1 引言(Introduction)

细颗粒物(PM_2.5)指的是空气动力学当量直径小于或等于2.5 μm的颗粒物, 也称为可入肺颗粒物.目前, 作为我国大多数城市空气污染的首要污染物, PM_2.5已经引起人们的普遍重视(陈诚, 2015).国内外一些流行病学研究表明, PM_2.5可随吸入的空气经由呼吸系统进入人体, 并引发一系列病理生理变化(李国星等, 2013; 陈仁杰等, 2013).研究表明, PM_2.5对大鼠肺、心、肝组织均有不同程度的氧化损伤, 对肺和肝脏有明显的毒性作用(孟紫强等, 2006).还会导致肝脏、脾脏等发生炎症反应(严超等, 2015).目前, 关于PM_2.5诱导机体损伤的机制主要是氧化应激效应和炎性反应(李译等, 2012; 卢秀玲等, 2011).

葡萄糖代谢是人体三大代谢之一, 葡萄糖代谢合成ATP是为机体提供能量的主要方式.另外, 肝脏是能量代谢的主要器官.通常情况下, ATP的合成主要有两条途径：① 葡萄糖分解成为丙酮酸后, 在有氧条件下丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环并通过线粒体氧化磷酸化作用氧化为CO₂和H₂O, 这一产能方式总共合成36 mol ATP; ② 在无氧条件下, 葡萄糖分解成2分子丙酮酸, 丙酮酸还原生成乳酸, 合成2 mol ATP完成葡萄糖代谢过程, 这一过程被称为糖酵解(张星华等, 2015; 洪丽萍, 2014).这两种途径是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖代谢产能过程(秦鹏钧等, 2015).有研究表明, 纳米银能够诱导非肿瘤细胞以及肿瘤细胞能量代谢向糖酵解转化(Chen et al., 2014).PM_2.5对大鼠染毒后, 测得大鼠的血清及肝脏中己糖激酶(hex~kinase, HK)、一丙酮酸激酶(pyruvatekinase, PK)及异柠檬酸脱氢酶(isoc mtedehydmgenase, IDH)活性均下降, 在一定程度上表明PM_2.5染毒可以对机体的糖代谢酶产生不利的影响(李峰等, 2014).但到目前为止, 关于PM_2.5对小鼠肝脏能量代谢的转化及其具体机制的研究仍不清楚.

2 材料和方法(Materials and methods) 2.1 实验材料和仪器

SPF级10月龄C57BL/6雌性小鼠, 购自南京君科生物工程有限公司; ATP检测试剂盒(Item Number S0026) 购自碧云天公司; 丙酮酸试剂盒(A081)、乳酸试剂盒(A 019-2) 及活性氧测试盒(Item Number E004) 购自南京建成生物工程研究所; 牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝(G-250) 购自Sigma公司; 高速低温离心机(Thermo Fisher Scientific, 美国); 低温冰箱(Thermo Fisher Scientific, 美国); 酶标仪(Thermo Fisher Scientific, 美国); PFKFB3、LDHB、PDHA1、CS以及FH的引物采用Primer Premier 5.0软件设计, 由Invitrogen公司合成; Trizo试剂购自日本Takara公司.琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度, Nanodrop 2000分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀, 确保比值为1.8~2.2.取1 μg总RNA, 采用PrimeSeript反转试剂盒(购自TaKaRa公司)合成cDNA, 合成后的cDNA产物于-80 ℃备用.使用Analytik Jena荧光定量PCR仪进行扩增.

2.2 PM_2.5的采集及其悬浊液的制备

用TH-150 CIII型智能中流量采样器采集太原市(112°57′E, 37°73′N)大气PM_2.5, 流量为100 L·min^-1, 每天采样22 h, 同时记录采样前后石英滤膜的重量.采集完成后, 将滤膜密封在铝箔中, 4 ℃储藏备用.实验前将载有颗粒物的滤膜剪成1 cm²的小块于烧杯中, 加入适量的超纯水置于超声振荡器上反复振荡3次, 每次20 min, 同时加冰以保证水温在20 ℃以下, 振荡结束后用6层纱布过滤, 收集滤液, 进行真空冷冻干燥, 收集PM_2.5.

2.3 实验动物及染毒处理

将10月龄C57BL/6雌性小鼠随机分为2组, 每组6只.两组均采用咽后壁滴注法, 将小鼠用异氟烷麻醉后置于一倾斜平台上, 轻轻将小鼠舌头拉起, 将PM_2.5悬液和生理盐水从舌根注入(Rao et al., 2003).其中处理组小鼠隔天滴注3 mg·kg^-1PM_2.5溶液, 对照组则给予0.9%的生理盐水, 总共滴注12次, 暴露时间为4周.

2.4 电镜

PM_2.5染毒结束之后, 处死小鼠, 取出约为1 cm³肝组织小块, 室温下, 用4%的甲醛和1%戊二醛在0.1 mol·L^-1的磷酸缓冲液(pH=7.4) 中固定2 h, 然后用2.5%的四氧化锇固定, 再在黑暗的室温条件下用2.5%的水铀酰乙酸处理1 h, 乙醇梯度脱水、渗透、树脂包埋, 超薄切片机切片、醋酸铀及枸缘酸铀双染色, JEM-1011型透射电镜80 kV的条件下观察拍片.

2.5 ATP、丙酮酸和乳酸的检测

根据碧云天公司ATP检测试剂盒S0026的操作过程, 按照每20 mg组织加入200 μL裂解液的比例加入裂解液, 然后用玻璃匀浆器或其它匀浆设备进行匀浆.充分匀浆可以确保组织被完全裂解.裂解后4 ℃12000 g离心5 min, 取上清, 在酶标仪上用于后续的测定.取部分上清用于考马斯亮蓝检测样品的蛋白含量.

根据南京建成生物工程研究所丙酮酸、乳酸检测试剂盒的操作过程, 按照每20 mg组织加入400 μL生理盐水的比例加入生理盐水, 然后用玻璃匀浆器或其它匀浆设备进行匀浆.充分匀浆可以确保组织被完全裂解.裂解后4 ℃12000 g离心5 min, 取上清, 在酶标仪上用于后续的测定.取部分上清用于考马斯亮蓝检测样品的蛋白含量.

2.6 实时荧光定量RT-PCR考察mRNA表达水平

将反转录的cDNA稀释5倍.PDHA1、CS、OGDH、FH以及PFKFB3和LDHB使用SYBR Premix法测定其mRNA水平, 引物序列见表 1.

SYBR Premix法：PCR反应总体积为20 μL, 其中包括1 μL cDNA, 10 μL SYBR Premix, 上、下游引物各1 μL, 7 μL超纯水, 置于qTOWER2.2(jena, 德国)PCR仪上进行反应.

反应条件为：95 ℃预变性3 min, 退火20 s, 72 ℃延伸20 s, 扩增45个循环.目的基因的表达用它与内参基因GAPDH的比值来定量.

2.7 ROS的检测

碧云天公司活性氧(ROS)测试剂盒的操作过程, 按照重量(g):体积(mL)=1:20的比例加入匀浆介质磷酸缓冲液, 冰水浴条件下机械匀浆或手动匀浆.1000 g离心10 min, 取上清在酶标仪上进行测试.取部分上清用于考马斯亮蓝检测样品的蛋白含量.

2.8 数据分析方法

用Origin 8.0统计软件对数据进行统计分析.用One-way ANOVA法检验处理组与对照组的差异显著性(*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001被认为是统计学显著).

3 结果(Results) 3.1 PM_2.5暴露4周后对小鼠肝脏线粒体超微结构的影响

本实验发现, 经3 mg·kg^-1 PM_2.5暴露4周后, 小鼠肝细胞线粒体对PM_2.5的毒性作用非常敏感, 线粒体嵴变短或消失, 线粒体膜轮廓变得弥散.

3.2 PM_2.5暴露4周后对ATP、乳酸和丙酮酸含量的影响

经3 mg·kg^-1 PM_2.5暴露4周后, 小鼠肝脏组织中ATP含量变化如图 2a所示, 暴露组ATP含量与对照组相比显著降低, 为对照组的(0.44±0.025) 倍(p < 0.05);乳酸和的丙酮酸含量变化如图 2 b和2 c所示, 乳酸明显升高, 是对照组的(1.82±0.28) 倍, 而丙酮酸也上调了(2.11±0.03) 倍, 都具有统计学意义(丙酮酸p < 0.001;乳酸p < 0.05).ATP含量的下降以及丙酮酸、乳酸含量的累积说明能量代谢过程中三羧酸循环受到抑制, 糖酵解方式增强, 以此为机体供能.为了验证这一猜想是否正确, 本实验进一步检测糖酵解以及三羧酸循环相关基因的表达情况.

3.3 PM_2.5暴露4周后对三羧酸循环(PDHA1、CS和FH)和糖酵解(PFKFB3和LDHB)相关基因表达的影响

如图 3所示, 经3 mg·kg^-1 PM_2.5暴露4周后, PM_2.5暴露能够抑制PDHA1、CS和FH的mRNA表达, 诱导PFKFB3和LDHB的表达上升, 与对照相比有统计学差异(p < 0.05).

3.4 PM_2.5暴露4周后对ROS的影响

我们考察了3 mg·kg^-1 PM_2.5暴露4周后, 小鼠肝脏组织中ROS含量的变化.如图 4所示, 暴露组ROS含量与对照组相比显著增多, 为对照组的(1.47±0.058) 倍, 统计学意义显著(p < 0.001).

4 讨论(Discussion)

肝脏是机体重要的器官之一, 具有代谢、合成、分泌和解毒等多种功能, 这些过程都需要线粒体的参与.肝细胞内丰富的线粒体是自由基作用的靶点, 自由基可以使线粒体膜流动性下降, 通透性增强(张莉等, 2016).研究发现, PM_2.5暴露之后, 小鼠肝脏组织线粒体超微结构改变, ATP的含量明显下降, 丙酮酸、乳酸、ROS的含量显著上升.众所周知, 线粒体通过有氧呼吸会产生大量的ATP, 而ATP的减少表明PM_2.5暴露可能会影响有氧呼吸进程.丙酮酸是三羧酸循环的中间产物、糖酵解途径的终产物, 或在细胞浆中转变成乳酸供能, 或进入线粒体内, 氧化脱羧生成乙酰辅酶A, 进入三羧酸循环被氧化成CO₂和H₂O, 释放能量(刘维维等, 2012; 张晨晨等, 2011).ATP含量的下降以及丙酮酸、乳酸含量的累积说明能量代谢过程中三羧酸循环受到抑制, 而糖酵解方式增强, 以此为机体供能.

为了进一步验证实验猜想, 本研究对三羧酸循环、糖酵解过程的相关基因进行了检测.丙酮酸脱氢酶(PDHA1) 是丙酮酸生成乙酰辅酶A和CO₂的关键酶, 而乙酰辅酶A是葡萄糖进入三羧酸循环有氧氧化的首要原料, 所以丙酮酸脱氢酶(PDHA1) 是糖酵解和三羧酸循环之间的主要纽带.此外, CS、FH均是参与三羧酸循环的主要调控酶(Fu et al., 2014;Epstein et al., 2001).PFKFB3是糖酵解过程的关键酶, PFKFB3的大量表达可以促进糖酵解的发生(Doddaballapur et al., 2015).乳酸脱氢酶(LDH)是一种含锌的糖酵解酶, 存在于机体所有组织细胞的胞质内, 研究表明, LDH是由A-亚基(LDHA)和B-亚基(LDHB)组成的四聚体, 后两者按不同比例组成5种同工酶(LDH).其为糖酵解关键酶, 可催化丙酮酸形成乳酸(Zha et al., 2011).本研究发现, PM_2.5的暴露显著上调PFKFB3和LDHB的表达、下调PDHA1、CS、FH表达.而且, 有研究发现, 纳米银能使HepG2细胞表现出增强糖酵解和降低三羧酸循环的功能(Doddaballapur et al., 2015;Mailloux et al., 2007;Trachootham et al., 2009; Valko et al., 2006).这些数据进一步表明, PM_2.5暴露会抑制三羧酸循环, 转而增强糖酵解方式为机体提供能量.

研究表明, 过量ROS引发线粒体功能障碍, 线粒体不仅是ROS的来源, 更是其作用靶点(Yu et al., 2012).线粒体以有氧氧化的方式提供能量的过程发生障碍时, 转而以无氧酵解方式为机体提供能量, 导致大量乳酸生成, 乳酸在细胞内的大量积累, 导致细胞中毒, 进而对线粒体膜产生不可逆损伤, 最终导致线粒体功能障碍(Yu et al., 2012).研究显示, ROS的产生与能量代谢之间存在一定的联系.ROS可能会通过抑制有氧代谢(三羧酸循环和氧化磷酸化)和提高无氧糖酵解来诱发能量代谢的紊乱(Doddaballapur et al., 2015;Mailloux et al., 2007;Trachootham et al., 2009; Valko et al., 2006).一方面, 一些化合物暴露诱导ROS产生, 从而抑制一些主要的三羧酸循环的酶的活性, 包括PDHA1、CS和FH; 另一方面, ROS会促进糖酵解的发生, 进而释放更多的电子产生更多的ROS(Chen et al., 2014;Doddaballapur et al., 2015;Mailloux et al., 2007;Trachootham et al., 2009; Valko et al., 2006).因此, 本研究推测, PM_2.5暴露可能是通过ROS的产生来抑制三羧酸循环, 增强糖酵解方式为机体提供能量, 导致线粒体功能障碍.

5 结论(Conclusions)

PM_2.5暴露可造成小鼠肝脏ATP含量下降, 丙酮酸、乳酸含量积累, 同时显著诱导PFKFB3和LDHB的表达、抑制PDHA1、CS、FH表达, 而ROS含量升高可能是导致能量代谢异常的主要机制.这表明PM_2.5暴露能引发氧化应激, 从而抑制三羧酸循环, 增强糖酵解方式为机体提供能量, 导致线粒体功能障碍.