2. 中国科学院生态环境研究中心饮用水科学与技术重点实验室, 北京 100085;
3. 安徽省水利水电勘测设计院勘测分院, 合肥 230088
2. Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085;
3. Anhui Survey and Design Institute of Water Conservancy and Hydropower Branch, Hefei 230088
随着现代社会农业和工业的发展,大量的外源氮素进入到自然水体中.不同形态的氮素之间不断进行着转化,在微生物作用下,发生着复杂的氮循环过程,包括亚硝化、硝化、反硝化、硝酸盐异养还原和厌氧氨氧化(Jetten et al., 2009).其中,厌氧氨氧化反应是指在厌氧/缺氧的条件下,厌氧氨氧化细菌(Anammox bacteria)利用亚硝酸盐(NO2-)作为电子受体,将氨氮(NH4+)氧化为氮气(N2)的生物反应过程.
自然界中的厌氧氨氧化最早发现于海洋生态系统中(Dalsgaard et al., 2003),随后陆续在淡水生态系统(Wang et al., 2012)和陆地生态系统(Hu et al., 2011)中被发现.厌氧氨氧化细菌隶属于Brocadiales目的浮霉菌门,以往研究大多是针对厌氧氨氧化细菌的16S rRNA基因研究其多样性,然而直接针对厌氧氨氧化功能基因的研究能更全面反映一定环境下厌氧氨氧化细菌细菌的多样性及群落分布规律.联氨合成酶(Hydrazine synthase,HZS)是厌氧氨氧化发生的关键酶(Strous et al., 2006),负责编译其中一个亚基(hydrazine synthase β-subunit)的hzsB基因可作为厌氧氨氧化良好的生物标记,能更好地体现厌氧氨氧化细菌的群落多样性(Zhu et al., 2011).新一代高通量测序技术的发展,能在整体水平破译微生物的群落结构,并结合关键环境因子变化规律,反映微生物生理生态过程的分子调控机制(郑燕等,2013).
白洋淀处于华北平原中部,地理位置为东经115°38′~116°07′,北纬38°43′~39°02′,以芦苇植被为景观特征的水陆交错带湿地系统约占整个湖区面积的36%,苇地和水面的面积之比约为1∶3.5.随着历史变迁及人为活动的影响,白洋淀生态环境恶化严重.据调查,白洋淀多年平均总磷含量在0.02 mg·L-1以上,总氮含量在0.2 mg·L-1以上,大部分湖区处于富营养化状态(刘莎,2012;王瑜等,2011).课题组前期在白洋淀富营养化湖泊湿地沉积物中发现了厌氧氨氧化菌(王衫允等,2012),但目前尚无通过高通量测序技术研究富营养化湖泊陆向深层土壤厌氧氨氧化细菌群落分布的相关报道.
因此,本文选择河北安新县的白洋淀湖泊(典型富营养化湖泊)岸边作为研究地点,针对厌氧氨氧化功能基因hzsB在Illumina Hiseq 2500平台进行高通量测序,研究白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤的厌氧氨氧化细菌的多样性、群落结构及其与土壤环境因子的关系.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品采集与保存本研究于白洋淀湖区选取地理坐标为东经115°55′30″、北纬38°54′20″的岸边陆向采样(采样时间为2013年8月),分别采集距离湖岸交界处100 cm(A点)、300 cm(B点)、600 cm(C点)、1200 cm(D点)的60~80 cm及80~100 cm土壤层样品(图 1).采集后密封贮存于聚乙烯无菌自封袋中,4 ℃下运输至实验室,到达后立即测定其相关理化性质.剩余样品部分保存在4 ℃冰箱用于后期活性测定,部分经冷冻干燥后保存在-80 ℃超低温冰箱中用于DNA提取和后续分子生物学实验.
土壤样品相关指标依照《土壤农化分析》(鲍士旦,2000)中方法测定.其中,氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)是将土壤样品经2 mol·L-1的KCl溶液浸提1 h后,用0.45 μm微孔滤膜过滤后用连续流动分析仪测定(SAN plus,Skalar Analytical B.V.,Breda,the Netherlands).pH值是向土壤中加入超纯水使土壤与水的质量比为1∶5后测定.土壤550 ℃的烧失量(LOI550)代表土壤总有机质(TOM)(张文河等,2007).含水率(MC)以土壤在105 ℃下的失水量计算.总碳(TC)、总硫(TS)是将土壤冷干研磨过筛后用元素分析仪进行测定.样品的所有理化性质指标都进行3次重复测定,结果见表 1(取3次测定结果平均值).
称取约0.33 g经冷冻干燥处理的土壤样品,使用FastDNA Spin Kit for Soil DNA提取试剂盒(MP Biomedicals,USA)参照试剂盒使用说明提取样品中的总DNA,并用1%凝胶电泳检测提取的DNA质量,同时用Nano Drop 2000 UV-Vis Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific,USA)测定浓度.
2.4 PCR扩增和高通量测序针对厌氧氨氧化细菌的功能基因hzsB基因,采用HSBeta396F /HSBeta742R引物(Kartal et al., 2011;Harhangi et al., 2012)进行扩增(引物带有Barcode信息,用以区分样品),PCR扩增的50 μL体系(Wang et al., 2012)包括:10×buffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL,正反向引物(浓度为10 mmol ·L-1)各1 μL,BSA 0.5 μL,Taq 酶(2.5 U)0.25 μL,稀释DNA 模板2 μL,ddH2O 补足至50 μL.扩增条件为:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性60 s,59 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,35个循环.所得PCR产物经Promega Agarose Gel DNA(Promega,Madison,WI)纯化试剂盒纯化后用NanoDrop 2000测定浓度,等物质的量混合后,通过Hiseq 2500平台(Illumina,SanDiego,CA,USA)进行测序(诺禾致源生物信息科技有限公司,北京).
2.5 序列的生物信息分析序列的生物信息分析流程如下:①序列处理:测序完成后根据每个样品独立的Barcode信息,将得到的所有序列分配到每一个样品中,随后将Barcode信息及引物序列去除.通过Flash软件(Mago et al., 2011)按双端配对原则对每个样品的序列进行拼接;通过Qiime软件(Caporaso et al., 2010)对序列的质量进行控制,过滤掉低质量的序列和短序列;再通过Uchime软件(Edgar et al., 2011)检测并筛除在PCR过程中由于不完整的扩增得到的嵌合体序列.并且本研究是对厌氧氨氧化细菌的功能基因hzsB基因进行的扩增子测序,测序过程中可能存在的测序错误或碱基缺失,将导致基因阅读框移码.使用Framebot工具(Wang et al., 2013)及进行人工查找和处理,对可能存在的移码进行检测和修正.通过Mothur软件(Schloss et al., 2009)得到非冗余的核酸序列,并利用Bioedit软件翻译成氨基酸序列.通过Uclust软件(Edgar et al., 2010)将序列按90%相似度,进行聚类得到OTUs分布.②基于OTUs的生态学分析:通过自写Perl脚本及Mothur软件分析样品的α-多样性及β-多样性等.
2.6 系统发育分析挑选每个OTUs的代表序列用Mega6.0工具(Tamura et al., 2013)以邻接法(Neighbour-Joining,NJ)建立系统发育树分析,以最大复合似然法计算进化距离,并通过1000次重复的自展分析测量拓扑树的鲁棒性,自展值大于50(即重复结果超过500次)展示在进化枝上.
2.7 数据分析利用SPSS 21.0软件进行相关性分析(均采用Pearson相关系数);群落的分类和排序均基于Bray-Curtis差异度指数,分类采用UPGMA算法(Mothur计算),排序采用主坐标分析(Principle Coordinate Analysis,PCoA);利用Origin 9.0软件作图.
3 结果(Results) 3.1 厌氧氨氧化细菌的高通量测序结果白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤样品(A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2)提取DNA后,针对hzsB基因进行PCR扩增并在Illumina 2500 Hiseq平台进行高通量测序.每个样品得到10000条序列,共80000条.使用Qiime、Uchime、Mothur、Framebot等生物信息软件对序列进行严格质量控制.通过在NCBI(National Center of Biotechnology Information)获取纯培养和非冗余环境样品hzsB基因序列,并建立本地hzsB基因序列数据库进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对,结果表明,质控后的序列均为厌氧氨氧化细菌的序列.质控后的高质量序列条数和在相似度为90%下进行聚类,得到OTUs数及覆盖率分布情况(表 2).
从表中的统计结果可以看到,80000条原始序列进行一系列质控处理后得到的高质量序列条数分别为9648、9618、9741、9447、9715、9663、9684和9565(序列平均读长为292 bp).样品中OTUs数的范围为15~39,覆盖度均在99.9%以上.
以每次随机挑选500条序列进行累加的方法计算各样点厌氧氨氧化细菌的稀释曲线(图 2).可以看出,起初随着测序数量的增加,OTUs数量迅速增加;而随着测序条数的进一步增大,样本中 OTUs的个数增加渐渐趋于平缓,稀释曲线的平滑程度高,表示对白洋淀陆向深层土壤样品进行高通量测序的结果覆盖度很高,取样充足,结果与覆盖率指数相符.
本研究中考察的α-多样性指标(OTUs水平)有丰富度指数(Chao1指数),表示一个群落或生境中物种数目的复杂度,值越高说明群落内物种的数目越多;优势度指数(Simpson指数)表示一个群落或生境中优势种的地位和作用,值越高说明群落内物种数量分布越不均匀,优势种的地位越突出;多样性指数(Shannon指数)是表示物种丰富度和物种均匀度的综合指标,其中,均匀度指一个群落或生境中全部物种个体数目分配的均匀程度.在计算各指标前,对样品进行了重取样(Rousk et al., 2010),使各样品的序列数量一致,计算结果见表 3.由表 3可知,白洋淀陆向深层土壤样品中,Chao1 指数最高的是B1(41.50),最低的是C1(21.00);Shannon指数最高的是D2(2.09),最低的是D1(1.16);Simpson指数最高的A2(0.46),最低的是D2(0.17).
比较各样点的α-多样性指数发现,不同地点间的多样性差异较大,而同一地点的上下两层的多样性差异较小(除D点).在靠近湖岸界面处(A点和B点),厌氧氨氧化细菌在上层土壤样中的多样性要大于下层土壤(A1的Shannon指数为1.50,大于A2的1.31,B1的Shannon指数为1.87,大于B2的1.75);而远离湖岸界面处(C点和D点)多样性分布规律则发生改变,厌氧氨氧化细菌在上层土壤的多样性要低于下层的多样性(C1的Shannon指数为1.48,小于C2的1.78,D1的Shannon指数为1.16,小于D2的2.09).
将厌氧氨氧化细菌的α-多样性指标与土壤的理化性质作相关性分析(表 4),结果发现,在白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中,厌氧氨氧化细菌的丰富度 Chao1指数与MC呈负相关(r=-0.623,p=0.099).厌氧氨氧化细菌的多样性Shannon指数与NH4+呈负相关(r=-0.680,p=0.064);厌氧氨氧化细菌的优势度Simpson指数与NH4+呈正相关(r=0.631,p=0.093).
用于厌氧氨氧化细菌群落β-多样性分析的数据与α多样性分析的数据相同.在OTUs水平计算白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤样品的Bray-Curtis差异度矩阵,进行厌氧氨氧化细菌的群落排序(图 3),两轴对排序结果的解释度分别为50.0%及31.2%.结果表明,在白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤样品中,靠近湖岸界面的样点(A点和B点),各自不同深度的2个样品距离较近,表明A1和A2及B1和B2的厌氧氨氧化细菌的群落结构更相似;而距离湖岸界面较远的样点(C点和D点),各自不同深度的2个样品距离较远,表明C1和C2的厌氧氨氧化细菌的群落结构及D1和D2的厌氧氨氧化细菌的群落结构差异均较大.这个结果与白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤样品的聚类结果(图 4)类似.
白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤厌氧氨氧化细菌的所有序列通过Uclust软件在90%相似度下进行聚类,共得到40个OTUs,挑出每个OTUs的代表氨基酸序列,并加入Genbank数据库中已探明的纯培养厌氧氨氧化细菌的hzsB基因氨基酸序列作为参比序列,用Mega 6.0软件以邻接法(NJ)建立系统发育树(图 5).
系统发育结果显示,序列主要可以分成6个组,包括厌氧氨氧化细菌的已知纯培养序列的5个分类:Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’(Group 1)、Candidatus ‘Scalindua sp.’(Group 2)、Candidatus ‘Kuenenia sp.’(Group 3)、Candidatus ‘Brocadia fulgida’(Group 4)、Candidatus ‘Jettenia sp.’(Group 5),以及相当一部分处于发育树的外枝的序列(Group 6),它们和所有已探明纯培养hzsB基因序列亲缘关系均较远,可能为未分离或培养的区别于已知菌种的新型厌氧氨氧化细菌,这里将这一部分序列所在组命名为Anammox-like cluster.
根据每个OTUs的代表序列在系统发育树中的位置,对代表序列对应的OTUs中的样品序列进行注释并计算每个样点中厌氧氨氧化细菌群落组成的相对丰度(图 6).结果为:在白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤共8个样品,序列隶属于Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’占34.07%,Candidatus ‘Brocadia fulgida’占24.66%,Candidatus ‘Jettenia sp.’占3%,Candidatus ‘Scalindua sp.’和Candidatus ‘Kuenenia sp.’则分别占0.08%和0.22%,Anammox-like cluster占37.98%.不同样点的厌氧氨氧化细菌的群落组成差异较大,其中,Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’在C1中所占比例最大(80.40%),在A2中所占比例最小(10.19%);Candidatus ‘Brocadia fulgida’在B2所占比例最大(45.6%),在D1所占比例最小(9.42%);Candidatus ‘Jettenia sp.’在C2中所占比例最大(7.26%),在D1中所占比例最小(0.29%);Candidatus ‘Scalindua sp.’和Canditatus ‘Kuenenia sp.’在所有样品中所占比例都很小;Anammox-like cluster在A2所占比例最大(66.75%),在D1中所占比例最小(占0.01%).
从水平沿程分析,近湖岸界面处样品中(A1、A2、B1、B2)Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’所占比例要小于远湖岸界面处样品(C1、C2、D1、D2),Candidatus ‘Jettenia sp.’所占比例与远湖岸界面样品持平,其他种属则大于远湖岸界面处样品.从垂向分布分析,白洋淀陆向深层土壤中Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’在上层土壤(A1、B1、C1)除D点均超过在下层土壤(A2、B2、C2)所占比例,Anammox-like cluster在上层土壤所占比例与下层土壤所占比例基本持平,其他种属则小于下层土壤所占比例.
厌氧氨氧化细菌的群落结构在样品中的分布详情(OTUs水平)则通过热图展示(图 7),其中,每个方块代表一个OTUs,方块的颜色代表该OTUs下分配得到的序列丰度水平(颜色从蓝-绿-黄-红,代表序列丰度由低到高),右边为对OTUs下序列的注释结果.结果表明,在OTUs水平下,各样点的厌氧氨氧化细菌群落差异较大(即每个样点下的每个OTUs中分配得到的序列丰度差异较大,表现为色块颜色排布规律不同).其中,C1的群落结构与其他所有点的差异都很大.
3.5 厌氧氨氧化细菌群落与土壤理化性质相关性分析根据每个样点厌氧氨氧化细菌的群落组成与土壤的理化性质做相关性分析,确定关键环境因子对Anammox群落结构的重要影响(表 5).结果发现,在所测样品中,Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’与TC(r=0.705,p=0.051)及TS(r=0.681,p=0.063)呈正相关,Candidatus ‘Brocadia fulgida’与MC(r=-0.670,p=0.069)呈负相关,其他属与所测土壤理化指标无相关性.表明在白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中,土壤理化指标在一定范围内,高TC及TS含量与厌氧氨氧化细菌群落组成中Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’的富集呈正相关,而低MC则有利于群落组成中Candidatus ‘Brocadia fulgida’的优势生长.
本文应用新一代高通量测序技术,针对厌氧氨氧化细菌的功能基因hzsB进行扩增,较全面地考察了典型富营养化湖泊(以白洋淀为例)陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的群落组成,从不同生态学层次:α-多样性、β多样性、群落组成及其与环境因子的关系进行分析.
在计算厌氧氨氧化细菌的α-多样性时,由于各指数计算方法的不同,不同指标给出的结果略有差异.本文结果中丰富度Chao1指数最高的样点,多样性Shannon指数并不是最高;同样,多样性最高的样点,丰富度也不是最高,如B1的Chao1指数最高,但其Shannon指数为1.87,最大值为2.09;D2的Shannon指数最高,但其Chao1指数为35.00,最大值为41.50.原因是虽然B1中厌氧氨氧化细菌的群落组成最复杂,但由于群落个体数目的分布不均匀,而D2中虽群落组成不是最复杂,但其群落组成分布均匀,由此得到上述结果.
对厌氧氨氧化细菌生物多样性的考察在全世界范围内已有很多报道.有研究表明,厌氧氨氧化细菌在海洋生态系统中,多样性处于较低水平(Schmid et al., 2007).而在陆地生态系统中处于较高水平(Francis et al.,2007),大量的研究结果显示,在存在厌氧氨氧化细菌的环境中,大多水相中的厌氧氨氧化细菌的群落多样性要低于土壤中的多样性.本文研究表明,白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的多样性处于较高水平.在靠近湖岸交界处,上层土壤样品的多样性要高于下层土壤;而在远湖岸交界处则相反.样点厌氧氨氧化细菌的丰富度Chao1指数与MC呈负相关,多样性Shannon指数与NH4+呈负相关,Simpson指数与NH4+呈正相关,这里NH4+与Shannon指数及Simpson指数的相关性关系呈相反结果也符合指标含义.且靠近湖岸界面处样点土壤不同深度的厌氧氨氧化细菌的群落结构更相似,而远离湖岸交界处样点土壤不同深度的厌氧氨氧化细菌的群落结构差异较大.
造成以上结果可能的原因是:本研究中近湖岸交界处深层土壤的NH4+来源主要是湖水的横向渗透作用,湖水有涨有落,下层土壤处于常年被湖水淹没的“保守区”,湖水中的NH4+优先吸附于下层土壤,故近湖岸交界处的下层土壤NH4+含量要高于上层土壤;而由于NH4+是大分子易被土壤吸附,较难在土壤中发生迁移,远湖岸交界处深层土壤的NH4+主要来源于表层土壤中NH4+的下渗作用,而不是湖水的横向渗透作用,故远湖岸交界处上层土壤NH4+含量要高于下层土壤.由于NH4+是厌氧氨氧化反应的重要底物,高NH4+更易于厌氧氨氧化细菌的富集生长,从而形成厌氧氨氧化反应发生“热区”,本研究中高NH4+导致了厌氧氨氧化细菌的低群落多样性,这与以往研究中发现自然界中功能较强的生态系统中物种多样性往往很低相一致(Loreau et al., 2001).并且在一定范围内厌氧氨氧化细菌的丰富度Chao1指数与含水率(MC)呈负相关也在一定程度上符合水相环境中的厌氧氨氧化细菌群落多样性要小于土壤中的多样性的规律,这可能是由于土壤的异质性强导致的结果.另外,有研究表明岸边带湖泊水能向陆地延伸至18 m(Triska et al., 1993),即白洋淀湖泊岸边陆向(延伸12 m)深层土壤中的水分大部分来自湖水的横向渗透作用,小部分是来自是表层土壤的雨水下渗作用.水是土壤中物质发生交换与微生物进行新陈代谢的良好载体,靠近湖岸界面处的土壤,水分迁移作用激烈,土壤间物质交换作用远大于远湖岸界面处的土壤.故近湖岸交界处土壤间差异要小于远湖岸界面处的土壤,厌氧氨氧化细菌的群落结构也更相似.
目前对厌氧氨氧化细菌在自然环境中的群落组成的研究结果也丰度多样.在海洋生态系统中发现的厌氧氨氧化细菌基本都严格隶属于Candidatus ‘Scalindua sp.’(Schmid et al., 2007);在淡水生态系统中,厌氧氨氧化细菌群落组成较为多样,如在坦噶尼喀湖和鹿蹄草湖(美国)发现的厌氧氨氧化细菌大多隶属于Candidatus ‘Scalindua sp.’(Schubert et al., 2006;Penton et al., 2006),在新沂河(中国)发现的厌氧氨氧化细菌则大多隶属于Candidatus ‘Brocadia sp.’(Zhang et al., 2007),在地下水中厌氧氨氧化细菌组成有Candidatus ‘Brocadia sp.’、Candidatus ‘Jettenia sp.’、 Candidatus ‘Scalindua sp.’及Candidatus ‘Kuenenia sp.’;在陆地生态系统中,厌氧氨氧化细菌组成也较丰富,包含Candidatus ‘Brocadia sp.’、Candidatus ‘Jettenia sp.’、 Candidatus ‘Scalindua sp.’及Candidatus ‘Kuenenia sp.’(Humbert et al., 2010).本研究表明,白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的群落结构为:Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’(34.07%)、Candidatus ‘Brocadia fulgida’(24.66%)、Candidatus ‘Jettenia sp.’(3%)、Candidatus ‘Scalindua sp.’(0.08%)和Candidatus ‘Kuenenia sp.’(0.22%),以及Anammox-like cluster(37.98%),组成较为多样.文中Anammox-like cluster的这部分序列与目前Genbank中已探明的厌氧氨氧化细菌hzsB氨基酸序列相似性较低(< 90%),很可能区别于已知菌种成为新型厌氧氨氧化细菌,这与Nie等(2015)研究结果相似.另外,有研究表明,Hiroshima Bay 海洋沉积物中的Candidatus ‘Scalindua sp.’对亚硝酸盐有更高的亲和力(Awata et al., 2013),这与本研究中Candidatus ‘Scalindua sp.’与土壤环境因子均无相关性的结果有所不同,可能的原因是海洋环境和陆地土壤环境差异较大,复杂的陆地环境中Candidatus ‘Scalindua sp.’可能与海洋高盐环境下的Candidatus ‘Scalindua sp.’代谢途径不同.TC含量与Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’的相对丰度呈正相关,可能的原因是厌氧氨氧化细菌中的Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’对TC的需要更大,但厌氧氨氧化细菌是化能自养型微生物(Strous et al., 1998),主要利用的是无机碳,Candidatus ‘Brocadia anammoxidans’利用无机碳的代谢机理及与TS含量呈正相关的规律还有待深入研究.
总之,本文针对厌氧氨氧化功能基因hzsB扩增进行高通量测序,在一定程度上揭示了具有富营养化特征的白洋淀湖泊岸边陆向深层土壤中厌氧氨氧化细菌的多样性、群落组成及其与部分土壤环境因子的关系.但厌氧氨氧化细菌与土壤关键环境因子的生物调控机理及与其他指标(如溶解氧、氧化还原电位、温度等)的关系还有待深入研究.
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