1 引言 (Introduction)

作为一种主要大气污染物, SO₂会对人们的身体健康和社会发展造成不可忽视的负面影响.国内外流行病学调查结果发现, SO₂不仅可引起呼吸系统疾病, 还与心血管系统健康密切相关, SO₂吸入人体之后增加了心律失常、心力衰竭、肺心病、缺血性心脏病等心血管疾病的风险和死亡率 (Chen et al., 2008; Pereira et al., 2008; Martins et al., 2006; Maitre et al., 2006; 杨敏娟等, 2008). SO₂吸入人体后会转变为其衍生物——亚硫酸盐和亚硫酸氢盐, 随血液在体内循环 (秦国华等, 2014), SO₂对体内组织细胞的毒作用主要是通过这些体内衍生物来实现的.已检测到小鼠吸入SO₂后心脏中亚硫酸盐含量增加 (Meng et al., 2005a). SO₂及其衍生物作为全身性毒物能够导致心脏氧化损伤 (Meng et al., 2003)、DNA损伤 (Meng et al., 2004; Meng et al., 2005b)、调亡及炎症相关因子的改变 (Yun et al., 2011) 等.

心脏组织中胶原浓度的升高或者成分的改变, 可导致心脏组织硬化或纤维化, 影响心脏的收缩功能, 这种病理变化存在于多种心血管疾病中, 现认为与心律失常、心功能障碍及心脏性猝死等密切相关 (张召才等, 2004).我们最近的研究发现SO₂吸入可导致心脏收缩功能紊乱, 抗氧化剂NALC (N-乙酰半胱氨酸) 可有效缓解SO₂所引起的心脏收缩功能紊乱 (Qin et al., 2016).在血管周区域的胞外基质蛋白中, 胶原蛋白高达85%, 心肌胶原含量升高2~3倍可导致心室舒张期硬度增加和充盈异常, 升高4倍以上可导致心室收缩功能的下降 (Weber et al., 1995).然而在大部分组织中，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原组成了总胶原蛋白量的2/3(Heeneman et al., 2003), 因此研究Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达水平对于研究SO₂对心脏功能产生的影响具有重要意义.

基于此, 在本研究中我们用SO₂衍生物之一—亚硫酸氢钠对大鼠心肌细胞H9C2进行不同时间 (3、6、12、24 h) 染毒处理, 再进一步用7 mg·m^-3 SO₂单独或与NALC复合暴露于大鼠, 测定了H9C2细胞和大鼠心脏组织中ROS含量, 并对Ⅰ型胶原 (Col1a1) 和Ⅲ型胶原 (Col3a1) 进行了mRNA和蛋白水平的分析.

2 材料与方法 (Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 主要试剂

H9C2细胞来自国家实验细胞资源共享平台 (中国, 北京); 低糖DMEM培养基购自Gibco公司; 胎牛血清购自Invitrogen公司; NaHSO₃、NALC购自Sigma公司; 提取总RNA时所用Trizol、反转试剂盒以及荧光定量PCR试剂均购自于Takara公司; 引物合成由上海英潍捷基生物有限公司完成; anti-GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology; anti-Col1a1、anti-Col3a1抗体均购自于Bioss公司; ROS检测试剂盒购自Beyotime公司; 其余试剂均为国产分析纯.

2.1.2 主要仪器

CO₂培养箱 (Thermo，美国)、SO₂自动监测仪 (万安迪FIX 550, 中国)、超低温冰箱 (Thermo，美国)、凝胶成像系统 (美国BIO-RAD公司)、蛋白核酸仪 (NanoDrop，美国)、IQ5 Real-Time PCR系统 (Bio-Rad，USA)、多功能酶标仪 (Thermo Scientific 3001，美国)、垂直电泳槽 (Bio-Rad 300，美国)、流式细胞仪 (BD Accuri)

2.2 体外染毒实验

H9C2细胞贴壁生长于含10%胎牛血清和1%青链霉素的低糖DMEM培养液中, 置于含5% CO₂, 37 ℃恒温培养箱中培养, 细胞生长至80%左右时, 将生长良好的细胞随机分为5组, 低糖DMEM培养液配制亚硫酸氢钠溶液至终浓度为100 μmol·L^-1, 加入H9C2细胞培养皿中, 染毒时间分别为3、6、12、24 h, 另设置对照组.

2.3 整体动物染毒实验

体重200 g左右的SPF级Wistar成年雄性大鼠21只, 购自河北实验动物中心, 随机分为3组, 每组7只, 分别为对照组、SO₂组、SO₂+NALC组.将受试大鼠置于体积为1 m³的箱体内, 12 h昼夜周期，外界温度为 (24±2) ℃, 湿度为50%±5%, 其中SO₂组和SO₂+NALC组暴露于7 mg·m^-3的SO₂中进行动式吸入染毒, 对照组接受过滤后的洁净空气.每天染毒4 h, 持续染毒28 d. SO₂自动监测仪实时监测箱体内SO₂浓度, 染毒期间禁水禁食, 其余时间自由进水进食. SO₂+NALC组自染毒之日起以腹腔注射的方式隔天注射50 mg·kg^-1 (b.w.) NALC, 对照组和SO₂组注射生理盐水.染毒结束后处死大鼠, 测定大鼠体重及心脏重量, 取部分心脏组织进行ROS测定, 其余组织放入液氮中速冻随后转入-80 ℃储存.

2.4 H9C2细胞ROS检测

细胞染毒不同时间 (0, 3、6、12、24 h) 后, 预冷的D-hanks洗细胞, 阳性对照组加阳性试剂于37 ℃孵育30 min, 其他组加等体积无血清培养基.孵育结束后加入胰酶消化, 600 g, 离心4 min, 弃上清, 加DCFH-DA探针于37 ℃避光孵育25 min, 弃上清, D-hanks洗细胞3次并重悬, 过滤, 流式细胞仪检测.

2.5 大鼠心肌细胞ROS检测

取50 mg大鼠心脏组织, 加入0.1 mol·L^-1 PBS缓冲液1 mL, 匀浆至无组织块. 4 ℃, 1000 g离心10 min, 取上清液用于蛋白浓度和ROS的测定.以BSA作为标准蛋白, 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度. 96孔板每孔加入190 μL上清液和10 μL 1 mmol·L^-1 DCFH-DA探针至终体积为200 μL. 37 ℃暗处孵育30 min.多功能酶标仪检测荧光值.

2.6 总RNA的提取与荧光定量PCR

取50 ~ 100 mg大鼠心脏组织或1×10⁶ H9C2细胞, 用Trizol提取组织或细胞总RNA, 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性, 确保OD260/280值处于1.8~2.0范围内, 取1 μg总RNA, 使用反转试剂盒合成cDNA, 将产物放置于-80 ℃备用. IQ5 Real-Time PCR系统进行扩增, 荧光定量PCR所用的引物序列见表 1. PCR反应体积为20 μL, 其中含有1 μL cDNA, 10 μL SYBR Premix Ex Taq, 上下游引物各1 μL, H₂O 7 μL.反应条件为：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 所有PCR扩增片段的大小均已经溴化乙啶染色的琼脂糖胶电泳证实.

2.7 总蛋白的提取与Western blot

取大鼠心脏组织50~80 mg或1×10⁶ H9C2细胞, 加入1 mL裂解缓冲液, 成分为:1% Nonidet P40, 1 mmol·L^-1 EDTA, 125 mmol·L^-1 sodium fluoride, 0.5 mmol·L^-1 sodium vanadate, 2.5 μg·mL^-1 aprotinin, 5 μg·mL^-1 pepstatin, 50 μg·mL^-1 leupeptin, 25 μmol·L^-1 PMSF, 25 μg·mL^-1 trypsin inhibitor.匀浆至无组织块后, 4 ℃, 13000 r·min^-1离心15 min, 取上清.以BSA作为标准蛋白, 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度, -80 ℃备用.Western blot检测目的蛋白表达水平: 50 μg蛋白上样量, 加蛋白上样缓冲液, 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白, 将蛋白电转至硝酸纤维素膜上, 封闭, 加对应的一抗与特定蛋白发生免疫反应, 4 ℃孵育过夜, 清洗一抗, 加荧光二抗与一抗结合, 清洗二抗, LI-COR Odyssey红外荧光系统扫描检测, 结果表示为目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值.

2.8 数据统计学处理

用SPSS 17.0对数据进行统计分析.图中结果以均值±标准误 (mean ± SE) 的形式表示, 用one-way ANOVA检验亚硫酸氢钠不同时间处理组与对照组、SO₂组与对照组、SO₂组与SO₂+NALC组之间的差异显著性.

3 结果 (Results) 3.1 亚硫酸氢钠对H9C2细胞ROS含量的影响

由图 1可知, 亚硫酸氢钠对H9C2细胞进行不同时间染毒处理以后, 细胞内ROS水平随着处理时间的延长而升高, 染毒3 h后H9C2细胞内ROS水平已发生显著升高, 染毒12 h时ROS水平达到峰值, 为对照组的4.27倍, 24 h组则为4.14倍, 该实验结果表明亚硫酸氢钠可显著诱导ROS的产生, 且呈现明显的时间效应关系.

3.2 亚硫酸氢钠对H9C2细胞Col1a1和Col3a1 mRNA转录水平的影响

由图 2可知, 使用亚硫酸氢钠对H9C2细胞进行不同时间染毒后, 细胞内Col1a1和Col3a1基因mRNA的转录水平基本一致, 且与对照组相比均没有统计学上的显著性.

3.3 亚硫酸氢钠对H9C2细胞Col1a1和Col3a1蛋白表达水平的影响

由图 3可知, 亚硫酸氢钠处理H9C2细胞不同时间以后, 与对照组相比, Col1a1的蛋白表达水平只有12 h组和24 h组显著升高, 分别为对照组的2.14倍和4.73倍; Col3a1的蛋白表达水平在不同时间染毒组均有显著升高, 分别为对照组的3.26、3.98、4.58和5.64倍.总体而言细胞内Col1a1和Col3a1蛋白表达水平均随着处理时间的延长而升高, 且呈现明显的时间效应关系.

3.4 SO₂暴露对大鼠体重及心体比的影响

由表 2可知, SO₂暴露导致大鼠的体重减轻, 心脏重量增加, 同时心体比显著升高, 表明SO₂暴露后大鼠相对心脏重量发生显著增加, 提示具有发生心肌肥大的潜在可能性.与SO₂组相比, SO₂+NALC处理组的心体比显著下降, 恢复至对照组水平.

3.5 SO₂暴露对大鼠心脏组织中ROS水平的影响

由图 4可知, SO₂暴露后大鼠心脏组织中ROS含量显著升高, 表明吸入SO₂后在动物心脏内产生了一定量的自由基.而NALC作为一种自由基清除剂显著减少了SO₂诱导机体氧化应激产生的ROS.

3.6 SO₂暴露对大鼠心脏组织中Col1a1和Col3a1mRNA转录水平的影响

由图 5可知, SO₂吸入后, 大鼠心脏组织中Col1a1和Col3a1的mRNA转录水平与对照组相比均没有显著变化, 这一结果与亚硫酸氢钠细胞染毒实验结果相似.

3.7 SO₂暴露对大鼠心脏组织中Col1a1和Col3a1蛋白表达水平的影响

由图 6可知, SO₂暴露后大鼠心脏组织中Col1a1和Col3a1的蛋白表达水平与对照组相比均显著升高, Col1a1蛋白表达量是对照组的4.42倍, Col3a1蛋白表达量是对照组的2.13倍. NALC处理后, 与SO₂组相比, Col1a1和Col3a1的蛋白表达水平下降十分显著, Col1a1蛋白表达量下降了72.6%, Col3a1蛋白表达量下降了22%, 这一结果表明NALC可有效抑制SO₂吸入后Col1a1和Col3a1蛋白表达的上升.

4 讨论 (Discussion)

心血管疾病是全世界范围内导致死亡发生的主要因素之一, 其发病率与死亡率连年增加, 流行病学研究显示空气污染物, 如SO₂、NOx、PM_2.5等与心血管疾病发病率和死亡率的升高密切相关 (Newby et al., 2015).与此同时, 由于SO₂及其衍生物被广泛地应用于食品工业 (Taylor et al., 1986) 以及制药原料 (Gunnison, 1981), 相关的调查研究也在逐渐增加.

据报道, 一个健康成年人血清中亚硫酸盐的平均浓度约为5 μmol·L^-1, 但在口服含有偏亚硫酸盐的蔬菜汁30 min以后血浆中亚硫酸盐的平均浓度可升高至112 μmol·L^-1 (Ji et al., 1995).同时, 实验室前期研究表明亚硫酸氢钠染毒浓度为100 μmol·L^-1时对细胞活力无明显影响, 染毒浓度高于100 μmol·L^-1(300 μmol·L^-1) 时细胞活力出现显著下降 (Qin et al., 2016), 故在本研究中选取100 μmol·L^-1作为亚硫酸氢钠染毒浓度.此外, 本研究选取7 mg·m^-3作为SO₂整体动物染毒浓度, 出于以下两点考虑:首先, 美国国家职业安全卫生研究所推荐的职业工作环境中SO₂浓度为0.5~20.0 mg·m^-3(Dutch Expert Committee on Occupational Standards, 2003).其次, 在本研究中动物每天暴露于SO₂的时间为4 h, 但实际情况下人或动物则是每天24 h暴露于污染的大气中.因此, 本研究使用的7 mg·m^-3高于人类嗅觉阈值, 与职业工作环境的浓度相一致 (Sang et al., 2010).

在本研究中, 亚硫酸氢钠体外染毒实验的荧光定量PCR结果表明亚硫酸氢钠并不会引起Col1a1和Col3a1在mRNA转录水平发生显著变化, 然而Western blot实验结果表明两种蛋白表达水平均有显著升高, 并且有显著的时间效应关系. SO₂整体动物染毒实验的结果与此相似, SO₂吸入后没有导致大鼠心脏组织中Col1a1和Col3a1在mRNA转录水平发生显著变化, 但二者的蛋白表达水平升高十分显著.研究表明SO₂可以引起机体的氧化应激, 在亚硫酸盐氧化过程中形成的以硫和氧为中心的自由基会参与细胞、组织和器官的氧化损伤过程 (Meng et al., 2003).我们的体内外实验结果也表明SO₂及亚硫酸氢钠引起的氧化应激显著诱导了心脏组织及体外培养H9C2细胞中ROS的产生.在SO₂暴露实验中, 我们加入了抗氧化剂NALC, 同时也是一种自由基清除剂.有报道指出腹腔注射50 mg·kg^-1 (b.w.) NALC时能有效抑制四氯化碳 (CCl₄) 及硫代乙酰胺 (TAA) 诱导的大鼠肝脏纤维化及肝损伤 (Nissar et al., 2013), 所以在本研究中采用了相同的NALC剂量, 结果表明NALC处理可显著降低SO₂在大鼠心脏内诱导的ROS.有研究指出在心衰、心肌肥大及纤维化模型中氧化应激显著增强 (Cucoranu et al., 2005), 产生大量ROS，而ROS能够刺激转化生长因子 (TGF-β1) 的释放和激活 (Li et al., 1999), TGF-β1是纤维化发生过程中的重要介导因子 (Biernacka et al., 2011), 它能够通过上调NADPH氧化酶的表达进一步诱导ROS的产生 (Cucoranu et al., 2005), Hu等 (2008)的研究表明TGF-β1与NADPH氧化酶介导产生的ROS之间存在正反馈调节, 其诱导产生的ROS能够激活下游的MAPK通路, 使得氧化还原敏感性转录因子发生转录, 诱导胶原蛋白的表达.提示SO₂吸入后可能通过产生ROS最终导致胶原蛋白表达的增加.同时, 我们的实验还观察到SO₂+NALC组Col1a1和Col3a1的蛋白表达水平与SO₂组相比显著降低.这一结果表明Col1a1和Col3a1蛋白表达水平的上升确实与SO₂及其衍生物所产生的ROS有关, 而NALC能够通过抑制ROS的产生而有效抑制SO₂吸入后Col1a1和Col3a1蛋白表达的上升.综合本研究中的体内外实验结果可以看出, SO₂及其衍生物会导致Col1a1和Col3a1蛋白表达水平的显著上调, 进而引起Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量的增多, 具体的发生机制仍需进一步实验研究证实.

此外, 本研究的体内与体外实验均发现SO₂及其衍生物处理后Col1a1和Col3a1在mRNA转录水平没有显著变化而蛋白水平则显著升高, 该实验结果提示SO₂及其衍生物诱导心肌细胞内Col1a1和Col3a1表达极有可能属于转录后水平调控.一般认为, 对mRNA成熟、降解、胞浆内定位等翻译起始前过程的调控称为转录后调控, 研究证实miRNA是基因转录后调控中起重要作用的一类分子. miRNA是19~26个核苷酸长度的非编码RNA, 能够介导转录后基因调节的发生 (Bartel et al., 2009).有研究表明miR-29家族可以调节Col1a1和Col3a1的表达 (Van Rooij et al., 2008).其他几种miRNA也被证实与胶原形成相关, 如Let-7i以及miR-26a能够分别作用于Col1a2和Col1a1以行使功能, 缓解胶原沉积 (He et al., 2016; Wei et al., 2013; Wang et al., 2015).我们推测SO₂及其衍生物可能会以转录后调控的方式调控Col1a1和Col3a1这两个蛋白的表达, 该过程可能与miRNA有关, 但尚需进一步实验研究证实.

5 结论 (Conclusions)

1) SO₂及其衍生物不会引起大鼠心脏组织及体外培养H9C2细胞中Col1a1和Col3a1 mRNA转录水平的显著变化.

2) SO₂及其衍生物暴露后大鼠心脏组织及体外培养H9C2细胞中Col1a1和Col3a1蛋白表达水平显著升高.

3) 抗氧化剂NALC能够显著抑制SO₂及其衍生物暴露后Col1a1和Col3a1蛋白表达的上升.