2017, Vol. 37
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2. 浙江工商大学食品与生物工程学院, 杭州 310035
2. School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035
近年来随着我国畜禽养殖业的迅猛发展, 猪粪便成为了导致土壤、地表水、地下水及农业灌溉水污染的重要来源(Mclellan et al., 2014).有研究指出猪粪便不仅含有氮、磷等导致水体富营养化的物质, 而且含有大量的人体病原菌如甲肝病毒、弧菌属(Vibriospp.)、沙门氏菌属(Salmonellaspp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter), 寄生性原生虫等, 严重威胁公共健康及水产养殖业的发展(Fu et al., 2013; Fratamico et al., 2004), 只有准确区分和识别污染来源, 才是制定出有效的管理方案解决污染物的潜在危机的关键所在.因此, 建立一种灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的检测方法显得尤为迫切.
很多非点源溯源研究都是从宿主肠道中厌氧菌群如拟杆菌群(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Frimicutes)、双歧杆菌属(Bifidobacteriaspp.)、史氏产甲烷杆菌(Methanobrevibactersmithii)等的相关基因(16S rRNA、毒基因等)中筛选基因片段作为特异性标记分子从而设计实验来判别污染来源.目前与猪粪便有关的PCR方法大多基于猪肠道优势菌拟杆菌16S rRNA的保守区设计的(Mieszkin et al., 2009; Okabe et al., 2007; Dick et al., 2005), 也有基于史氏产甲烷杆菌中筛选特异性基因mcrA(Harwood et al., 2013; Ufnar et al., 2007)、大肠埃希菌中筛选STII毒基因(Khatib et al., 2003)及猪肠道腺病毒基因(Hundesa et al., 2009)设计来判断猪粪便污染来源.然而, 尽管上述基因作为特异性分子标记具有一定的特异性和灵敏性, 但没有一种能够充分精确地指示粪便源的存在.
有科学家认为在宿主和肠道微生物长期共同进化过程中会形成一些对宿主有利的功能保留区(互作靶点), 这些互作靶点是形成肠道微生物多样性及特异性的重要因素(Witty et al., 2009; Qin et al., 2010).因此越来越多的研究从参与宿主-微生物互作的功能基因, 如微生物细胞表面蛋白基因, 细胞加工及代谢相关基因(Hagedorn et al., 2011; Xu et al., 2013; Lu et al., 2007)中筛选特异性分子标记.且已有研究从人、牛、鸡等宿主-肠道微生物互作基因中筛选出宿主特异性分子标记并用作水体非点源污染的微生物示踪, 所获得的宿主特异性分子标记具有很高的特异性、灵敏性等特点(Mclellan et al., 2014; Shanks et al., 2006; Lu et al., 2007), 预示着参与互作的功能基因在微生物示踪中的有效性及可应用性.然而, 目前尚未见以宿主-微生物互作基因作为特异性分子标记进行水体或食品中猪粪便非点源污染示踪的相关研究.鉴于此, 本研究首次采用竞争性杂交基因片段富集方法(Genome Fragment Enrichment, GFE)富集猪粪便特异性宏基因组, 构建宏基因文库, 对文库进行序列菌群分类及功能预测分析, 靶向筛选宿主(猪)-微生物互作靶点并将其作为猪粪便特异性分子标记, 并以此为基础建立PCR检测方法, 从而对猪粪便污染来源进行微生物示踪.
2 材料与方法(Samples and analysis) 2.1 样品的采集及处理从长江三角洲不同地区的8个规模养猪场及其它主要10个畜禽养殖场(牛、羊、鸡、鸭、鹅)采集新鲜动物粪便样品.其中在GFE过程中所用猪粪便(n=34) 及由其他动物粪便组成的混合对照组粪便：牛(n=20)、羊(n=18)、鸡(n=7)、鸭(n=20)、鹅(n=5).另外灵敏性及特异性评价过程中采用在异于GFE中的其他畜禽养殖场所采集单个物种的粪便样：猪(n=30)、猪粪废水样(n=8)、牛(n=10)、羊(n=20)、鸡(n=8)、鸭(n=20)、鹅(n=5).将上述所采集的新鲜粪便样品置于无菌容器中, 每200 mg(湿重)样品中加入3 mL GITC缓冲液(5 mol·L-1异硫氰酸胍、100 mmol·L-1 EDTA(pH 8.0)、0.5%十二烷基肌氨酸钠), 低温保存.
在浙江省内8个不同地区随机共采集36个水样.采集水样所在水域在一定程度上与人类娱乐活动存在关联, 例如游泳、划船及垂钓等, 另外该水域与规模化畜禽养殖场直接或间接接触.所采集水样(100 mL)置于无菌塑料品中并用孔径为0.45 μm的聚碳酸酯膜(CN-6 Metricel® Grid 47 mm, life Science)过滤, 过滤后的膜放置在无菌容器中, 低温保存.
粪样DNA的提取按QIAamp® Fast DNA Stool Kit(Qiagen, Valencia, CA)说明书进行.并在紫外分光光度计NanoDrop ND-2000UV上测定其浓度和纯度(NanoDrop Technologies, Thermofisher).
2.2 猪粪便特异性基因组富集采用竞争性杂交方法富集猪粪便特异性基因组(Shanks et al., 2006).如图 1所示, 将34个猪源粪便基因组DNA等量混合形成基因组混合库, 作为富集组.以牛、羊和鸡等粪便基因组混合库作为对照组.将2组DNA分别声波震荡至150~1000 bp大小的随机片段.将待富集组又分为2个组(待富集组A和B), A组按照50 Unit Klenow Ⅰ聚合酶(New England BioLabs, Ipswich, MA)说明书在各片段两平末端各加一段随机引物序列K9-DNA(表 1), B组片段加生物素(PAB, Sigma-Aldrich, Atlanta, GA)标记；将待富集组A、B和对照组分别进行变性、竞争性杂交后, 形成各种组合的DNA双链, 其中待富集组的DNA小片段单链保守区也可能与对照组的保守区结合形成杂交双链.经生物素-链亲和素酶联免疫吸附捕获试验, 可将标记有生物素的杂交双链DNA(即至少含一条待富集组单链的双链DNA)捕获.利用K9-PCR引物扩增所有捕获的杂交双链DNA.富集过程为3轮, 每一轮的PCR产物都克隆至载体pCRTOPO 4.0(Invitrogen)构建猪粪便特异性文库.最终将获得高丰度的猪源特异性粪样基因组DNA样品.从含有氨苄青霉素的LB肉汤培养基中随机挑取重组菌, 并用通用引物M13(表 1)鉴定, 阳性克隆送至上海生工进行测序.以对照组动物粪便混合DNA作为探针通过斑点杂交对每轮富集片段进行猪粪便特异性验证(Shanks et al., 2006).
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| 图 1 宿主(猪)粪便特异性基因组富集流程 Fig. 1 Schematic representation of the DNA enrichment method used to select swine fecal community DNA sequences |
| 表 1 引物序列表 Table 1 Primer sequences used in test |
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序列拼接采用SeqMan Ⅱ(DNAstar)软件进行, 并将冗余序列去除.在GeneBank数据库中利用BLASTx比对分析, 根据相似序列的生物功能对每条非冗余序列进行蛋白质功能预测, 其中E值≤10-3, 识别率≥30%的序列被认为是相似蛋白(Breitbart et al., 2003; Lu et al., 2007).通过蛋白相邻类聚簇(COG)数据库将所得DNA序列进行功能基因分类(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG).根据在GeneBank数据库BLASTx比对的结果(最小E值)对富集的非冗余序列进行菌群分类.
2.3 引物设计及PCR验证针对富集的猪粪便特异性片段设计引物并由TaKaRa生物公司合成.以GFE中各物种单独的混合粪便DNA为验证模版, 筛选出可特异性扩增检测猪粪便DNA的引物(表 1).
2.4 特异性PCR实验条件的优化以包含猪粪便特异性片段的重组质粒为DNA阳性对照, 对引物浓度(0.2~0.5 μmol·L-1)和退火温度(56~64 ℃)进行分析优化, 筛选出最佳的PCR反应条件.
2.5 检测限的确定将8个不同地区猪粪便样DNA和2个不同地区的环境水样DNA由最初浓度10 ng·μL -1进行10倍比连续稀释, 然后以筛选出的猪粪便特异性分子标记为引物进行PCR扩增反应, 设3个重复, 以确定最低检出限.以拟杆菌群通用引物PCR扩增为质控对照(表 1).
2.6 特异性及灵敏性试验分别提取30份猪粪便样品、8份猪粪废水样品及63份其他畜禽动物源粪便样品的DNA, 利用猪特异性分子标记PCR进行检测, 以分析该PCR方法对于实际样品检测的特异性及灵敏性.灵敏性(r)和特异性(s)分别用以下公式计算评价：r =a/(a+b)×100和s =c/(c+d)×100, 其中a代表某宿主样品中检测到本宿主阳性样品的数量(真阳性), b代表某宿主样品中检测到本宿主阴性样品的数量(假阴性), c代表另外宿主样品中检测到该宿主阴性样品的数量(真阴性), d代表另外宿主样品中检测到该宿主阳性样品的数量(假阳性).
2.7 特异性分子标记在不同地区水环境中的分布情况采用本实验优化的猪粪便特异性PCR方法对浙江省内8个不同地区采集的水样DNA进行PCR扩增, 以确定基于特异性分子标记所建立的PCR方法对可能受污染水样的特异性检测实效性.PCR产物以3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测.
3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 富集的猪粪便特异性基因组结果分析BLASTx比对结果显示, 所富集的猪粪便特异性克隆文库中315个非冗余序列(82%)在非冗余蛋白数据库中具有相似序列, 其中拟杆菌群(Bacteroidetes)、梭状杆菌群(Clostridia)蛋白基因相似性序列含量居多, 分别占富集的猪粪便特异性基因库序列的43.2%、19.5%.另外, 有3个序列对古生菌显示出较高的相似性(图 2).曾有研究发现拟杆菌群在猪肠道菌群中含量丰富, 且拥有大量的宿主特异性基因, 一些甚至参与宿主-微生物互作反应而表现出宿主特异性(Shanks et al., 2006; Gordon et al., 2002).在富集的猪粪便克隆文库中, 一些克隆片段序列则对环境细菌(如棒状杆菌(Corynebacterium spp.), 假单胞菌(Pseudomonas spp.))蛋白基因序列具有相似性, 说明这些生物很可能是环境中转移至肠道中的, 这些克隆序列不宜用来进行宿主特异性分子标记设计.
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| 图 2 GFE所富集的猪粪便克隆序列文库菌群分析 Fig. 2 Bacterial groups associated with the identified swine fecal metagenomic fragments by GFE |
功能预测分析结果显示在富集的猪粪便特异性基因文库中, 功能明确的基因序列占61.5%, 其中与拟杆菌群占62.6%.84条(22%)与代谢有关(例如碳水化合物的代谢), 49条(12.8%)基因序列与细胞加工及信号传导有关, 29条(7.6%)与信息贮存与加工有关(例如DNA的修复、重组)(图 3).功能基因组学研究证明有些功能蛋白如微生物表面蛋白(如拟杆菌群表面的荚膜多糖合成酶、肠球菌表面蛋白基因esp)、细胞加工(如膜有关分泌蛋白)及一些代谢功能蛋白(如α-1-6甘露聚糖酶、β-葡萄糖醛酸酶)等具有一定的宿主特异性(Mclellan et al., 2014), 可作为特异性分子标记用于人、牛等宿主粪便源微生物示踪(Ram et al., 2004; Zhang et al., 2009; Xu et al., 2003).因此, 本研究选取猪特异性序列文库中膜有关功能蛋白和代谢有关蛋白作为筛选宿主粪便特异性分子标记的潜在对象.
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| 图 3 猪粪便克隆序列文库功能预测聚类分析 Fig. 3 Clusters analysis of function annotation of enriched swine fecal DNA sequences |
从猪粪便特异性克隆文库中共筛选出26个猪粪便特异性序列设计引物并用于宿主粪便特异性PCR实验.主要按照以下原则筛选：① 对拟杆菌群、梭状杆菌群及芽孢杆菌群蛋白序列存在相似性, ② 对已描述并参与信息贮存、细胞加工及代谢的蛋白序列显示出相似性, ③ 膜有关蛋白序列存在相似性(Lu et al., 2007).利用GFE中猪粪便混合DNA及对照组中单个物种各自的混合DNA为模板对所有引物进行宿主粪便特异性PCR验证, 其中仅1对引物(3-53-2) 显示出宿主(猪)粪便特异性(图 4), 其余引物与牛、羊、鸡等其它物种粪便DNA都有不同程度的交叉反应性.3-53-2引物序列见表 1, 对应PCR扩增产物长度约124 bp.3-53-2基因序列对拟杆菌群蛋白序列具有相似性, 功能预测显示其主要参与细胞加工及信号传导分类中的DNA修复, 它是细胞对DNA受损伤后的一种反应, 这种反应可能使DNA结构恢复原样, 重新执行它原来的功能.在宿主(猪)与肠道微生物之间强烈选择和协同进化过程中, 会形成类似DNA修复机制等功能有关的互作位点, 这些位点保证了肠道微生物的多样性及宿主特异性.
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| 图 4 PCR特异性分析 (M.DL500 DNA Marker, 1.猪, 2.牛, 3.羊, 4.鸡, 5.鸭, 6.鹅) Fig. 4 Specificity of PCR assay (M.DL500 DNA Marker, 1.Swine, 2.Cow, 3.Sheep/Goat, 4.Chicken, 5.Duck, 6.Goose) |
不同浓度的特异性引物及温度梯度试验结果表明, 各个退火温度对PCR反应影响不大, 在后续的PCR实验检测中均选60 ℃为PCR反应退火温度(图 5a), PCR扩增产物与预期片段(124 bp)相符.25 μL的反应体系中上下游引物浓度在0.35 μmol·L-1时扩增效果最佳(图 5b).
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| 图 5 PCR方法条件的优化 (a图表示退火温度优化结果, 其中M.DL500 DNA Marker, 1.56 ℃, 2.58 ℃, 3.60 ℃, 4.62 ℃, 5.64 ℃.b图表示引物浓度优化结果, 其中M.DL500 DNA Marker.1.0.20 μmol·L-1.2.0.25 μmol·L-1.3.0.30 μmol·L-1.4.0.35 μmol·L-1.5.0.40 μmol·L-1.6.0.45 μmol·L-1.7.0.50 μmol·L-1) Fig. 5 Optimization of PCR assay (a, optimization of annealing temperature, M.DL500 DNA Marker, 1.56 ℃, 2.58 ℃, 3.60 ℃, 4.62 ℃, 5.64 ℃.b, optimization of primer concentrations, M.DL500 Marker, 1.0.20 μmol·L-1, 2.0.25 μmol·L-1, 3.0.30 μmol·L-1, 4.0.35 μmol·L-1, 5: 0.40 μmol·L-1, 6: 0.45 μmol·L-1, 7: 0.50 μmol·L-1) |
以10倍系列稀释的猪粪便DNA及水样DNA为模板进行的PCR扩增结果表明, 不同地区的猪粪便DNA的最低检测限相同, 均为0.01 ng·μL -1, 水样DNA检测限则为0.1 ng·μL -1(表 2, 图 6), 表明基于3-53-2分子标记的PCR方法具有较高的检测灵敏度, 且此方法具有较广的检测样范围, 适用于临床不同地区多样品的检测.
| 表 2 猪粪便样品DNA及污染水样DNA的检测分析 Table 2 Detection limit of PCR assay for swine fecal DNA and environmental sample DNA possibly polluted by swine manure |
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| 图 6 检测敏感性分析 (M.DL500 DNA Marker；1. 1 ng·μL -1, 2. 0.1 ng·μL -1, 3. 0.01 ng·μL-1, 4. 0.001 ng·μL -1, 5. 0.0001 ng·μL-1, a图表示以3-53-2引物为基础的PCR检测结果, b图表示拟杆菌群通用引物PCR对照) Fig. 6 Sensitivity of PCR assay (M: DL500 DNA Marker, 1. 1 ng·μL -1, 2. 0.1 ng·μL -1, 3. 0.01 ng·μL -1, 4. 0.001 ng·μL -1, 5. 0.0001 ng·μL -1, a, PCR assay based on 3-53-2 primer, b, PCR assay based on Bac32F and Bac708R) |
对30个猪粪便样DNA、8个猪粪废水样DNA及63个对照组动物粪便样DNA按照优化后的PCR条件进行检测分析, 结果显示97%的猪粪便样DNA及猪粪废水样DNA中能扩增出特异性分子标记3-53-2对应片段, 表明该方法具有很高的灵敏性(表 3).虽然该方法与对照组动物粪便样品DNA存在一定程度的交叉反应性, 但其特异性可达81%(表 3).美国环境保护局指出特异性高于80%的宿主粪便特异性分子标记具有进行微生物示踪的能力(U.S.Environmental Protection Agency).因此, 从实验整体结果来看, 本研究建立的PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性, 进一步说明该方法的建立为猪粪便污染源示踪调查可提供有力的支持.
| 表 3 猪粪便特异性分子标记的特异性与灵敏性评价 Table 3 Host specificity and host sensitivity of swine-feces-associated marker |
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利用筛选的猪粪便特异性分子标记对浙江省内8个不同地区采集的水样DNA进行检测, 结果显示在疑似受猪粪便污染的水域中检测出阳性样品数为24个, 各个地区的阳性检出率在75%~100%, 说明在实际应用中该检测方法具有较高的判别猪粪便污染源的能力.与之相比, 在疑似受羊、人粪便污染的HS地区采集的水样检测结果存在假阳性, 假阳性率为30%, 然而在疑似受牛粪便污染的LA2地区采集的水样没有检测出假阳性样品(表 4).从这个角度分析说明, 仅靠单一的宿主粪便特异性分子标记判别粪便污染源的确切来源是不充分的, 需要筛选出多个具有高精度判别宿主粪便污染来源的分子标记, 形成最佳分子标记组合.另外, 在粪便污染源示踪研究中, 任何宿主粪便特异性分子标记在应用之前, 需要进行大量的临床样品检验, 以保证以所筛选宿主粪便特异性分子标记为基础的实验检测准确性和有效性.
| 表 4 环境水样中猪粪便污染的检测 Table 4 Detection of swine fecal pollution from environmental samples |
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1) 本研究首次采用竞争性杂交方法富集猪粪便DNA特异性基因片段, 从而建立猪粪便特异性基因克隆文库.经菌群分析与功能预测, 发现可从能够编码优势菌群(拟杆菌、梭状杆菌等)表面蛋白、膜分泌蛋白及有些代谢蛋白的相关基因中挖掘猪粪便特异性分子标记.
2) 针对筛选出的特异性分子标记(3-53-2) 建立的常规PCR检测方法具有较高的检测灵敏度和宿主特异性.通过污染水样的检测应用证明了此方法的有效性, 能够为研究微生物示踪技术在非点源污染方面应用提供一定的基础数据.
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