环境科学学报  2017, Vol. 37 Issue (1): 193-200
Trametes sp.LS-10C产漆酶发酵培养基优化及其漆酶对偶氮染料的脱色性能    [PDF全文]
刘宇1,2, 汤斌1,2 , 李松1,2, 汤文晶1,2, 陈阿娜1,2    
1. 安徽工程大学生物与化学工程学院, 芜湖 241000;
2. 安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心, 芜湖 241000
摘要: 为了提高菌株Trametes sp.LS-10C的漆酶产量并初步研究该酶对偶氮染料的脱色性能,本文通过单因素实验及均匀设计对菌株Trametes sp.LS-10C产漆酶培养基进行了优化,获得最优培养基配方为:葡萄糖14.4 g·L-1、豆渣10.1 g·L-1、麸皮100 g·L-1、NH4Cl 3 g·L-1、KH2PO4 1.4 g·L-1、CuSO4·5H2O 1 g·L-1、NaCl 1 g·L-1、MgSO4 0.8 g·L-1、CaCl2 0.5 g·L-1.菌株发酵至8 d时漆酶产量为595.15 U·mL-1,约是优化前的35.66倍.进一步研究表明,该漆酶-介体系统对酸性红GR、酸性蓝40和酸性铬蓝K等3种偶氮染料脱色10 h后脱色率分别高达96.86%、91.28%和86.31%.相比公开发表的文献,本研究所报道的Trametes sp.LS-10C利用优化培养基发酵产漆酶达到了较高水平,具有酶活力高和发酵时间短等特征,且该漆酶在处理偶氮染料废水脱色领域中具有进一步研发和应用价值.
关键词: 栓菌     漆酶     发酵优化     偶氮染料     脱色    
Optimization of fermentation medium for laccase production by Trametes sp.LS-10C and its properties in the decolorization of azo dyes
LIU Yu1,2, TANG Bin1,2 , LI Song1,2, TANG Wenjing1,2, CHEN Ana1,2    
1. School of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000;
2. Anhui Polytechnic University, Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation in Anhui Province, Wuhu 241000
Received 25 Mar 2016; received in revised from 28 Apr 2016; accepted 28 Apr 2016
the National Natural Science Youth Fund of Anhui Province (No. 1408085QC61) and the Scientific Research Foundation for the Talent-introduction of Anhui Polytechnic University (No. 2013YQQ003)
Biography: LIU Yu (1988—), malemale,E-mail:sdutsixfish@163.com
*Corresponding author: E-mail:tangbin@ahpu.edu.cn
Abstract: To improve the laccase production of Trametes sp.LS-10C and investigate the application of the laccase on decolorization of azo dyes, the fermentation medium of Trametes sp.LS-10C was optimized using single factor experiments and uniform design experimentations, and the obtained composition of the optimal fermentation medium was as follows:glucose 14.4 g·L-1, bean dregs 10.1 g·L-1, bran 100 g·L-1, NH4Cl3 g·L-1, KH2PO4 1.4 g·L-1, CuSO4·5H2O 1 g·L-1, NaCl 1 g·L-1, MgSO4 0.8 g·L-1, CaCl2 0.5 g·L-1. The maximum laccase productivity of 595.15 U·mL-1 about 35.66 fold higher than that obtained in the initial fermentation medium, was obtained in 8 d. In addition, by using the laccase-mediator system, the final decolorization rates for azo dyes, such as Acid Red GR, Acid Blue 40 and Acid Chrome Blue K, were 96.86%, 91.28% and 86.31%, respectively. The strain Trametes sp.LS-10C reported in this study has the ability to produce a higher level of laccase in a shorter fermentation time by using the optimized medium. Moreover, the laccase from Trametes sp.LS-10C may have a great potential in industrial application for the decolorization of azo dyes wastewater.
Key words: Trametes sp.     laccase     fermentation optimization     azo dyes     decolorization    
1 引言(Introduction)

漆酶(Laccase,EC 1.10.3 .2)是多铜氧化酶家族(Multi-copperoxidases,MCOs)中最重要的一员,1883年由Yoshida在漆树(Rhus vernicifera)汁液中首次发现(Giardina et al.,2015; Yoshida,1883).漆酶广泛分布于真菌中,在细菌、植物和昆虫中也有相关报道( Rivera Hoyos et al.,2013).近年来,随着漆酶-介体系统(Laccase-mediator systems,LMS)研究的深入,漆酶在环境科学领域的应用越来越广泛,如纸浆的生物漂白、脱木质素作用,以及印染废水的处理等(Cañas et al.,2010; 罗爽等,2015).同时,漆酶在食品、医药、化妆品、生物炼制等领域也表现出良好的应用前景(Pezzella et al.,2015).

目前工业用漆酶的生产制备主要来源于丝状真菌的液体深层发酵(Submerged fermentation,SmF),菌丝体的肆意生长严重影响了传质传氧效率,从而影响了漆酶的发酵生产效率,这在一定程度上限制了漆酶在上述领域中的深入应用(Couto et al.,2007).为此,学者们采用固定化技术有效控制了丝状真菌菌丝的自由生长,从而提高了漆酶的产量.比如Prasad等采用聚氨酯泡沫固定化培养Pleurotus ostreatus,漆酶产量明显增加(Prasad et al.,2005).同时,补料分批发酵可以通过调节底物浓度来降低底物和代谢产物对菌体生长代谢的抑制作用,也可以有效提高真菌漆酶的产量.如Galhaup等研究Trametes pubescens MB89发酵产漆酶时发现,通过流加葡萄糖进行补料分批发酵可以使漆酶产量显著提高至743 U·mL-1(Galhaup et al.,2002).研究表明,黎芦醇、ABTS、Cu2+、愈创木酚和苯甲醇等诱导剂也是提高漆酶的一种有效途径(Revankar et al.,2006).例如,Fonseca等发现0.5 mmol·L-1的Cu2+可使Ganoderma applanatumPeniophora sp.漆酶的最高活性分别提高至对照组的49.2倍和19.7倍(Fonseca et al.,2010).另外,发酵培养基优化是真菌漆酶工业化应用的基本途径,不但可以降低漆酶生产成本,还可以进一步提高漆酶产量.比如刘家扬等(2010)通过对Trametessp. SYBC-L3产漆酶发酵条件优化,第8 d时酶活力水平是优化前的42倍,达到60.13 U·mL-1.因此,发酵培养基的优化对于漆酶工业化生产和应用具有重要意义.

本研究室前期筛选获得了一株漆酶高产菌株Trametessp.LS-10C(李松等,2015),进一步研究发现该菌株具有产酶水平高和发酵周期短等特点.通过单因素试验和均匀实验设计对菌株Trametessp.LS-10C发酵产漆酶培养基进行了优化,并使菌株的漆酶发酵活力提高了约35.66倍,在较短时间内(8 d)获得了较高的漆酶产量(595.15U·mL-1),研究中同时发现该漆酶对部分偶氮染料均有良好的脱色作用.为漆酶的高效发酵法生产制备以及偶氮染料的高效生物法脱色处理提供了一条有效途径.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 材料 2.1.1 菌种

菌株Trametessp.LS-10C由本实验室筛选、鉴定并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC NO:M2015191).

2.1.2 主要试剂

ABTS[2,2′-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐]和DMP(邻苯二甲酸二甲酯)购自Sigma公司;愈创木酚(邻甲氧基苯酚),酸性红GR(Acid Red GR,ARgr,λmax=512 nm),酸性蓝40(Acid Blue 40,AB40,λmax=618 nm)和酸性铬蓝K(Acid Chrome Blue K,ACBk,λmax=545 nm)购自上海生工生物工程技术服务有限公司;麸皮和豆渣均为市售;其它分析纯或化学纯生化试剂均购自国药集团化学试剂有限公司.

2.1.3 培养基

斜面培养基:土豆200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、琼脂20 g·L-1、pH自然.种子培养基:葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、pH自然.基本发酵培养基:葡萄糖10 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1,酵母粉3 g·L-1、酒石酸铵10 g·L-1、五水合硫酸铜0.25 g·L-1、氯化钠1 g·L-1、pH自然.

2.2 方法 2.2.1 培养方法

挑取斜面中培养的Trametes sp.LS-10C菌丝(约3 cm2)接种至种子培养基中,置于30 ℃、200 r·min-1培养48 h后,以10%的接种量转接于发酵培养基中(50 mL/250 mL),于30 ℃、200 r·min-1条件下培养,期间每隔24 h取样并测定相关数据.

2.2.2 生物量测定

取40 mL发酵液于5000 r·min-1离心10 min,弃上清,沉淀用蒸馏水重悬洗涤2次之后置于干燥箱中,于70 ℃条件下干燥至恒重,称量并计算菌体干重.

2.2.3 漆酶活力的测定

取适量发酵液于5000 r·min-1离心10 min,上清液用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1 mol·L-1,pH 4.0)进行适当稀释后测定漆酶活力.另外,ABTS溶液和DMP溶液均使用醋酸-醋酸钠缓冲液配制.已知420 nm处ABTS的摩尔消光系数ε420=36 L·mmol-1·cm-1,469 nm处DMP的摩尔消光系数ε469=49.6 L·mmol-1·cm-1.如无特殊说明,文中所述漆酶活力的测定均以ABTS为底物.

(1) 以ABTS为底物(傅凯,2013),用等体积的0.5 mmol·L-1 ABTS溶液和适当稀释的粗酶液在40 ℃恒温水浴反应,以热灭活后粗酶液为对照,测定反应前3 min内反应体系在420 nm处吸光值的变化,定义每分钟氧化1 μmol的ABTS所需的酶量为1个酶活力单位(U).

(2) 以DMP为底物(刘家扬等,2010),用等体积的1.0 mmol·L-1 DMP溶液和适当稀释的粗酶液在40 ℃恒温水浴反应,以热灭活后粗酶液为对照,测定反应前3 min内反应体系在469 nm处吸光值的变化,定义每分钟氧化1 μmol的DMP所需的酶量为1个酶活力单位(U).

2.2.4 糖的测定

还原糖采用DNS法测定(Miller,1959),总糖采用硫酸-蒽酮法测定(张水华,2004).

2.2.5 偶氮染料脱色反应

向1 mL染料溶液(0.3 g·L-1)中分别加入漆酶粗酶液和ABTS溶液至终浓度分别为10 U·mL-1和10 μmol·L-1,置于40 ℃水浴中反应,测定反应体系在λmax处的吸光值A1,同时以热灭活粗酶液作为对照,同样方法测得其吸光值A0,染料脱色率=(A0-A1)/A0× 100%.上述反应体系中,染料、ABTS溶液和漆酶均使用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.1 mol·L-1,pH 4.0)进行配制或稀释.

3 结果与分析(Results and analysis) 3.1 发酵培养基的优化 3.1.1 碳源对漆酶产生的影响

以基本发酵培养基作对照,分别用10 g·L-1的蔗糖、麦芽糖、木糖、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖或糊精替代对照组中10 g·L-1的葡萄糖,培养8 d后测定漆酶活力.结果表明,菌株LS-10C以乳糖和葡萄糖为碳源发酵可获得较高的漆酶活力,而蔗糖、木糖、半乳糖和糊精等则不适宜于菌株LS-10C发酵产漆酶(图 1a).综合考虑乳糖和葡萄糖对发酵产酶的影响及两者价格差异,后续研究中选择价格相对低廉的葡萄糖作为该菌株的发酵碳源.

图 1 不同营养源对LS-10C产漆酶的影响(a.碳源,b.氮源,c.麸皮汁,d.诱导剂) Fig. 1 Effects of different nutrients on laccase production of LS-10C(a.carbon sources,b.nitrogen sources,c.bran juice concentration,d.inducers)
3.1.2 氮源对漆酶产生的影响

以基本发酵培养基作对照,用7 g·L-1的豆饼粉、豆粕或豆渣替代对照组中的酒石酸铵;培养基中有效含氮量按1.52 g·L-1进行换算,分别用3.4 g·L-1尿素、2.5 g·L-1硫酸铵、2.9 g·L-1氯化铵、5.4 g·L-1硝酸钾或4.6 g·L-1硝酸钠替代对照组中10 g·L-1的酒石酸铵,发酵至8 d时取样并测定漆酶活力.结果表明,菌株LS-10C以豆渣为有机氮源发酵产漆酶活力最高,分别比以豆饼粉和豆粕为氮源的发酵活力高90.72%和53.23%(图 1b);菌株LS-10C以氯化铵为无机氮源的漆酶发酵活力最高,而以尿素、硫酸铵和酒石酸铵为氮源时漆酶产生水平较低.综合考虑有机和无机2种不同类型的氮源对发酵产酶的影响,后续试验中同时选择产酶效果较好的豆渣和氯化铵作为氮源进行研究.

3.1.3 麸皮汁对漆酶产生的影响

以基本发酵培养基作对照,用质量分数分别为0、5%、10%、15%和20%的麸皮汁(汤斌等,2014)替换基本发酵培养基中3 g·L-1的酵母粉,发酵8 d后测定酶活力.结果表明,麸皮汁在一定质量分数范围内(5%~10%),随着麸皮汁质量分数的升高,漆酶活力水平大幅提升,在麸皮汁质量分数为10%时漆酶发酵活力达到最大值(77.81 U·mL-1),比对照组提高了约20倍(图 1c);当麸皮汁质量分数高于10%时,该菌株发酵产酶开始受到抑制.利用麸皮作为营养基质提高漆酶产量在文献中也有报道,如Lorenzo等(2002)在研究变色栓菌(T. versicolor)发酵产漆酶时,发现添加麸皮可以使漆酶发酵活力提高10倍;Souza等(2010)认为麸皮中的碳水化合物和酚类化合物是提高漆酶发酵活力的主要因素.

3.1.4 诱导剂对漆酶产生的影响

分别用1.0 mmol·L-1苯甲醇、愈创木酚和ABTS等诱导剂替代上述初步优化后培养基中的五水合硫酸铜,对照组不添加任何诱导剂,发酵至8 d时取样并测定漆酶活力.结果表明,硫酸铜(初步优化培养基)、ABTS、愈创木酚和苯甲醇等对菌株LS-10C发酵产漆酶都有诱导作用,酶活力大小分别比对照组提高了170.92%、97.32%、140.04%和132.32%;其中以硫酸铜的诱导效果最佳,漆酶活力约为178.81 U·mL-1(图 1d).综合考虑以上4种诱导剂对Trametessp.LS-10C发酵产漆酶的诱导效果以及价格因素,后续研究中选择廉价易得的硫酸铜作为该菌株的诱导剂.

3.1.5 Cu2+浓度对漆酶产生的影响

将基本发酵培养基中Cu2+浓度分别调至0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mmol·L-1,培养8 d后测定漆酶活力(图 2).结果表明,Cu2+浓度在0~4.0 mmol·L-1时,漆酶活力与Cu2+浓度接近线性正相关关系,4.0 mmol·L-1时达到峰值322.41 U·mL-1;当Cu2+浓度大于4.0 mmol·L-1时,漆酶的产生开始受到抑制;Cu2+浓度为8.0 mmol·L-1时,菌株LS-10C的漆酶产生能力完全被抑制.

图 2 Cu2+浓度对LS-10C产漆酶的影响 Fig. 2 Effect of Cu2+ concentration on laccase production of LS-10C
3.1.6 均匀试验

为研究葡萄糖、豆渣、麸皮汁、NH4Cl、CuSO4·5H2O、KH2PO4、MgSO4、CaCl2等8个试验因素对菌株LS-10C发酵产漆酶的影响,根据U10*(58)均匀表设计试验(李森等,2015),试验设计及结果见表 1. 通过DPS 7.05软件对均匀设计试验结果进行二次多项式逐步回归分析(表 2).

表 1 均匀试验设计及结果 Table 1 Uniform experimentation design and results

表 2 均匀设计逐步回归分析结果 Table 2 he results of stepwise regression of uniform design

漆酶活力回归方程:

(1)

该回归方程可诀系数R2=1,调整后的可诀系数 Ra2=1,总体显著性检验值F=62499.906,显著性水平p=0.0056,剩余标准差S=0.07,即方程拟合性良好.

根据表 2t检验值可推出各因素对漆酶活力的影响大小依次为X3X2X8X5X6,即麸皮汁>豆渣>CaCl2>CuSO4·5H2O>KH2PO4.

通过对回归方程进行非线性规划法优化得最优组合为X1取3.6(葡萄糖14.4 g·L-1),X2取3.7(豆渣10.1 g·L-1),X3取2.5(麸皮汁10%),X4取3.0(NH4Cl 3.0 g·L-1),X5取3.9(CuSO4·5H2O 1.0 g·L-1),X6取3.3(KH2PO4 1.4 g·L-1),X7取2.3(MgSO4 0.8 g·L-1),X8取3.1(CaCl2 0.5 g·L-1),带入方程(1),得Y=589.33U·mL-1.

3.2 优化后的菌株LS-10C发酵产漆酶过程

上述优化培养基配方,对其进行发酵试验验证,得到菌株LS-10C发酵产漆酶过程曲线,如图 3所示.结果表明,发酵0~3 d时,菌体大量消耗糖基质,生物量在此期间增加迅速,3 d时达到峰值21.52 mg·mL-1,酶活力增加缓慢;发酵4~8 d时,残糖一直维持在很低水平,总糖平均值约4.17 g·L-1,菌体生物量基本不变,酶活力增加迅速;第8 d漆酶活力达到最高值595.15 U·mL-1,约是优化前的35.66倍;最高酶活力值与上文得到的漆酶活力回归方程的理论值相差0.99%,表明上述回归方程拟合性良好.发酵9~10 d时,漆酶活力略有下降.

图 3 优化后的LS-10C发酵产漆酶过程曲线 Fig. 3 The curve of optimized laccase fermentation of LS-10C

综合比较国内外近期的相关研究可以发现,真菌发酵产漆酶仍然具有酶活水平较低或发酵周期较长等特点(表 3).相比较而言,本研究中所获得的LS-10C菌株发酵产漆酶,具有酶活力高和发酵时间短等特征,在漆酶的高效发酵法生产中具有较大的应用潜力.

表 3 真菌发酵产漆酶的比较 Table 3 Comparison of laccase production by fungal fermentation
3.3 漆酶对偶氮染料的脱色性能

本文初步研究了菌株LS-10C所产漆酶及漆酶-介体(ABTS)系统对ARgr、AB40和ACBk等3种偶氮染料的脱色作用,其脱色率随时间的变化规律及10 h反应脱色体系和对照样品的全波长扫描(300~800 nm)结果如图 46所示.结果表明,LS-10C漆酶-ABTS系统对ARgr、AB40和ACBk这3种偶氮染料的脱色率随时间的延长而增加,反应10 h后脱色率分别达到96.86%、91.28%和86.31%.研究发现,添加介体ABTS在前期可显著提升漆酶对ARgr的脱色效率(20 min,93.34%/42.23%),并在1 h内达到95.45%的高脱色率(图 4a);随着脱色反应时间的延长,该漆酶与漆酶-介体(ABTS)系统对ARgr的脱色率逐渐接近(10 h,96.02%/96.86%),表明适当延长反应时间后,该漆酶在没有介体(ABTS)的参与下对ARgr同样可以达到较好的脱色效果.使用漆酶或漆酶-介体(ABTS)对ARgr脱色10 h后,脱色反应液在ARgr的最大吸收波长(512 nm)处无明显吸收峰出现(图 4b),说明绝大部分ARgr已被该漆酶或漆酶-介体(ABTS)系统氧化脱色.根据AB40的脱色率曲线(图 5a)可以发现,该漆酶或漆酶-介体(ABTS)系统对AB40的脱色速率和最终脱色率均极为接近,表明添加ABTS对AB40的脱色效率基本没有影响,即该酶在没有介体(ABTS)的参与下同样可以对AB40进行高效脱色.这2种脱色体系对AB40脱色10 h后,在AB40的最大吸收波长(618 nm)处无明显特征吸收峰出现(图 5b),说明绝大部分AB40已被该漆酶或漆酶-ABTS系统氧化脱色.在ACBk的脱色反应中发现,添加ABTS不但可以加快漆酶对ACBk的脱色效率(40 min,77.25%/30.59%),还可以提高漆酶对ACBk的脱色率(10 h,86.31%/68.17%)(图 6a),表明在该漆酶对ACBk进行脱色的过程中,小分子介体(ABTS)的参与可以有效提升其脱色速率和脱色率.最终脱色反应液(10 h)的全波长扫描表明,与ARgr和AB40相比,脱色液在ACBk最大吸收波长(545 nm)处仍有部分特征吸收峰出现(图 6b),表明LS-10C漆酶对ACBk的脱色程度仍然不完全,这与直接计算的脱色率数据相吻合.

图 4 ARgr脱色率随时间变化曲线(a)和LS-10C漆酶处理前后ARgr脱色液的吸收光谱图(b) Fig. 4 The variation of decolorization rate of ARgr with time(a)and the absorption spectrogram of the ARgr before or after decolorization under the treatment of LS-10C laccase(b)

图 5 AB40脱色率随时间变化曲线(a)和LS-10C漆酶处理前后AB40脱色液的吸收光谱图(b) Fig. 5 The variation of decolorization rate of AB40 with time(a)and the absorption spectrogram of the AB40 before or after decolorization under the treatment of LS-10C laccase(b)

图 6 ACBk脱色率随时间变化曲线(a)和LS-10C漆酶处理前后ACBk脱色液的吸收光谱图(b) Fig. 6 The variation of decolorization rate of ACBk with time(a)and the absorption spectrogram of the ACBk before or after decolorization under the treatment of LS-10C laccase(b)
4 结论(Conclusions)

1) 通过单因素实验和U10*(58)均匀试验,对Trametessp.LS-10C进行了发酵培养基优化,结果如下:葡萄糖14.4 g·L-1、豆渣10.1 g·L-1、麸皮100 g·L-1、NH4Cl 3 g·L-1、KH2PO4 1.4 g·L-1、CuSO4· 5H2O 1 g·L-1、NaCl 1 g·L-1、MgSO4 0.8 g·L-1、CaCl2 0.5 g·L-1.以ABTS为底物测定漆酶活力,菌株LS-10C发酵至第8 d时漆酶产量为595.15 U·mL-1,约是优化前的35.66倍,该菌株具有酶活力高和发酵时间短等特征.

2) Trametessp.LS-10C漆酶和漆酶-介体(ABTS)系统对不同偶氮染料的脱色效率存在较大的差异,该漆酶在没有介体(ABTS)的参与下对ARgr和AB40仍具有较高的脱色效率,而漆酶-介体(ABTS)系统对ACBk的脱色效率则具有明显的促进作用.漆酶-ABTS系统对ARgr、AB40和ACBk这3种偶氮染料作用10 h后,脱色率分别高达96.86%、91.28%和86.31%,表现出了该漆酶在偶氮染料脱色中的良好应用效果,在偶氮染料工业废水处理中具有进一步开发利用的价值.

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