2017, Vol. 37
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2. 中国科学院生态环境研究中心环境模拟与污染控制国家重点联合实验室, 北京 100085
2. State Key Joint Laboratory of Environmental Simulation and Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085
水源传播病原微生物所引发的传染性疾病在人类历史上不断发生(张振兴等，2016).这些病原微生物多为肠源性微生物，由粪便进入水体环境(Harwood et al.，2005;曹蓉等，2004)，经口摄入或其他途径感染人类，导致肠道疾病.报道显示，粪便污染的水体已造成近1.2亿例的肠胃感染(Viau et al.，2011).由于地表水环境中病原微生物种类繁多且浓度较低，各国地表水水质标准多采用粪源污染指示微生物(Fecal Indicator Bacteria，FIB)判断水体是否受到粪便污染及是否含有肠源性病原微生物(Pote et al.，2009).我国地表水质量标准(GB3838—2002)虽然也对微生物指标做了约束，但当前国内对河流监测和研究的关注更集中于有机污染和富营养化等，而忽视微生物指标的检测(陈亚楠等，2015).这导致我国河流病原微生物污染情况不甚明了，极不利于流域的公共卫生安全管理.
海河流域处于半干旱区域，水资源天然禀赋不足.近年来，因河流自然补给过程弱化，海河流域城市河流逐步呈现以污水处理厂退水为主的非常规水源补给特征，水质恶化，微生物污染非常严重(杨勇等，2012)，但流域内多数城市河流仍或多或少地发挥着灌溉、景观娱乐等生态服务功能，对相关人群构成一定的健康风险.因此，本研究以海河流域上游山区段永定河(张家口市)、中游平原段温榆河(北京市)和下游滨海段北运河(天津市)3段典型河流为研究对象，选取粪大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、SC噬菌体作为指示微生物指标，通过历时1年的野外调查，以期明确海河流域典型河流微生物污染的浓度水平及其时空分布特征，以便科学规划流域水体的功能性，进而研究和评估流域微生物污染控制技术与措施，降低微生物污染风险.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 采样点本研究共选取了海河流域的3条河流，分别是上游山区段永定河(张家口市)、中游平原段温榆河(北京市)和下游滨海段的北运河(天津市).3条河流依次代表了海河水系上、中、下游3种不同的地貌条件，且涵盖了我国京津冀经济圈，可鲜明地体现海河流域经济社会发展迅速、人口密度高的特征(荣楠等，2016).同时，3条河流受人为干扰影响不同，通过长期的监测观察，可探究河流微生物污染与周围人类活动、土地利用类型等因素的关联性.
以上述3条河流为研究区域，参照国家标准《采样方案设计技术规定》(环境保护部，2009)，结合3条典型河流的河网、地形地貌、水文、气象、土质等资料信息的归纳整理，设立20个采样点，具体如图 1所示.
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| 图 1 研究区域及采样点布设 Fig. 1 Map of sampling sites in Haihe River Basin |
采样频率为每季度1次，分别在2015年4月(春季)、2015年6月(夏季)、2015年10月(秋季)、2016年3月(冬季)进行.每次采样尽量在1周内完成，从上游到下游依次进行.采样容器选用1.5 L纯净水瓶，现场倒掉原有纯净水，立即取水，每个采样点取2瓶水样作为平行.取得水样放入车载冰箱低温保存，以防微生物的增殖和理化指标的改变.样品运回实验室后尽快检测.采样时制作采样信息采集表，详细记录下当时的天气状况、湿度、河流周边情况等基础信息.
2.3 监测指标与检测方法监测指标包括理化指标和微生物指标两部分.水质理化指标主要包括：水温、pH、浊度、COD、氨氮等.其中，水温和pH用哈纳 H19125N便携式防水型酸度计测定，浊度由便携式浊度计(哈纳HI93703)现场测定，COD和氨氮分别采用德国WTW公司的HC576868试剂、HC427655试剂测定.
监测的指示微生物包括细菌指示微生物和病毒指示微生物两类，分别是粪大肠菌群(Fecal Coliform，FC)、大肠杆菌(Escherichia coli，简称EC)、肠球菌(Enterococcus，简称ENT)和SC噬菌体(Somatic Coliphages).其中，FC、ENT、EC的检测采用滤膜法，分别参照我国行业标准HJ-T347—2007、美国环保署(USEPA)标准EPA Method1603和EPA Method1600，结果以CFU·L-1表示;SC噬菌体的检测参照国际标准化组织推荐的双层平板法(ISO，2000)，宿主菌E.coli CN来自清华大学胡洪营教授课题组惠赠，结果以PFU·L-1表示.
2.4 数据分析参照我国《地表水环境质量标准GB3838—2002》(国家环保总局，国家质量监督检验检疫总局，2002)，分别以“COD+氨氮”和“COD+氨氮+FC”为评价因子，判断水质类别.利用OriginPro8.6软件对原始数据处理、作图，为了更直观地反映微生物浓度的差异，微生物浓度C在图中由C(CFU·L-1或PFU·L-1)换算为lg [C/(CFU·L-1或PFU·L-1)].利用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，采用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U Test)分析指示微生物时间、空间分布的差异性，显著性水平小于0.05时认为有显著性差异;因指示微生物的数据均可看作连续变量，且近似服从正态分布，两两之间具有线性关系，因此，进行Pearson 相关性检验分析指示微生物指标间的相关性，当ｐ＜0.01时认为相关性显著.
3 结果与分析(Results and discussion) 3.1 总体水质状况采样点的水质如表 1所示.COD与NH4+-N一直以来都是海河流域工业与生活污染源的主要污染物(李惠敏等，2000)，分别以COD+NH4+-N和COD+NH4+-N+FC为评价因子判断水质类别，结果如图 2所示.由图 2可知，当前海河流域整体水质较差，单以COD+NH4+-N进行评价，劣V类比例达到55%.若综合考微生物指标，个别监测断面水质会下降1~3个级别.我国当前河流有机污染状况严峻，目前水质评价的关注点仍在有机污染指标.但随着流域污染治理效果凸显，在河流水质变好的背景下，微生物指标将逐渐成为主要污染指标.例如，吕怡兵等(2007)以常规理化指标进行评价，2003年三峡水库区以Ⅲ类水为主，但将微生物指标纳入评价因子后，水质总体为Ⅳ类和Ⅴ类;也有研究表明，国外40%的河流与河口水质难以达到水环境标准是由于微生物污染所致(杨勇等，2012;陈亚楠等，2015).因此，为更真实地反映水质状况，促进流域水质管理，建议我国逐步将微生物指标纳入现有监测和水质评价体系.
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| 图 2 海河流域整体水质状况评价(2015年4月—2016年3月) Fig. 2 Overall water quality of the Haihe River Basin |
| 表 1 采样点基础信息及其水质概况(2015年4月—2016年3月) Table 1 The basic information of sampling sites and its water quality |
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海河流域上游山区段的永定河水质状况相对较好，以COD+氨氮作为评价因子，42%的水样可达到Ⅲ类水体标准，仅8%的水样处于劣Ⅴ类水平.中游北京段的温榆河污染最为严重，几乎均处于劣Ⅴ类水平.下游滨海段的北运河水系污染也较为严重，55%的水样处于劣Ⅴ类水质，29%水样属于Ⅴ类水，仅极个别水样达到Ⅲ~Ⅳ类水的要求.整体而言，3条河流水质评价结果差异明显，污染严重程度呈现出中游平原段(温榆河)＞下游滨海段(北运河)＞上游山区段(永定河)的特点.温榆河和北运河河段近乎丧失水体功能;永定河河段虽水质相对较好，但采样点涉及孤石饮用水源地(YD1)和官厅水库(YD6)等，也难以达到其饮用水源地的水质要求.
3.2 指示微生物浓度水平 3.2.1 指示微生物年平均浓度各采样点4种指示微生物的年平均浓度Ca如图 3所示.由图 3可知，随着采样点的变化，微生物浓度波动剧烈;同一采样点，4种指示微生物浓度差异明显.3段河流相比，中游温榆河污染最为严重，下游滨海段的北运河受中游温榆河微生物污染的影响，监测断面离其上游温榆河的距离越远，微生物污染越小.流域内各监测断面的ENT浓度范围介于1.039×103~9.168×105 CFU·L-1之间，EC介于1.0×101~1.870×106 CFU·L-1之间，FC和SC浓度分别在1.438×102~8.105×106 CFU·L-1和2.500×102~4.770×106 PFU·L-1之间变化.
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| 图 3 海河流域典型河流指示微生物年平均浓度(2015年4月—2016年3月)(注：为保障涉水(游泳、洗澡、划水、儿童戏水等一系列可能接触到水体的活动)人群的健康，USEPA在《2012 Recreational Water Quality Criteria》标准中推荐了两组“ENT+EC”限值供各州在制定水环境质量标准时参考，限值标准规定：置信区间为 90%时，应保证水中：ENT≤130CFU/100 mL且EC≤410 CFU/100 mL，如图中虚线1和2所示;虚线中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ类是我国《地表水环境质量标准》(GB3838—2002)中规定的FC限值) Fig. 3 Annual mean densities of fecal indicators of the three river |
水质波动剧烈与河流连续性差有关.海河流域人为修建水闸水库现象严重，仅张家口市永定河水系就设置了30道蓄水橡胶坝，以供防洪排涝、景观蓄水、休闲娱乐之用(徐海燕，2013).上游山前水库带水库截流、中游平原段和下游滨海段水闸大量建设，导致河流水动力和水资源缺失，河段基流不足，连续性受阻，致使各监测断面之间水质关联性受到影响，水质波动剧烈.
3.2.2 河流微生物污染状况评价我国《地表水环境质量标准》(GB-3838—2002)规定，Ⅲ~Ⅴ类水质的FC浓度限值依次为10000、20000、40000 CFU·L-1(国家环保总局，国家质量监督检验检疫总局，2002).依据此标准，研究流域内60%监测断面的FC浓度能达到Ⅲ类水标准.其中，中游平原段温榆河微生物污染最为严重，绝大多数监测断面的FC浓度远超出Ⅴ类水标准限值，处于劣Ⅴ类水平.
USEPA推荐了两组“ENT+EC”限值供各州在制定水环境质量标准时参考，限值标准规定：在置信区间90%的情况下，应保障ENT≤130 CFU/100 mL且EC≤410 CFU/100 mL(USEPA，2012).以此限值标准考察本年度监测数据，研究流域内几乎所有监测断面均不能达标，主要污染指标为ENT.
从河流指示微生物的发展脉络来看，主流指示微生物经历了从总大肠菌群(TC)到FC再到EC、ENT的发展历史.日益进步的微生物学、流行病学及统计学方法进一步证实EC与ENT是优于TC和FC的粪便污染指示物(陈亚楠等，2015).已有学者对国内指示微生物评价指标及其限值功效的科学性提出质疑和建议(何星海等，2006;宫飞蓬等，2011;昝帅君等，2015).本研究利用中、美两组评价体系所呈现出的评价结果也呈现出较大差异，我国当前选用的微生物指标及其限值的科学性有待深入探讨.
3.2.3 污染源分析人类粪便中FC数量多于ENT;与之相反，动物粪便中，ENT多于FC.基于此，在水质监测中常根据其比值FC/ENT来推断粪便污染来源：当FC/ENT＜0.7，说明水体主要受到动物粪便污染;FC/ENT＞4.0时，受人类粪便污染;否则，说明受到人类和动物粪便混合污染(宫月华，2011).以此计算，全年所有数据中：上游山区段永定河80%的FC/ENT比值＜0.7;中游平原段温榆河53%的FC/ENT比值＞0.7，且25%的FC/ENT比值＞4.0;下游滨海段北运河有57%的FC/ENT比值＜0.7，40%的FC/ENT比值介于0.7~4.0之间.初步判断，张家口段永定河的污染主要由动物粪便导致，而中游平原段温榆河主要受人类粪便的污染，下游滨海段北运河受人类和动物粪便的复合型污染.上游临近村庄、农田，家畜散养现象普遍，且时常有羊倌在河边放牧，降雨等其他条件引发的地表径流促进了牲畜排泄物向河流中的转移;中游河流以污水处理厂出水等非常规水源补给为主，主要污染源来自人类粪便.由于分散点源微生物污染源的随机性和复杂性(王耀兵等，2008)，这样的结果只能给相关执法部门提供定性参考，而微生物溯源技术(Microbial Source Tracking，MST)可更准确地判断污染源(敖静等，2012;魏源送等，2016).
污染最突出的河段为温榆河中游(WY4、WY5，毗邻清河与温榆河交汇口的两个采样点)，尤以清河河口(WY4)污染最为严重，此采样点临近清河污水处理厂排水口，接纳肖家河、清河2座污水处理厂退水，监测断面浓度最高时可达3.2×107 CFU·L-1，超出Ⅴ类水体限值800倍.此外，WY5、WY6两个采样点系属北京市东北部的排水河网，接纳北小河、酒仙桥2座污水处理厂退水，污染也较为严重，这与其他学者的研究结果一致(杨勇等，2012;Wang et al.，2015).虽然北京市污水处理厂已经几番升级改造，但其侧重于对于有机物及氮磷等富营养化物质的去除，对污水中微生物污染的控制效果依然非常有限.已有研究显示，传统污水处理工艺并不能有效去除污水中的病原微生物，致病性原生动物更难被去除(胡洪营等，2005)，其出水依旧难以作为景观、灌溉等功能性用水(Al-Jassim et al.，2015).在COD、BOD5、SS、pH等理化指标达标排放的城市综合污水厂，其出水中粪大肠菌群污染状况依然堪忧，合格率低于20%，且出水中粪大肠菌群浓度高达2.38×104 CFU·L-1(张敬平等，2004).已有研究表明，清河污水处理厂出水FC平均浓度达1.35×107 CFU·L-1(杨勇等，2012)，如这样的出水作为温榆河的主要补给水源(荣楠等，2016)，必将对河流水质造成巨大冲击，也很可能威胁到地下水水质.因此，污水处理厂作为微生物污染的“源”和“汇”，应充分重视消毒工艺的高效运行，保障消毒效果，并尽可能避免高负荷运行及超越排放，且出水中生物学指标应作为强制性指标严格监管(胡洪营等，2010)，才有可能使微生物风险从源头得到控制.
3.3 指示微生物时间分布特征以春、夏、秋、冬四季为时间尺度，以3个河段为空间尺度，探究海河流域典型河流微生物污染状况的时空分布特征，并参照文献(Wilkes et al.，2013)，用曼-惠特尼U检验对3个河段4个季节的微生物时空差异性进行判断.
3.3.1 指示微生物空间分布特征指示微生物的空间分布特征如图 4所示，图中“”标示表明存在显著性差异.以河段为尺度的空间差异性分析显示，中游温榆河污染最为严重，微生物污染状况显著高于另外两个河段，其FC、ENT、EC、SC噬菌体平均浓度C分别高达1.273×106 CFU·L-1、1.962×105 CFU·L-1、2.961×105 CFU·L-1、1.129×106 PFU·L-1.已有研究显示，河流微生物污染情况与河流的土地利用类型、流域社会经济水平密切相关(bGotkowska-Płachta et al.，2016;Wang et al.，2015).北京市作为特大型城市，人口密集、城市化发展水平高，生活污水排放规模大，河流病原微生物的纳污负荷大，而恰恰高人口密度又更需要关注河流的公共卫生情况以保障多数人的健康，如何在城市经济发展与河流公共环境健康之间寻找到平衡点，将是北京市创建绿色人居环境不可规避的问题.上游永定河和下游北运河的空间显著性并不明显，仅EC年度数据和FC春季数据呈现显著差异.
3.3.2 指示微生物时间分布特征由图 4可知，同一河段中夏季微生物污染最为严重，其它3个季节差异不明显.已有研究表明，夏季水温相对较高，利于水体中微生物的存活和繁殖，故微生物浓度相对较高(孙傅等，2012;谌志强等，2012;Wang et al.，2015).但夏季正值北方的雨季，污水管网溢流、雨水的地表径流等分散点源与非点源输入的病原微生物也可能是导致水体微生物浓度普遍增高的原因.
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| 图 4 三段典型河流粪源性指示微生物平均浓度及其空间分布特征 Fig. 4 Median densities of fecal indicators in the three rivers and their spatial distribution |
微生物在水体中是非均质存在的，它们在水体中常成群结团，或吸附于水中的固体物质上(张振兴等，2016).因此，基于统计学的时间差异性分析更有说服力.统计学分析结果(表 2)表明，4种指示微生物的时间分布特征不一致，以FC浓度的季节性差异最为显著.但整体来看，微生物污染的季节性变化并不明显，与杨勇等(2012)有关温榆河的研究结果一致.如前所述，流域大量闸坝建设导致河流连续性破坏、河流片段化，河流自然属性受到明显干扰(荣楠等，2016)可能是其季节性差异不显著的原因之一.
| 表 2 三段典型河流指示微生物时间分布特征 Table 2 The temporal distribution of fecal indicators in the three rivers |
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Pearson 相关性分析结果(表 3)表明，4种指示微生物在0.01的置信水平显著相关，其中，FC与EC相关系数最高.这与其他学者的研究结果相似(Wilkes et al.，2009;孙傅等，2012;Wang et al.，2009).但也有文献的研究结果与之相悖，如傅爽(2012)对医院废水的研究结果显示，指示微生物之间的相关性并无统计学意义.因此，微生物间相关性的研究结果应结合特定的水体环境而论，且需要更多基础数据的验证.值得注意的是，尚未被纳入水质标准的SC噬菌体和其他3种指示微生物之间也呈现出了显著的相关性.大肠杆菌噬菌体与EC、ENT相关性显著，可较好地反映水体微生物污染状况，此现象已引起关注.例如，2015年USEPA发表综述探讨了大肠杆菌噬菌体作为指示微生物的可能性(USEPA，2015).SC噬菌体在水环境中的持久性、水处理工程中的抗性方面都与肠道病毒极为相似，且其检测比FC、EC更方便、快捷.长期以来，地表水环境质量标准统一采用大肠菌群类表征水体微生物污染状况，建议对SC噬菌体进行更多深入的研究，考虑其在水质标准中作为指示微生物的可能性.
| 表 3 指示微生物指标间Pearson相关性分析(n=80) Table 3 Pearson correlation analysis between indicators of microbial indicators(n=80) |
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1) 除有机污染和富营养化问题外，海河流域上游山区段永定河、中游平原段温榆河和下游滨海段北运河也受到了较为严重的微生物污染.
2) 流域内指示微生物浓度分布的季节性变化不显著;3条河流中，中游平原段温榆河因受污水处理厂退水排入河道的影响，微生物污染水平最高;上游山区段永定河虽有机污染较轻，但动物粪便污染严重，导致河流微生物污染状况亦不容乐观.
3) SC噬菌体与细菌类指示微生物(ENT、EC、FC)相关性显著，建议对SC噬菌体进行更多深入研究，考虑其作为水质标准中指示微生物指标的可能性.
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