1 引言(Introduction)

随着人类社会的发展，由于人类活动造成的外源氮输入比陆地生态系统的内源氮输入多30%~50%，导致全球氮沉降量激增(Lu et al., 2012; Zheng et al., 2002).陆地上的年氮沉降量高达43.47 Tg·N·a^-1(Holland et al., 1999)，海洋上活性氮沉降量达27 Tg·N·a^-1(Gallowary et al., 2002).氮元素是植物生长的必需养分，过多却会造成陆地生态系统“氮饱和”，进而引起土壤微生物多样性降低、加剧土壤酸化、导致水体富营养化及森林蓄积量下降等(Erisman et al., 2013; 曾清苹等, 2016).作为3大氮沉降集中区域之一，我国氮沉降引起森林生态系统和结构的改变已受到众多学者的关注(Zheng et al., 2002).土壤微生物作为土壤生态系统的分解者，推动着物质转化和养分循环，对生态群落的演替格局有深刻影响(曾清苹等, 2015).此外，土壤微生物活性对外界环境条件变动敏感，其功能多样性能表征出生境胁迫下微生物群落的生态特征(樊芳玲等, 2016; 王杰等, 2014).因此，研究氮沉降对陆地生态系统微生物的影响意义重大.

近年来，国内外不少学者对氮沉降引起的微生物效应展开了研究.曾清苹等(2016)对模拟氮沉降对缙云山马尾松影响的研究表明，春、秋季施氮抑制了土壤微生物量，夏、冬季增氮处理促进了土壤微生物量.Contosta等(2015)研究发现氮沉降(NH₄NO₃)抑制了土壤微生物总量.此外，Griepentrog等(2013)和DeForest等(2004)的研究则表明氮沉降并未显著影响土壤微生物数量.可见，土壤微生物群落对氮沉降的响应并不一致.目前，我国关于氮沉降对森林生态系统的研究主要集中在杨树(赵超等, 2015)、杉木(袁颖红等, 2012)、马尾松林(曾清苹等, 2016)等，而在经果林中开展氮沉降试验还未见报道.为预测氮沉降量激增的背景下亚热带经果林土壤微生物群落的变化，开展相关氮沉降实验是及其必要的.

柑橘林(Citrus Forest)是亚热带地区广泛种植的经果林，在我国柑橘的栽培面积达2000×10³ hm²，居世界第一(胡佳羽等, 2012).据报道，重庆三峡库区柑橘果园系统碳贮量高达3612×10⁴ t，生态建设应用价值较高(吴晓莲等, 2014).因此，本文通过开展人工氮添加模拟氮沉降试，研究柑橘林土壤微生物群落结构对氮沉降的响应，以期为经果林的可持续发展提供理论依据.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 研究区概况

本研究试验样地布设在重庆市缙云山国家级自然保护区内(106°22′E，29°45′N)(图 1).缙云山海拔最低点350 m，最高点951.5 m，属亚热带湿润性季风气候.雨热同期，降雨主要集中在4—9月(降雨量为1243.8 mm)，其中7—8月为伏旱期，降雨量小，蒸发量大.土壤主要由三叠纪须家河组厚层石英砂岩发育而来的酸性黄壤及人为利用的水稻土组成.试验地2014年7月—2015年6月的月均降水和空气温度(中国天气网)如图 2所示.

2.2 试验设计

2014年5月在缙云山柑橘林建立野外模拟氮沉降研究区，并在研究区(无施肥)内选取3块面积为20 m×20 m的标准样地.沿标准样地的对角线确定3个点，于每个点各设置4个1 m×1 m的小样地作为氮添加处理(不考虑大气氮沉降)样方.在每一个小样地中随机放置一个PVC管(H16 cm×D23 cm)，用铁锤敲击埋入土壤中，并确保管顶高出土壤表面3 cm左右.管内须去除植物和凋落物.参照氮饱和项目及广东东莞市大岭山森林公园等研究氮沉降处理的强度，并结合我国未来氮沉降可能继续增加的氮沉降趋势(曾清苹等, 2016; 钟晓兰等, 2015)，本试验氮添加处理设置了4个水平：对照N₀(0 g·m^-2·a^-1)、低氮N₂₀(20 g·m^-2·a^-1)，中氮N₄₀(40 g·m^-2·a^-1)和高氮N₆₀(60 g·m^-2·a^-1).采用手提式喷雾器进行施氮(NH₄NO₃)，对照组喷洒等体积纯水.

柑橘林平均密度34株·亩^-1，林龄43 a，平均地径14.2 cm，平均树高4.3 m，郁闭度85%.林下无灌木层，草本层为优势群落，主要优势草本为：兔儿酸(Polygonum amphibium L.)、糯米团(Gonostegia hirta (Bl.) Miq.)、九层塔(Ocimum basilicum L.)、加拿大飞蓬(Conyza canadensis (L.) Cronq.)、杠板归(Polygonum perfoliatum L.)、稗草(Echinochloa crusgalli (L.) Beauv.).供试土壤理化性质详见表 1.

2.3 样品采集和测定

具体施氮时间为2014年7月29日、2014年11月11日、2015年2月5日及2015年5月4日.施氮处理2 d后，采用ACE自动土壤呼吸监测系统配带的2个土壤温度热电阻探头和2个土壤水分探头SM300分别对土壤温度和湿度进行测量.同时，采集小样地内0~20 cm深度土样，带回实验室.除去碎石、根系等杂物，过2 mm筛后储存在4 ℃冰箱用于测定土壤微生物含量.

土壤微生物采用修正的Bligh-Dyer方法(Zelles et al., 1992)进行分析.以C19:0做内标，用气相色谱仪测定(Aligent 6850)，并采用MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version6.1, MIDI, Inc., Newark, DE)对土壤微生物的磷脂脂肪酸进行鉴定.其中，细菌选取16:0、cy17:0、16:1 2OH、18:0、cy19:0 w8c等来表征；真菌选取18:1 w9c等来表征；放线菌选取10Me17:0、10Me18:0等来表征(Contosta et al., 2015; 曾清苹等, 2016)，脂肪酸命名参照Frostegard方法(Frostegård et al., 1996).并利用土壤微生物丰富度指数(R)(戈峰等, 2002; Frostegård et al., 1996)、Shannon多样性指数(H′)(Frostegård et al., 1996; 孙海新等, 2004)、Pielou均匀度(J)(戈峰等, 2002; Frostegård et al., 1996)来综合评价土壤微生物群落结构功能的多样性.

2.4 数据处理及统计分析

采用SPSS18.0、Microsoft Excel 2013等软件进行数据分析.使用SPSS单因素方差分析法分析氮沉降对土壤微生物PLFA的影响，并进行差异性分析(p＜0.05).采用相关性分析评价土壤微生物PLFA与环境因子的关系.

3 结果(Results) 3.1 模拟氮沉降对不同类型土壤微生物PLFA的影响

氮沉降处理对柑橘林地土壤微生物PLFA有显著影响，且季节不同影响各异(图 3).春季施肥处理结果表明随着氮浓度增加，真菌PLFA量表现为先增加后减少，最大值出现在N₄₀组为(1.880±0.241) nmol·g^-1；细菌PLFA、放线菌PLFA及总PLFA量则呈先降低后升高再降低的变化趋势，较对照组N₀而言，N₂₀、N₄₀及N₆₀组细菌PLFA降低了36.6%、8.7%、30.7%，放线菌PLFA降低了36.9%、0.5%、40.7%，总PLFA降低了35.5%、3.5%及27.6%.这说明春季施肥降低了土壤细菌PLFA、放线菌PLFA及总PLFA量，但增加了真菌PLFA量.

夏季施氮处理后，细菌、真菌及总PLFA均呈先下降后上升再下降的变化趋势，与对照组N₀相比，N₂₀、N₄₀及N₆₀细菌分别下降12.0%、上升18.1%、下降1.8%，N₂₀、N₄₀及N₆₀真菌PLFA下降35.0%、8.5%及42.5%，N₂₀、N₄₀及N₆₀总PLFA下降12.8%、上升7.7%、下降10.3%；放线菌则呈先上升后下降的变化趋势，N₂₀、N₄₀及N₆₀分别比对照组N₀增加了109.4%、124.9%和82.2%.这说明夏季低、高氮处理降低了土壤细菌PLFA、真菌PLFA及总PLFA，增加了放线菌PLFA，而中氮处理增加了土壤细菌PLFA、放线菌PLFA及总PLFA，降低了真菌PLFA.

秋季施氮处理后，真菌、细菌、放线菌、总PLFA与夏季各组PLFA变化的总体趋势一致(表 2)，细菌、放线菌、总PLFA最大值均出现在N₄₀组，分别比对照组增加了10.2%、17.1%及4.1%，真菌最大值则出现在N₀组；冬季施氮处理后，细菌、放线菌、总PLFA及真菌最大值均出现在N₄₀组，分别比对照组N₀升高了56%、29.9%、46.3%及14.7%.

3.2 模拟氮沉降对土壤微生物群落结构的影响

分析不同施氮处理下土壤微生物丰富度指数(S)、Shannon-Wiener多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J)的变化，综合反映氮沉降对土壤微生物群落结构和功能的影响(表 2).春季氮处理后，S表现为N₄₀＞N₀＞N₆₀＞N₂₀，H′呈N₄₀＞N₀＞N₂₀＞N₆₀，J呈N₄₀＞N₂₀＞N₀＞N₆₀，N₄₀处理S、H′及J均最大，说明N₄₀组土壤微生物种类最丰富且分布最均匀；夏季氮处理后，S表现为N₄₀=N₆₀＞N₂₀＞N₀，H′呈N₄₀＞N₆₀＞N₂₀＞N₀，J呈N₀＞N₂₀＞N₄₀＞N₆₀，说明土壤微生物PLFA在N₄₀浓度下种类最丰富而在N₀浓度下分布最均匀；秋、冬季S、H′均属N₄₀组最大，但秋季N₆₀处理土壤微生物PLFA分布最均匀，冬季则是N₂₀分布最均匀.

3.3 模拟氮沉降对土壤温度和土壤湿度的影响

氮处理对土壤温度有显著影响，对土壤湿度影响不明显(表 3).随着氮浓度升高，各个季节土壤温度变化趋势不一致.

3.4 土壤微生物PLFA与土壤温度、湿度间的相关性分析

温度、水分等条件差异均会影响土壤微生物群落结构与功能.将各处理土壤微生物PLFA总量分别与土壤温度、土壤湿度进行相关性分析，结果表明氮沉降浓度与细菌、真菌、放线菌、总PLFA及土壤湿度呈负相关，但未达到显著水平；细菌与总PLFA、放线菌和土壤湿度呈显著正相关；真菌与放线菌呈显著正相关，与总PLFA呈显著正相关；放线菌与总PLFA呈显著正相关，与土壤温度呈显著负相关，与土壤湿度呈显著正相关；总PLFA与土壤湿度呈显著正相关；土壤温度与土壤湿度呈显著负相关.

4 讨论(Discussion)

微生物是土壤生态系统中最活跃的部分，对土壤养分可用性和森林生态系统的生产力有重要意义(李南洁等, 2017).土壤微生物群落结构及多样性受众多因素影响，如：土壤质地、植被、海拔、温湿度等(Contosta et al., 2015; 曾清苹等, 2015；时鹏等, 2010).本研究结果表明：土壤湿度与细菌和总PLFA呈显著正相关，与放线菌呈显著正相关，这与大多数研究结果相似.Huang等(2015)对新疆古尔班通古特沙漠的研究中发现，真菌和细菌PLFAs与土壤含水率呈正相关.Cederlund等(2008)发现土壤含水量愈高，土壤微生物量及其活性也愈高.王杰等(2014)研究表明：水分增加能减少施氮处理对微生物的抑制作用，增强微生物代谢活性.本实验结果表明放线菌与土壤温度呈极显著负相关，而土壤真菌、细菌及总PLFA与土壤温度呈负相关，但未达到显著水平.这说明放线菌对土壤温度的响应比真菌、真菌更敏感.在本研究土壤中细菌为优势菌，故而在一定范围内土壤温度的升降不会造成土壤微生物群落的急剧变化.这与杨林等(2016)对高山森林土壤微生物群落的研究结果相似，其研究结果表明：土壤有机层细菌生物量、矿质土壤层G^－生物量随温度升高而降低，土壤有机层真菌、G⁺、G^－生物量和矿质土壤层细菌、真菌和G⁺生物量随温度升高无显著变化.张卫建等(2004)对美国大平原地区进行增温(上升1.8 ℃)的实验结果则表明：增温不会显著影响土壤微生物的总生物量，但会明显提高群落中真菌与细菌的比值.

此外，氮沉降也会引起土壤微生物群落结构的改变(刘彩霞等, 2015).适量N源输入可改善土壤水热情况、土壤质地及微生物活性，但过量会造成土壤微生物多样性降低、土壤酸化等(陈晓芬等, 2013; 曾清苹等, 2016).Ramirez等(2012)对北美洲28个生态系统中的土壤研究表明：氮沉降处理使土壤呼吸速率平均下降11%，土壤微生物量下降35%.Bååth等(2002)等对德国北部的53个成熟阔叶林土壤研究发现，土壤微生物量与土壤pH密切相关.洪丕征等(2016)模拟氮沉降对红椎人工幼林土壤研究发现，氮沉降导致土壤微生物下降的主要机制是土壤pH的降低.Högberg等(2003)研究发现，pH过低会抑制细菌生长.氮沉降还可以通过改变微生物群落对碳源利用类型而对土壤微生物量产生影响.Henriksen等(1999)研究发现，施氮处理会改变土壤微生物的碳源利用类型与数量进而影响土壤微生物活性.孙凤霞等(2010)对湖南祁阳县红壤长期定位施肥19年的土壤研究发现，有机肥单施或与化肥配合施用均显著提高土壤微生物生物量碳、氮和微生物碳源利用率.本研究中，低、高氮使土壤总PLFA和细菌降低，中氮则使其升高，这可能与氮沉降背景下土壤微生物对碳源利用类型与能力的改变有关.王杰等(2014)对贝加尔草原土壤微生物对碳源的利用能力主成成分分析表明：低氮处理(15 kg·hm^-2·a^-1)下的微生物对碳源利用能力居中，高氮处理(100 kg·hm^-2·a^-1)对碳源利用能力较低，中氮处理(50 kg·hm^-2·a^-1)对代谢中间产物和次生代谢物有较高利用能力.马慧君等(2017)对江苏东台杨树人工林土壤微生物的研究中亦有类似发现，中氮处理(100 kg·hm^-2·a^-1)可以在一定程度上增强微生物对碳源代谢能力，氮添加浓度过高或是较少则会产生抑制作用.而刘蔚秋等(2010)对人工施氮对土壤理化性质的研究发现，土壤碳源平均颜色变化率(AWCD)在林内生境随加N浓度的增加而下降，而在林缘生境则呈现先升高后下降的趋势，且在N浓度水平为20 kg·hm^-2时达到最高.这说明氮沉降对土壤微生物群落的影响因生境、植被类型、氮素形态及时间长度等的不同而有所差异.因此，为深入了解氮沉降对土壤微生物群落的影响机制，还需要考虑氮沉降背景下土壤pH、土壤C/N、土壤微生物碳源利用效率等的变化，并做进一步的长期观察.

本研究结果表明，土壤微生物丰富度指数和Shannon-Wiener多样性指数在中氮沉降条件下达最大，而4个季度Pielou均匀度指数则表现不一致，其中春季和夏季中氮浓度下最大，秋季在高氮处理下最大，冬季则在低浓度下最大.分析原因为：当氮素对植物的限制解除后，将会提高植物群落对氮素的利用效率，从而改变土壤微生物群落结构和多样性，但过量的增氮处理会降低植物物种丰富度.土壤微生物群落受多种环境因子作用，如土壤温度、水分、土壤中营养元素的有效性、植被类型、土壤质地，不能简单的说某些因子一致则土壤微生物一定会出现一致结果.

5 结论(Conclusions)

总体而言，氮沉降水平使土壤真菌含量降低，但春季的低、中氮使土壤真菌含量升高；氮沉降对土壤放线菌有显著影响，但各个季节影响不同，且无一致的变化规律；低、高氮使土壤总PLFA和细菌降低，中氮则使其升高.土壤微生物种类在中氮处理下最丰富且分布也最均匀.氮沉降对土壤温度有显著影响，但对土壤湿度影响不明显(p＜0.05).土壤温度与放线菌呈显著负相关，与土壤真菌、细菌及总PLFA土壤温度亦呈负相关，但未达到显著水平，土壤湿度与细菌和总PLFA呈显著正相关，与放线菌呈显著正相关.土壤微生物丰富度指数和Shannon-Wiener多样性指数在中氮沉降条件下达最大，而4个季度Pielou均匀度指数则表现不一致，其中春季和夏季中氮浓度下最大，秋季在高氮处理下最大，冬季则在低浓度下最大.