FTIR图谱见图 8中a谱图, 其各处吸收峰显示, 产脲酶菌株细胞中含有一定量的蛋白质、磷酸盐化合物等物质, 细菌的细胞膜等处也含有羰基、羧基、磷酸盐基团, 但吸收峰均较弱.由图 8中b谱图和a谱图对比可知, 固化产物与产脲酶菌株的FTIR图谱呈现出明显的差异性.与产脲酶菌株的FTIR图谱相比, 固化产物在570 cm^-1和1032 cm^-1处的吸收峰明显增强, 证明Cd—O基团与碳酸根的含量明显上升, 即固化产物中存在较多的CdCO₃, 验证了XRD图谱的结果.同时, 在1416、1440、1549、1650 cm^-1等处的吸收峰也明显增强, 证明细菌细胞壁和细胞膜上的蛋白质吸附络合了一定量的Cd²⁺, 蛋白酰胺Ⅰ带和Ⅱ带都与Cd²⁺进行了反应.在1271 cm^-1处也出现了吸收峰, 证明PO₄^3-可能也与Cd²⁺进行了反应, 从而使该处出现了吸收峰.红外图谱显示, 细菌细胞壁上的基团对Cd²⁺进行了吸附, 验证了本文提出的机理.

3.9 固化产物的耐酸性

固化产物CdCO₃是菱镉矿的主要组分, 是自然界中镉元素较为稳定的赋存状态.耐酸性检测结果显示, 固化产物能够耐受的pH为3.0.一般自然条件下产生的酸雨的pH为3.5~5.6(Li et al., 2014), 因此, 产脲酶菌株诱导Cd²⁺固化产物可耐受酸雨的腐蚀.

4 结论(Conclusions)

1) 本研究从土壤中分离纯化出一株高效产脲酶菌株, 培养44 h后, 该菌株对尿素的水解率达90.5%, 培养液中CO₃^2-的理论产量最高可达1.64 g·L^-1, 培养液pH最高达9.15, 可为Cd²⁺的碳酸盐固化提供有利条件.

2) 产脲酶菌株可成功诱导溶液中的Cd²⁺形成CdCO₃沉淀, 对0.1 g·L^-1的Cd²⁺固化去除率达70.5%.

3) XRD图谱和FTIR图谱显示, 固化产物为CdCO₃; SEM检测发现, 生成的CdCO₃颗粒粒径为10~100 μm, 主要以椭圆形颗粒包裹在细菌表面, 细菌间相互聚合形成了较大的聚合体; 固化产物可耐受的pH为3.5, 是一种较稳定的赋存状态.