1 引言(Introduction)

亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化(nitrite-dependent denitrifying anaerobic methane oxidation，n-damo)是指微生物在厌氧条件下，以甲烷作为电子供体还原亚硝态氮的过程(式1)(Raghoebarsing et al.，2006; 范秋香等，2015).n-damo过程为低物耗废水脱氮处理提供了新思路.近年来，随着厌好氧相结合的废水处理工艺的推广，存在一些不容忽视的问题，如好氧段出水C/N低，需投加额外碳源满足反硝化工艺，厌氧消化出水伴随大量甲烷的释放等，这些问题最终导致出水水质难以达标，同时加剧了温室效应.n-damo功能微生物能够原位利用厌氧消化产生的甲烷进行深度脱氮，减少甲烷的排放，同时降低碳源的需求.2006年，荷兰Raghoebarsing等从运河底泥首次富集出能将甲烷厌氧氧化耦合硝酸盐还原过程的微生物群落(Raghoebarsing et al.，2006)，随后Ettwig等(2008年)证实n-damo过程可由归属于NC10门的细菌Candidatus Methylomirabilis oxyfera独立完成，在此基础上多个课题组相继富集得到了n-damo功能微生物，如Yuan Zhiguo课题组以淡水湖泊底泥、污水厂回流污泥以及厌氧消化污泥的混合物作为接种源利用SBR反应器进行富集(Hu et al.，2009)，Hu以河流底泥作为接种源利用SBR反应器富集(He et al.，2013)，Kampman课题组利用MBR反应器以污水处理厂污泥为接种源富集(Kampman et al.，2014b)，均得到n-damo功能微生物.

(1)

然而n-damo过程功能菌生长缓慢，倍增时间长达数周甚至数月，且代谢活性较低(0.9~3.7 nmolNO₂^-·min^-1·mg蛋白质^-1)(Ettwig et al.，2010; Kampman et al.，2012)，这阻碍了对n-damo过程的深入研究和实际应用(Raghoebarsing et al.，2006; Wu et al.，2016; 何崭飞等，2012)，为提高n-damo过程反硝化速率，国内外多个课题组研究了反应器构型(Wang et al.，2016)，电辅助手段(Wu et al.，2016)，微量元素(He et al.，2015a)等对n-damo过程的影响.同样为提高n-damo过程反硝化速率，研究者也研究了环境因素对n-damo过程的影响(Wang et al.，2016; Wu et al.，2016; 范秋香等，2015; 何崭飞等，2012)，然而受反应器构型，接种物来源，接种量等的影响，不同n-damo微生物对环境的响应不尽相同.

本研究以本课题组前期采用太湖底泥为接种源以微孔曝气膜生物反应器(Membrane biofilm reactor，MBfR)富集得到的n-damo功能微生物为研究对象(Wang et al.，2016)，着重探讨温度、pH值、甲烷分压和亚硝酸盐初始浓度对n-damo功能微生物亚硝酸盐还原速率的影响，进而探讨n-damo菌的最适生长条件，为进一步强化n-damo过程奠定基础.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 n-damo富集培养物的来源

n-damo富集培养物取自MBfR反应器(Wang et al.，2016)，其最初接种源来自我国东太湖的湖底沉积物(31°01.26＇N，120°27.044＇E)，采用MBfR反应器进行，经过13个月的富集培养，成功富集了n-damo细菌.

2.2 n-damo富集物功能菌的分子鉴定 2.2.1 功能菌的系统发育分析(16S rRNA基因克隆文库)

采用PowerSoil DNA Isolation试剂盒(MO-BIO公司)进行n-damo富集物DNA的提取.利用特异性引物对202F/1545R和qP1F/qP2R(Ettwig et al.，2009; Juretschko et al.，1998)对已提取的基因组DNA进行巢式PCR扩增，同时设置阴性对照.PCR产物采用Wizard PCR产物纯化试剂盒(Promega公司)进行纯化，将纯化后的PCR产物送至上海生工生物技术有限公司测序.

2.2.2 功能菌的相对丰度鉴定(FISH法)

n-damo功能菌的富集程度采用荧光原位杂交(FISH)法检测.利用NC10特异探针S-^*-DBACT-1027-a-A-18(Raghoebarsing et al.，2006)和通用细菌探针S-D-Bact-0338-a-A-18(Daims et al.，1999)与不同阶段的n-damo培养物进行杂交，选取时段分别为初始接种物和13个月后的富集培养物，用荧光显微镜检测功能微生物的丰度.

2.3 n-damo富集物的过程影响因素实验 2.3.1 摇瓶培养

本实验主体装置为有效体积120 mL的透明血清瓶，采用丁基胶塞密封，便于多次采样.

用氮吹仪向120 mL血清瓶吹氮5 min，保证瓶内厌氧.将无机盐培养液灭菌除氧，然后在氮吹下冷却并调节pH至7.2~7.5左右.培养液成分为：0.00625 g·L^-1 EDTA、1.25 g·L^-1 KHCO₃、0.2 g·L^-1 MgSO₄·7H₂O、0.3 g·L^-1 CaCl₂·2H₂O、0.00625 g·L^-1 FeSO₄·7H₂O、0.05 g·L^-1 KH₂PO₄、0.5 mL·L^-1微量元素.微量元素:15 g·L^-1 EDTA、0.99 g·L^-1 MnCl₂·4H₂O、0.43 g·L^-1 ZnSO₄·7H₂O、0.19 g·L^-1 NiCl₂·6H₂O、0.24 g·L^-1 CoCl₂·6H₂O、0.05 g·L^-1 Na₂WO₄·2H₂O、0.014 g·L^-1 H₃BO₃、0.25 g·L^-1 CuSO₄·5H₂O、0.22 g·L^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.067 g·L^-1 SeO₄(Ettwig et al，2008).在厌氧操作台中向血清瓶倒入20 mL n-damo富集培养物和100 mL新鲜培养液，将血清瓶压盖密封.静置沉淀24 h后，排液法向瓶内充40 mL纯度99.99%甲烷.向血清瓶中注入NaNO₂贮备液至特定浓度，将血清瓶置于30 ℃恒温培养箱内，磁力搅拌培养，转速为160 r·min^-1，通过搅拌提高气液传质，驯化培养，体系稳定后开始影响因素实验，每批实验结束后，将微生物混合均匀分装进行下批实验.

2.3.2 实验设置

本研究设置了4个实验，分别研究温度、pH、甲烷分压、亚硝酸盐初始浓度对于n-damo过程的影响，实验1~4的操作条件如表 1所示，每个条件设置3个平行，温度条件通过恒温箱控制，pH值通过添加稀盐酸和氢氧化钠溶液调控，甲烷分压通过调节顶空甲烷和氮气的体积比例控制，亚硝酸盐初始浓度通过添加不同体积的亚硝酸盐贮备液调控.

将血清瓶放在恒温培养箱，做避光处理，磁力搅拌，每隔一定时间取1 mL血清瓶内液体检测亚硝酸盐浓度，记录实验数据，以亚硝酸根消耗速率表征反硝化速率.

2.3.3 检测分析方法

本研究中亚硝酸根浓度采用离子色谱仪(ICS-1100，Dionex)检测，pH用精密pH计(SG98-ELK，Mettler Toledo)测量.本实验中数据分析和绘制均采用Excel 2010.

对于甲烷分压和亚硝酸盐初始浓度的影响分别依据公式(2)和公式(3)采用Origin 9.2拟合.

(2)

(3)

式中，r为NO₂^-的消耗速率(μmol·h^-1)；r_max为甲烷分压影响实验中NO₂^-的最大消耗速率(μmol·h^-1)； K_CH4为CH₄的亲和系数(kPa)；P_A为CH₄的分压(kPa)； r′_max为NO₂^-初始浓度影响实验中NO₂^-的最大消耗速率(μmol·h^-1)；S_NO2^-为NO₂^-的浓度(mmol·h^-1)； K_NO2^- 为NO₂^-的亲和系数(mmol·h^-1)； K′_NO2^- 为NO₂^-的抑制系数(mmol·h^-1).

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 n-damo富集物功能菌的分子生物学鉴定结果

对NC10门细菌16S rRNA基因的巢式PCR第二段产物进行克隆文库的构建，随机挑选10个克隆子进行测序，获得9个阳性测序结果.将目的序列在NCBI Genebank中进行比对，获取与本研究目的序列相似度较高的若干条参比序列.采用MEGA5.0软件对本研究中目的序列和参比序列进行比对并构建系统发育树，明晰其系统分类情况.

图 1中第4行代表本研究的目的序列，9条序列相似度在99%以上(大于97%水平上聚为同一个操作分类学单位operational taxonomic units，OTU)，该OTU位于Candidatus Methylomirabilis oxyfera系统发育分支，且与其它淡水湖泊沉积物生境中的n-damo功能菌序列亲缘关系较近，例如钱塘江沉积物(Shen et al.，2014)、白洋淀湖泊沉积物(Zhu et al.，2015)等，证实本研究所涉及的功能菌为n-damo细菌.

3.2 荧光原位杂交(FISH)分析

采用NC10特异探针S-^*-DBACT-1027-a-A-18(Cy3，显红色)和通用细菌探针S-D-Bact-0338-a-A-18(Cy5，显蓝色)杂交，并通过NIS-Elements软件包进行荧光原位杂交分析，具体操作方法参考已有文献(Ettwig et al.，2008; Ettwig et al.，2009).如图 2所示，玫红色位点为NC10门细菌，在初始接种物中，杂交信号很少，在富集到13个月后，NC10门细菌的相对丰度达到73%左右.该结果可以初步表明MBfR中NC10门细菌富集成功.

3.3 n-damo过程影响因素结果分析 3.3.1 温度对n-damo过程反硝化速率的影响

不同温度条件的n-damo反硝化速率如图 3a所示，25、35、45 ℃所对应的n-damo反硝化速率分别为(4.069±0.411)、(6.433±0.929)、(3.800±0.100)μmol·h^-1.温度为35 ℃时，n-damo反硝化速率最大，在25~35 ℃，温度提高10 ℃，温度系数(Q₁₀)为1.58，接近厌氧污泥在该范围内的Q₁₀(1.48)(施汉昌，2014)，温度为45 ℃时，n-damo反硝化速率最小，表明高温不利于n-damo过程的进行.

Kampman等于2014年研究了n-damo过程在低温废水处理过程中应用的可行性，结果表明，最适宜n-damo微生物生长的环境温度与其最初的富集条件温度有关，富集条件为20~25 ℃和25~30 ℃时，最适环境温度分别为21 ℃和30 ℃(Kampman et al.，2014a)，何崭飞等于2015年通过短期和长期实验表明在15~45 ℃的环境温度下，最适宜n-damo微生物生长的环境温度为35 ℃(He et al.，2015b)，Yuan Zhiguo等发现在45 ℃条件下，反应器运行90 d后不再进行反硝化作用(Hu et al，2009).

迄今，各课题组n-damo过程的富集温度均为20~30 ℃(Cai et al.，2015; Ettwig et al.，2008; Ettwig et al.，2009; Kampman et al.，2012; Luesken et al.，2011; Raghoebarsing et al.，2006; Sun et al.，2013; Zhu et al.，2012).本研究中，富集温度条件控制在35 ℃左右更有利于n-damo过程的进行，但考虑到n-damo微生物生长的最适环境温度与其最初的富集条件温度有关，富集温度控制在20~25 ℃可能更有利于n-damo过程应用于低温污水处理，因此需根据实际需求调控n-damo微生物的富集温度.

3.3.2 pH对n-damo过程反硝化速率的影响

不同pH条件下的n-damo反硝化速率如图 3b所示，pH值从5.5增大到9.5，n-damo反硝化速率先增大后减小，pH值为7.5时，n-damo反硝化速率最大，为(7.350±1.768)μmol·h^-1；pH值为5.5和6.5时，n-damo反硝化速率分别为(2.750±0.354)μmol·h^-1和(2.900±0.283)μmol·h^-1，pH值为8.5和9.5时，反硝化速率分别为(4.100±1.556)μmol·h^-1和(3.650±0.636)μmol·h^-1，相较偏酸性条件，n-damo功能微生物更适应偏碱性条件.

目前，已报道的n-damo菌的富集培养液pH值均为6.0~8.0之间(Cai et al.，2015; Ettwig et al.，2009; Luesken et al.，2011; Raghoebarsing et al.，2006; Sun et al.，2013; Wang et al，2016; Zhu et al.，2015)，寻找一个最适的pH值将有利于n-damo反硝化速率的提高.2012年，研究者研究了pH值在5.9~7.4范围对n-damo反硝化速率的影响(Zhu et al.，2012)，本研究添加了pH值为8.5和9.5的碱性条件，结果显示偏碱性条件下，反硝化速率较低，中性条件(pH值为7.5)时，n-damo过程反硝化速率最大.

3.3.3 甲烷分压对n-damo过程反硝化速率的影响

甲烷是n-damo过程唯一的碳源和能源，在水中溶解度很低，其溶解度受甲烷分压影响，本文探究了不同甲烷分压条件下的n-damo反硝化速率，如图 3c所示，通过Monod方程拟合得到r_max和K_CH4，分别为3.42 μmol·h^-1和43.43 kPa，甲烷分压在0 ~98 kPa，n-damo反硝化速率随着甲烷分压的增大而增大，甲烷分压从0 kPa增大到49 kPa，反硝化速率增长较快，甲烷分压从49 kPa增大到98 kPa，反硝化速率增长减缓.

由此说明，当甲烷分压低于49 kPa时，增加甲烷分压有利于增大n-damo过程反硝化速率，而当甲烷分压高于49 kPa时，增大甲烷分压对n-damo过程进行影响不明显.本研究中，当甲烷分压为49 kPa时，可达到分压为98 kPa反硝化速率的78%，可认为此时甲烷分压基本满足n-damo过程进行甲烷的需求量.当甲烷分压达不到要求时，为提高甲烷的传质效率，Fu等采用5%的石蜡油(V/V)混合培养液提高甲烷在混合液中的溶解度，进而使得n-damo反硝化速率提高了1倍(Fu et al.，2015)，研究者也采用MBfR进行无泡曝气，提高甲烷的传质效率(Cai et al.，2015; Sun et al.，2013; Wang et al.，2016).而He等(2012年)针对SBR反应器富集的n-damo微生物研究结果显示K_CH4为14.8 kPa，而本实验富集物取自MBfR，K_CH4(43.43 kPa)较高，由此说明，甲烷分压对于本研究中的的n-damo富集物影响更大，且本研究中n-damo富集物更适应高甲烷分压环境，可能是由于MBfR反应器能够进行无泡曝气，提高甲烷的传质，促进n-damo菌对于甲烷的吸收.在实际n-damo富集过程中若甲烷分压控制在49 kPa以上，并结合较好的甲烷供给手段，可能更有利于n-damo过程的进行.

3.3.4 亚硝酸盐初始浓度对n-damo过程反硝化速率的影响

不同亚硝酸盐初始浓度时反硝化速率如图 3d所示，Monod拟合结果为K＇_NO2^-和K′_NO2^-分别为1.90 mmol·L^-1和6.16 mmol·L^-1，亚硝酸盐浓度为3.42 mmol·L^-1时，反硝化速率最大.亚硝酸盐初始浓度从0 mmol·L^-1增大到4.43 mmol·L^-1时，n-damo反硝化速率先增大后趋于平稳，最后逐渐减小，初始浓度从0 mmol·L^-1增大到2.40 mmol·L^-1时，n-damo反硝化速率增长较快；初始浓度从2.40 mmol·L^-1增大到3.42 mmol·L^-1时，n-damo反硝化速率增长缓慢趋于平稳；当亚硝酸盐初始浓度大于3.42 mmol·L^-1时，n-damo反硝化速率开始呈下降趋势.

分析实验结果可得，在其他条件均满足n-damo细菌生长代谢时，亚硝酸初始浓度偏低(小于2.40 mmol·L^-1)，亚硝酸盐浓度成为限制n-damo过程的关键因素，亚硝酸盐初始浓度约为2.40 mmol·L^-1左右，反硝化速率基本达到最大值，而当亚硝酸盐浓度大于3.42 mmol·L^-1时，反硝化速率呈现下降趋势，高浓度会对n-damo过程产生抑制，因此最适宜n-damo过程的亚硝酸盐初始浓度为2.40~3.42 mmol·L^-1.

何崭飞等于2013年利用Monod方程对n-damo富集物进行亚硝酸盐初始浓度影响的动力学研究，数据拟合结果为K_NO2^-和K′_NO2^-分别为0.91 mmol·L^-1和4.10 mmol·L^-1，亚硝酸盐浓度为1.92 mmol·L^-1时，反硝化速率最大，最适宜n-damo微生物生长的亚硝酸盐浓度为1~3 mmol·L^-1(He et al.，2013)，而本实验富集物，K_NO2^-(1.90 mmol·L^-1)和K′_NO2^-(6.16 mmol·L^-1)较大，对高浓度亚硝酸盐的耐受性较好，在富集过程中，适当提高亚硝酸盐浓度，有利于提高n-damo富集物活性.

以上影响因素的研究与其他课题组的研究成果比较见表 2，受富集物种泥来源、接种量、富集装置等因素的影响，各自的n-damo过程最适条件不尽相同.因此本研究以本课题组n-damo富集物为对象，较为全面地研究了环境条件对n-damo过程的影响.

4 结论(Conclusions)

1) 16S rRNA基因克隆文库结果表明，本研究的n-damo富集培养物菌群与NC10门细菌具有较高的相似性，FISH结果表明，经过13个月的富集培养，n-damo功能菌丰度可达73%.

2) 在25、35、45 ℃条件下，温度为35 ℃时，n-damo反硝化速率最大.pH值为7.5时，n-damo过程反硝化速率最大，且相较偏酸性条件，n-damo更适应偏碱性条件.甲烷分压低于49 kPa时，增加甲烷分压有利于增大n-damo过程反硝化速率；甲烷分压高于49 kPa时，增大甲烷分压对n-damo过程进行影响不明显.偏低的亚硝酸盐初始浓度(小于2.40 mmol·L^-1)将限制n-damo过程的因素，而偏高的亚硝酸盐初始浓度(大于3.42 mmol·L^-1)将抑制n-damo过程，亚硝酸盐浓度为2.40~3.42 mmol·L^-1时，n-damo反硝化速率达到最大值.