2017, Vol. 37
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植物对重金属污染土壤的修复速率取决于植物对重金属的萃取能力和植物自身的生物量，因此如何在保障植物正长的前提下提高植物对重金属的吸收和转移能力是提高重金属污染土壤植物修复的关键.研究发现, 铅冶炼厂附近重金属污染土壤中黑麦草 (Lolium perenne) 生长良好，对重金属Pb和Zn有着较好的耐性，且根部Pb和Zn含量分别为1250和1143 mg·kg-1(Bidar et al., 2007)，因此黑麦草是Pb和Zn的耐受品种 (Bai et al., 2014; Song et al., 2015).此外，黑麦草具有生长迅速、生物量大及可多次刈割等优点，且其季节适应性较强，正逐渐受到国内外学者的关注 (He et al., 2013; 2014; Healy et al., 2016).
植物对土壤重金属的富集能力除了与植物本身对土壤重金属的富集与转移能力有关外，还在很大程度上取决于土壤重金属的生物有效性 (Li et al., 2016).乙二胺四乙酸 (Ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA) 作为螯合剂的代表性物质，当其以0.5~3 g·kg-1溶液的形式施加到土壤后不仅能迅速与土壤中Pb、Zn、Cu和Cd等碱性金属形成稳定的水溶性络合物，而且可以促进耐性植物对金属的萃取吸收及由根部向地上部转移 (Zaier et al., 2010; Lambrechts et al., 2011).当EDTA剂量高于3 g·kg-1时，会抑制植物的生长并同时降低植物中金属的积累量 (Wu et al., 2004; Clabeaux et al., 2013)，抵消了部分因重金属浓度增加产生的强化效应，从而形成了植株体内重金属浓度与植物生物量之间的消长关系.
降低重金属对植物的生理毒性和改善植物对重金属的耐性，从而提高植物生物量是增强植物修复效率的另一重要途径，许多外源植物激素能缓解重金属对植物的生理毒性，减轻重金属对植物生长的胁迫作用，提高重金属胁迫条件下植物的生物量 (Bulak et al., 2014).基于螯合剂对土壤重金属的活化作用和植物激素对植物重金属耐性与积累的促进作用，采用外源重金属螯合剂联合植物激素共同诱导植物修复重金属污染土壤，调控植物生物量与植物体内重金属浓度之间的消长关系，从而提高植物修复效率，是一个值得探索的研究方向.
芸苔素内酯 (Brassinolide, BR) 被学术界称为第6类植物激素，具有强力生根、促进生长、协调营养平衡、增强作物抗逆性等多重功能，可以有效缓解Pb污染对植物生长的氧化胁迫和毒害作用 (Anuradha et al., 2011).有学者研究发现, 10-8 mol·L-1 BR不仅显著抑制了重金属对植物产生的毒性，而且提高了植株本身的抗氧化酶水平 (Bajguz, 2010).但BR和螯合剂联合修复重金属污染土壤的效果尚不清楚.本研究采用BR与EDTA来联合调控黑麦草对Pb的积累与耐性，通过盆栽实验研究EDTA与BR联合强化黑麦草修复Pb污染土壤的潜力与机制，旨在为探索新型植物-化学联合修复重金属污染土壤提供技术支撑和科学依据.
2 材料和方法 (Materials and methods) 2.1 供试土样和黑麦草种植盆栽实验在常州大学环境与安全工程学院温室大棚内进行.供试土壤来自江苏省常州科教城周边菜地，土壤质地类型为砂壤土.将采集的表层0~20 cm土壤样品经自然风干后过2 mm筛备用.其基本理化性质为：pH值为7.2，有机质含量为7.48 g·kg-1，速效氮、速效磷、速效钾和土壤全Pb含量分别为35.54、24.77、121.42和30.62 mg·kg-1.重金属Pb以分析纯Pb (NO3)2溶液形式喷施入土壤，经过搅拌机充分混匀，平衡6个月，模拟Pb污染土壤 (Pb含量均为500 mg·kg-1).每个塑料盆规格为25 cm (直径)×17 cm (高), 装土2.5 kg (干重)，盆下带托盘.2015年开始种植，供试植物为一年生黑麦草 (Lolium perenne)，草种由江苏省农科院明达种子经营部提供.种子经4%NaClO消毒30 min，并用去离子水清洗后播种，每盆250粒 (以保证发芽后每盆大于150株).温室白天/夜晚温度为25 ℃/15 ℃，每天浇水200 mL，以保持土壤含水率为最大持水量的70%.
2.2 实验设计实验设置8个处理，分别为：①M：不加EDTA和BR；②E：根施EDTA 2.5 mmol·kg-1；③B1：叶面喷施BR 0.025 mg·L-1；④B2：叶面喷施BR 0.05 mg·L-1；⑤B3：叶面喷施BR 0.1 mg·L-1；⑥EB1：根施EDTA 2.5 mmol·kg-1，叶面喷施BR 0.025 mg·L-1；⑦EB2：根施EDTA 2.5mmol·kg-1，叶面喷施BR 0.05 mg·L-1；⑧EB3：根施EDTA 2.5 mmol·kg-1，叶面喷施BR 0.1 mg·L-1.每个处理设3次重复.BR液体 (广州农泰生物科技有限公司) 先配置成2 mg·L-1的储备液，使用去离子水稀释到相应的浓度梯度 (0.025、0.05和0.1 mg·L-1)，以叶面喷施的方式添加.黑麦草出苗7 d后，每10 d进行一次叶面喷施 (每次每盆施加量为5 mL)，共计喷施5次.EDTA投加量设定为2.5 mmol·kg-1，以溶液的形式分别在黑麦草出苗后第30 d和第45 d向土壤中直接添加.BR的3个浓度梯度为0.025、0.05和0.1 mg·L-1，在出苗后每10 d进行一次叶面喷施，每次喷施量为5 mL，第30 d和第45 d直接以溶液的形式分别向Pb污染土壤中施加1.25 mmol·kg-1的EDTA，每盆施加量为100 mL，60 d收获植物.
2.3 实验方法 2.3.1 生物量和Pb含量的测定用自来水将植株冲洗干净后，用20 mmol·L-1的Na2-EDTA浸泡30 min，去除根系表面吸附的Pb，再用自来水冲洗3~4次，最后用去离子水润洗，吸干表面水分，分成地上部和地下部，用电子天平称出植株各处理的鲜重后，于105 ℃下杀青0.5 h，75 ℃烘干至恒重，用电子天平称取地上部和地下部干重.测定重金属Pb含量时，称取200 mg粉碎烘干样品，加入8 mL 65%HNO3(GR，国药) 和1 mL 30%H2O2, 采用微波消解仪 (上海新仪，MDS-8G) 进行消解，消解液Pb含量采用原子吸收分光光度计 (德国耶拿novAA300) 测定并换算成植物地上部和地下部单位干重的含量.
2.3.2 光合色素含量的测定取新鲜植株地上部叶片，用电子天平称取0.1 g，加入25 mL 80%丙酮研磨至匀浆，4000 r·min-1离心15 min，取上清液.分别在440、645和663 nm处测定OD值，计算出黑麦草地上部叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量 (张志良等，2009).
2.3.3 生理指标的测定抗坏血酸 (AsA) 和谷胱甘肽 (GSH) 含量的测定采用陈建勋等 (2006)的方法.酸溶性巯基 (Acid soluble thiol, SH) 含量的测定如下：取新鲜植株地上部叶片，准确称取0.5 g，加入0.02 mol·L-1 EDTA 5 mL，研磨至匀浆，从中吸取1.5 mL匀浆加入10% TCA 2.5 mL混合均匀，10000 g离心20 min，上清液即为提取液.取2 mL提取液，依次加入2 mL 0.4 mol·L-1的Tris缓冲溶液 (pH=8.9) 和0.3 mL 0.01 mol·L-1的DTNB，混合均匀后，在412 nm处测定OD值 (Zhang et al., 2004).植物螯合肽，即植物络合素 (Phytochelatins, PCs) 的含量为酸溶性SH与GSH含量的差值 (齐君等，2012).以上操作均在4 ℃下进行 (李君等, 2016).
2.4 数据分析本文采用富集系数来分析黑麦草对Pb的富集能力，富集系数是指地上部Pb含量与土壤Pb含量的比值；采用转移系数来分析Pb在黑麦草植株中的迁移特征，地上部-地下部转移系数是指地上部Pb含量与地下部Pb含量的比值.盆栽试验中每个处理设置3个平行样，最后取平均值作为对应处理的最终值.在这个试验中所有数据均表示为平均值±标准偏差 (SD).实验数据采用SPSS19.0软件进行回归分析，采用ANONA方差显著性分析和LSD (取对数) 检验分析各处理间差异，其中显著性检测限为p＜0.05，采用Origin 9.1进行图形绘制.
3 结果 (Results) 3.1 EDTA和BR对Pb胁迫条件下黑麦草生理生化指标的影响 3.1.1 不同处理对黑麦草光合色素含量的影响不同处理条件下，黑麦草地上部各光合色素含量见表 1.由表 1可知，单施适宜浓度的BR或EDTA与BR配施均可以显著提高黑麦草地上部光合色素含量，而单施EDTA对光合色素的影响不显著.其中，B1处理显著提高了黑麦草地上部所有光合色素含量，B2处理叶绿素a和叶绿素b含量显著增加.而EB2处理显著提高了叶绿素a的含量，其余配施也提高了地上部光合色素含量，但不显著.单施BR处理中叶绿素a/叶绿素b值与M处理相比，均有所减小，而叶绿素/类胡萝卜素值则有所增加，而3种光合色素含量均不同程度增加，说明单施BR对黑麦草地上部叶绿素b的影响最大，叶绿素a次之，对类胡萝卜素的影响最小.
| 表 1 不同处理对黑麦草地上部光合色素含量的影响 Table 1 Effect of different treatments on photosynthetic pigments in Lolium perenne leaves |
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从图 1可以看出，单施BR不同程度地提高了黑麦草地上部和地下部干重，而BR与EDTA配施对黑麦草生物量没有显著影响.其中，与M处理相比，B1处理显著提高了黑麦草地下部干重，B2处理显著提高了地上部和地下部干重，可见BR作为一种高效植物激素，其适宜的浓度处理可以促进黑麦草的生长.而单施EDTA及EDTA与BR配施各处理其地上部和地下部干重没有显著变化.综上，在单施BR或者EB2和EB3处理水平上没有抑制黑麦草生长，从而可以保证植物正常生长和持续收割.
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| 图 1 不同处理对黑麦草干重的影响 Fig. 1 Dry biomass of different treatments in Lolium perenne |
AsA和GSH是植物细胞内重要的抗氧化剂，前者可以还原超氧自由基，清除羟基自由基及过氧化氢，后者具有一直饱和脂肪酸生物膜组分等的氧化分解，防止膜脂过氧化，延缓细胞衰老和增强植物抗逆性的作用.从表 2中可以看出，BR和EDTA单施或配施都有不同程度地提高了黑麦草地上部AsA和GSH的含量，其中, EB2处理AsA和GSH的含量相对M处理显著提高，从而增强了该处理条件下地上部细胞的抗氧化性.
| 表 2 不同处理对黑麦草地上部AsA、GSH、酸溶性SH和PCs含量的影响 Table 2 Effects of different treatments on AsA, GSH, SH and PCs in shoot of Lolium perenne |
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PCs是植物体内在重金属诱导下产生的一类多肽，对重金属具有很强的螯合能力，因此, 它是植物体内重要的解毒物质.从表 2中看出，B2和B3处理显著提高了酸溶性SH和PCs含量，从而增加了黑麦草对Pb的耐性，有利于黑麦草正常生长.而BR与EDTA配施处理，黑麦草地上部酸溶性SH和PCs含量没有显著变化.可见，单施BR条件下黑麦草表现出较高的清除活性氧非酶物质含量，可能与BR本身可以延缓植物衰老的功能有关.
3.2 不同处理对黑麦草中Pb积累分布特征的影响不同处理对黑麦草生长的影响不一，其对Pb的吸收和富集能力也存在显著差异 (表 3).在Pb胁迫条件下，黑麦草地下部Pb含量 (M处理) 远高于地上部，而BR或EDTA单施及两者配施，地上部Pb含量均高于地下部.相对Pb污染土壤 (M处理)，单施BR显著提高了黑麦草地上部Pb含量，且随着BR浓度的升高而降低；而BR与EDTA配施亦显著提高了黑麦草地上部含量，但地上部Pb含量随着BR浓度的升高显著增加.
| 表 3 黑麦草地上部和地下部Pb迁移和积累分布特征 Table 3 Characteristics of transport and accumulation in shoot and root of Lolium perenne |
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从植株Pb积累量上来看，BR或EDTA单施和配施均显著地提高了黑麦草地上部Pb积累量，配施效果显著大于单施，其中, EB2和EB3处理的地上部Pb积累量分别是M处理的7.31和8.79倍.从转移系数上来看，BR或EDTA单施和配施的转移系数均显著大于M处理，可见BR和EDTA单施或配施均能促进黑麦草中Pb向地上部转移，且EDTA与BR配施中的转移系数随着BR浓度的升高而增加.从富集系数上来看，单施和配施处理均有显著提高，且EFEB3＞EFEB2＞EFE＞EFB1，可见0.1 mg·L-1 BR和2.5 mmol·kg-1 EDTA配施最有利于黑麦草地上部Pb的富集.
对黑麦草生物量、铅积累特征与生理特性之间的相关分析 (表 4) 结果表明，地上部干重与叶片生理特性指标之间没有显著相关关系，地下部干重与SH含量呈显著正相关.地上部Pb含量、Pb积累量、富集系数和转移系数均与ASA呈显著正相关 (p < 0.05)；地下部Pb含量则与SH呈显著负相关.地上部Pb含量、Pb积累量与PCs含量呈显著负相关 (p < 0.05)，地下部Pb含量与PCs呈显著负相关 (p < 0.01).
| 表 4 黑麦草生物量、Pb含量与生理特性指标的关系 Table 4 Relationship between biomass, Pb contents and physiological characteristics of Lolium perenne |
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EDTA在施入土壤后可以与Pb形成可溶的金属络合物，在促进稳定态的Pb向土壤溶液中转移的同时，也改变了黑麦草从土壤中吸收Pb的方式 (Zhao et al., 2011)，金属络合物容易随着植物蒸腾作用向地上部迁移，从而显著增加植株中重金属的含量 (De et al., 2007)，因此, 在重金属污染土壤植物修复中有着广泛的运用 (Zaier et al., 2010; 2014).本试验研究表明，EDTA单施显著提高了地上部和地下部Pb含量，E处理的地上部Pb含量是M处理的4.70倍.
生物量是衡量植物生长的重要指标，可以反映植株对金属的耐性 (陈生涛等, 2014; Waterlot et al., 2011; Zhang et al., 2014).本试验中的黑麦草是一种多年生草本植物，可以连续收割，因此, 保证植株正常生长可以积累更多的生物量，实现对土壤重金属的长时间提取修复.许多研究表明，施加EDTA会显著增加植物对重金属的富集，加剧重金属对植物的胁迫；过量使用EDTA来促进黑麦草对土壤重金属的吸收，往往会对植物生长造成显著的负面影响，导致植物生物量的显著降低甚至枯萎或烂叶 (杨明琰等, 2014).Chen等 (2004)分别向玉米、高粱、绿豆和向日葵等添加0、2.5和5 mmol·kg-1等不同剂量的EDTA, 发现随着EDTA剂量的升高，各植物地上部和地下部干重显著降低.Luo等 (2005)分别向玉米和豆角中单独施加5 mmol·kg-1的EDTA，发现两种植物地上部干重相比对照都降低了，而其地上部Pb含量显著增加.为降低EDTA处理产生的负面影响，本研究仅向每盆土壤中施加2.5 mmol·kg-1 EDTA，且分为2次，分别在第30 d和第45 d时施加, 结果发现，EDTA单施或与BR配施处理盆栽中的黑麦草地上部和地下部干重与Pb污染土壤 (M处理) 相比都没有显著差异.可见，适量分次使用EDTA处理可以避免对黑麦草生长造成显著的负面影响，保证其可以连续收割.
许多植物激素一般通过增强植物对重金属的耐性来促进植物生长，而不会显著提高植株体内重金属含量.Tassi等 (2008)通过3次叶面喷施植物生长调节剂Phytagro强化向日葵修复Pb和Zn复合污染土壤，结果表明, 单施Phytagro在显著提高了向日葵茎部干重的同时其茎部Pb积累量略微降低，但没有显著变化；Fässler等 (2010)研究了IAA强化玉米修复Pb或Zn污染土壤，发现随着IAA浓度的提高玉米地上部干重显著增加，但其地上部Pb和Zn含量没有显著变化.BR作为一种新型绿色环保植物生长调节剂，也有着较强的促进植物生长 (Tsurumi et al., 2000) 和缓解重金属生理毒性的作用 (Sharma et al., 2016).然而，本研究中，适量喷施BR不仅可以提高黑麦草生物量，还可能提高黑麦草地上部的Pb积累量，这可能是由于BR的施入显著地提高了黑麦草地上部酸溶性SH和PCs的含量，使得BR处理的黑麦草地上部表现出较好的清除活性氧性能，保证了植物在高Pb浓度环境下的正常生长，从而积累更多的Pb.
EDTA与BR配施条件下，与M处理相比，各处理生物量没有显著提高，地下部和地上部Pb含量、积累量则均有不同程度的提高，AsA含量和GSH含量也显著提高.EB2和EB3处理的地上部Pb积累量与EDTA单施处理相比也有显著提高.可见，BR与EDTA配施可以进一步提高黑麦草对铅的富集能力，从而提高对Pb污染土壤的修复能力.相关分析结果表明，地上部Pb含量、Pb积累量、富集系数和转移系数均与AsA含量呈显著正相关，地上部Pb含量、Pb积累量与PCs含量呈显著负相关，地下部Pb含量与SH含量呈显著负相关.因此，BR单施条件下，黑麦草可以通过提高植株SH和PCs来提高对Pb污染胁迫的耐性.然而，在EDTA与BR配施条件下，黑麦草Pb富集与迁移能力继续提高，Pb污染胁迫继续增大，黑麦草主要通过提高AsA含量来提高其对Pb的抗氧化胁迫作用.
5 结论 (Conclusions)1) 单施适宜浓度的BR可以显著提高黑麦草地上部叶绿素a、叶绿素b、SH、PCs含量及植株干重，同时也提高了Pb胁迫条件下黑麦草的光合作用性能，延缓了植株衰老，增强了植株抗逆性及黑麦草对Pb胁迫的耐性.
2) EDTA单施或与BR配施对黑麦草干重没有显著影响，且均显著提高了植株地上部Pb积累量，配施效果大于EDTA单施和BR单施.其中，根施2.5 mmol·kg-1 EDTA和叶面喷施0.05~0.1 mg·L-1 BR处理可使地上部Pb积累量提高7.31~8.79倍，显著促进了Pb从地下部向地上部的迁移和富集.
3) 地上部Pb含量、Pb积累量、富集系数和转移系数均与AsA含量呈显著正相关.EDTA与BR配施条件下，黑麦草Pb富集与迁移能力继续提高，Pb污染胁迫继续增大，黑麦草主要通过提高AsA含量来提高对Pb污染的抗氧化胁迫作用.
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