环境科学学报  2017, Vol. 37 Issue (1): 207-212
正己烷降解菌NX-1的筛选、鉴定及其细胞表面疏水性研究    [PDF全文]
江宁馨, 叶杰旭, 于宁宁, 陈建孟, 陈东之    
浙江工业大学环境学院, 杭州 310032
摘要: 从浙江某制药企业污水处理池的活性污泥中筛选到一株高效降解正己烷的菌株NX-1,经形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析确定其为Pseudomonas mendocina.由于正己烷的去除速率与细胞表面疏水性(CSH)密切相关,故研究了影响P. mendocina NX-1CSH的关键因素.利用微生物黏着碳氢化合物法测定不同环境条件下的CSH,发现pH、淀粉和壳聚糖浓度显著影响CSH值;通过Box-Behnken设计及响应面分析确定了提高P. mendocina NX-1 CSH的最优条件:pH为7.61,淀粉浓度为9.39 g·L-1,壳聚糖浓度为1 g·L-1,最大CSH达到56.0%.
关键词: 正己烷     生物降解     细胞表面疏水性     响应面法    
Isolation and identification of the hexane-degrading strain NX-1 and its cell surface hydrophobicity
JIANG Ningxin, YE Jiexu, YU Ningning, CHEN Jianmeng, CHEN Dongzhi    
College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032
Received 15 Mar 2016; received in revised from 4 Apr 2016; accepted 4 Apr 2016
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21477116, 21276239) and the Public Projects of Zhejiang Province (No.2014C33029)
Biography: JIANG Ningxin(1990—), female,E-mail:email764671140@qq.com;
*Corresponding author: E-mail:cdz@zjut.edu.cn
Abstract: An efficient hexane-degrading strain named NX-1 was isolated from the activated sludge which was collected from the sewage treatment tank in a local pharmaceutical plant in Zhejiang Province. The strain NX-1 was identified as Pseudomonas mendocina through the morphological and physiological identification and 16S rDNA sequence analysis. Since hexane removal rate was closely related to cell surface hydrophobicity (CSH), this study subsequently investigated the key factors influencing the CSH of P. mendocina NX-1. The method of the microbial adherence to hydrocarbon was employed to determine the value of CSH. It was found that CSH was significantly affected by pH, starch concentration and chitosan concentration. The Box-Behnken design and response surface methodology were conducted, and the optimal conditions were found to be pH 7.61, starch concentration 9.39 g·L-1 and chitosan concentration 1 g·L-1, resulting in the CSH as high as 56.0%.
Key words: hexane     biodegradation     cell surface hydrophobicity     response surface methodology    
1 引言(Introduction)

生物法因其具有操作简便、处理效率高、净化效果好和投资运行费用低等特点,在治理大风量、低浓度的有机废气时较传统的物理法和化学法有优势(Herbes et al., 1978; Timmis et al., 1999; Pieper et al., 2000; Samanta et al., 2002).然而,某些工业废气由于存在疏水性特点,影响目标污染物从气相转移到液相的传质速率,从而使生物法处理疏水性有机废气的效果不理想(徐百龙等,2013).工业废气中存在一类典型的污染物,如环己烷、正己烷等,由于具有较高的疏水性,微生物在降解该类污染物时往往存在显著的传质限制,导致降解速率低下.如何高效去除混合废气中疏水性挥发性有机物(VOCs),已成为生物法处理工业有机废气的难题.国内外研究表明,利用微生物降解VOCs时,具有较高细胞表面疏水性(CSH)的微生物更容易与疏水性VOCs接触,进而能够取得更好的处理效果(Panagoda et al., 2001; Singleton et al., 2001).因此选育具有高CSH的降解菌或者提高微生物的CSH无疑是实现上述设想的重要突破口.

目前,国内外已报道了能够以正己烷作为唯一碳源和能源生长的菌株,但其降解速率仍有待提高.王连生等(1990)发现在降解石油烃的微生物中,少数石油降解菌能够同时降解正己烷,但是降解效率不高.丁明宇等(2001)分离得到的石油降解菌SJ26能够在以正己烷为唯一碳源的培养基上生长,但是降解正己烷的效率并不高.Lee等(2010)报道了石油降解菌Rhodococcus sp.完全降解0.02%正己烷(与培养基的体积比)需要70 h.Amouric等(2006)的研究报道中石油降解菌Gordonia amicalis DSM44461和Pseudomonas putida也能够降解正己烷,但是单位细胞的降解速率较低,只有0.006和0.06 mg·h-1.本文从浙江某制药化工企业污水处理池的活性污泥中分离到一株高效降解正己烷的菌株NX-1,研究了该菌的CSH及其关键影响参数,利用中心组合设计建立回归方程,确定提高NX-1菌株 CSH的最优条件.

2 材料和方法(Materials and methods) 2.1 培养基

无机盐培养基(MM):Na2HPO4 4.5 g·L-1、KH2PO4 1.0 g·L-1、(NH4)2SO4 2.5 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、CaCl2 0.023 g·L-1,微量元素母液1 mL·L-1,pH 7.0;所述的微量元素母液浓度组成:FeSO4·7H2O 1.0 g·L-1、CuSO4·5H2O 0.02 g·L-1H3BO3 0.014 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.10 g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.10 g·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.02 g·L-1、CoCl2·6H2O 0.02 g·L-1.R2A固体斜面培养基(Chen et al., 2010);驯化筛选培养基:无机盐培养基+正己烷100 mg·L-1.

2.2 高效降解菌的筛选和鉴定 2.2.1 高效降解菌的筛选

采集浙江某制药企业污水处理池的活性污泥,将静置后的下层污泥与新鲜无机盐营养液按1∶1(V/V)混合接入至污泥驯化罐中,以正己烷为底物,对污泥进行驯化.2个月后,将活性污泥接种到含50 mL MM的250 mL密封盐水瓶中,以正己烷为底物,经过多次传代富集后,进行稀释涂布.对单菌落进行多次划线分离后,再接至以正己烷为唯一碳源和能源的无机盐培养基中,测试降解活性.选择具有正己烷降解能力的单菌落,进一步分离纯化,获得一株高效降解正己烷的菌株.

2.2.2 菌株的鉴定

为确定菌株的分类地位,将分离纯化后的菌株进行菌体形态观察与生理生化试验(方法参考文献(东秀珠等,2001)),并采用Biolog及16S rDNA技术对菌株进行鉴定.

Biolog细菌鉴定系统(Biolog Hayward,CA,USA)GenIII微板的95个样品孔中各含有不同碳源,对照孔不含任何碳源,每孔接种待鉴定菌株的稀释培养物,培养24 h后测定代谢指数.具体方法参考文献(Zhang et al., 2008).

菌体,采用DNA提取试剂盒(V2.2,上海申能博彩生物科技有限公司)提取菌株总DNA作为PCR模板,选用16S rDNA通用引物F8和R1541进行PCR扩增.PCR反应体系(50 μL)为:5 μL 10×PCR Buffer、4 μL dNTP Mixture、1 μL BSF8/20(20 μmol·L-1)、1 μL BSR1541/20(20 μmol·L-1)、0.25 μL TapDNA聚合酶、1 μL DNA模板,重蒸水37.5 μL.PCR程序为:94 ℃预变性4 min,然后94 ℃变性60 s,59 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s进行35个循环,最终72 ℃延伸10 min,4 ℃保温10 min.PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶检验后交由生工生物工程(上海)有限公司测序.将测序结果同GenBank数据库(美国国家生物技术信息中心)中的基因序列用Blast软件进行同源性比对分析.

2.2.3 正己烷浓度的测定方法

采用Agilent 6890气相色谱仪,离子火焰检测器(FID).气相色谱条件:进样口温度为200 ℃,柱温为80 ℃,检测器温度为200 ℃,柱流量为1 mL·min-1.N2为载气,总流量为16.5 mL·min-1,分流比为15∶1.氢气流量和空气流量分别为40和450 mL·min-1.色谱柱为HP-Innowax毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm),采用1000 μL玻璃注射器采集气体,进样量为800 μL.

2.3 菌株CSH的测定

CSH利用略加修改的微生物粘着碳氢化合物法(Bernet et al., 1994)测定NX-1菌株的CSH:向分液漏斗内加入4 mL菌悬液(约108 CFU·mL-1),再加入0.2 mL硅油作为有机相,封口后在室温下剧烈振荡60 s,静置15 min分层.分离出下层水相溶液3.0 mL,以磷酸盐缓冲液为空白对照,在600 nm 波长下测定吸光度(A).同时做不加有机相的对照组.CSH按式(1)计算:

(1)
2.4 响应面分析法设计

以CSH为基础,根据单因素实验结果确定pH、淀粉和壳聚糖浓度的上下水平,按Box-Behnken三元二次中心组合设计原理设计,设计3因素3水平17个试验点的响应面分析,其中零点试验重复5次,以估计误差.培养3 h后取样测定各组的 CSH.表 1为中心组合试验方案中的因素及水平.

表 1 中心组合试验设计方案中的因素及水平 Table 1 Factors and their levels used in the Box-Behnken design
2.5 不同CSH的NX-1菌株对正己烷的降解试验

用MM对具有不同CSH的NX-1菌液进行洗涤离心,并将离心后的NX-1菌株分别悬浮于50 mL MM(初始OD600=0.6,pH=7.0)的250 mL密封盐水瓶中,放至恒温摇床中(30 ℃、160 r·min-1)降解初始浓度为400 mg·L-1的正己烷.实验过程中,设计3个平行样和1个空白对照.每隔一段时间,测定正己烷浓度变化.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 高效降解的菌的筛选和鉴定

通过分离纯化得到一株高效降解正己烷的菌株NX-1.用接种环挑取少许保存在斜面上的菌株接种于MM中(初始菌体浓度约为106 CFU·mL-1),正己烷初始浓度为400 mg·L-1,53 h后正己烷降解率达100%.该菌呈椭圆状,无芽孢,有鞭毛,不水解淀粉,吲哚反应、接触酶反应、柠檬酸盐、氧化酶呈阳性,反硝化、甲基红、V. P反应呈阴性,革兰氏染色呈阴性,透射电镜照片见图 1.

图 1 NX-1菌株的透射电镜照片(×40000) Fig. 1 TEM photo of the strain NX-1(×40000)

为了确定该菌株的种属情况,对菌株NX-1进行了Biolog鉴定与16S rDNA分析.

Biolog检测结果(24 h培养后)显示,与标准菌株门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的相似性(SIM值)为0.631(当24 h的SIM值大于0.5时,可认为菌株的种属情况是正确的),得出NX-1为P. mendocina.将菌株NX-1经16S rDNA序列测序后与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对,用Clustal X1.83软件比对分析,然后采用MEGA3.1软件邻位相连(Neighbour Joining,NJ)法,构建菌株NX-1与其亲缘关系较近菌属的系统发育树,发现菌株NX-1与P. mendocina JF513150(GenBank序列登录号)的同源性最高(数据略).根据NCBI中的比对结果和相似基因数计算它们的同源性为99.2%.因此,菌株NX-1鉴定为P. mendocina.

3.2 影响CSH的关键单因素研究

细菌的种属不同,CSH也各异,但是微生物的CSH一般难以达到100%.有研究指出,CSH与疏水性有机污染物的降解有着密切联系,疏水性高的细菌对有机物的降解速度较疏水性低的细菌快(Wang et al., 2011; Li et al., 2008).针对特定的降解菌株,如果通过改变微生物培养过程中的环境因素进而提高其CSH,或许可加快该菌株对疏水性有机物降解.因此,作者研究了环境因素对P. mendocina NX-1 CSH的影响.

本实验研究了菌体培养与正己烷降解过程中pH、温度、营养盐组分(碳源、氮源、磷源)和阳离子聚合物(壳聚糖)对NX-1菌株的CSH的影响.结果表明,pH、淀粉及壳聚糖对菌株NX-1的CSH的影响较大(图 2),而其他因素的影响并不显著(数据略).

图 2 壳聚糖浓度(a),pH(b)和不同淀粉浓度(c)对NX-1菌株CSH的影响(误差棒代表 3个平行样的标准偏差) Fig. 2 Effect of distosan concentration(a),pH(b)and starch concentration(c)on CSH of NX-1(Error bars represent standard deviations of triplicates)

图 2a所示,壳聚糖对菌株的CSH影响较大,当壳聚糖的浓度在1 g·L-1时,CSH最大可达到33%,比未添加壳聚糖条件下的CSH提高了18%.在添加有壳聚糖的营养液下培养,壳聚糖会增加细胞表面的蛋白成分,进而提高细菌的CSH(Tangpasuthadol et al., 2003).

图 2b所示,pH为4~10时,CSH呈现不同的变化情况,其中碱性环境下CSH比酸性环境下高.当pH=8时,CSH最高可达到35%.孙向武等(2010)发现细菌的CSH随着培养液pH的提高而增强.据报道,CSH与细菌细胞外壁中表面蛋白和脂多糖的含量等密切相关(Parker et al., 1984; Jayasekara et al., 2004).推测pH值改变了细胞的表面电荷或细胞表面的蛋白含量,进而改变了CSH.

实验中研究了几种不同种类碳源的影响——木糖、酵母粉、淀粉、葡萄糖和果糖.结果表明,在添加不同碳源的情况下,淀粉对CSH的影响最大(数据略).如图 2c所示,在淀粉浓度为8 g·L-1时,NX-1菌株的CSH最高,达到51%,推测可能是淀粉改变了细胞膜的组分进而提高CSH(Gruber et al., 1991).

3.3 响应面优化实验

在上述单因素实验基础上,选择pH(X1)、淀粉(X2)、壳聚糖(X3)为优化对象,以CSH(Y)为响应值,设定pH为5.00~7.00,淀粉浓度为0.00~12.00 g·L-1,壳聚糖浓度为0.00~2.00 g·L-1,采用Design Expert V8.0.6 统计软件对实验结果进行响应面回归分析,如表 2所示.

表 2 响应面实验设计及结果 Table 2 Response surface experimental design and results

根据表 2实验结果,运用 Design Expert V8.0.6 对实验数据进行二次回归分析,得到二次回归方程如下:Y= -183.05283+56.57247X1+3.05444X2+34.95071X3+0.29971X1X2-1.10536X1X3-0.58175X2X3-3.98940X12-0.25164X22-10.07849X32

回归方程的可决系数R2=0.9845,拟合度较好.对回归方程进行方差分析,结果见表 3.由表 3可知,模型p<0.01,回归模型极显著;在实验范围内能较好地预测实际CSH值.根据回归方程,CSH最大值的最优条件是pH为7.61,淀粉浓度为9.39 g·L-1,壳聚糖浓度为1 g·L-1,最大CSH达到56.2%.

表 3 回归方程方差分析及各因素的显著性检验 Table 3 Variance analysis of regression equationand the test of significance of each factor

为了验证响应面优化的可靠性,在最佳培养基条件下进行3 组提高CSH的实验,CSH的平均值为56.0%,与理论预测值56.2%相差不大,比未经特别处理所得的15.0%提高了3倍多.

表 3中给出了平方和、平均方差、估算系数、标准误差、F值和p值,且此模型中具有较大的F值与较小的p值(p<0.05),可以确定此模型具有较高的显著性(Myers et al., 1996).

3.4 不同CSH对NX-1菌株降解正己烷的影响

本研究在响应面最优条件下得到的CSH为56.0%.将CSH为56.0%的NX-1菌株和不经特别处理的CSH为15.0%的NX-1菌株分别接种于无机盐培养基中(初始OD600=0.6)降解正己烷.由图 3可知,具有不同CSH的P. mendocina NX-1菌株对正己烷的生物降解曲线有很大差异.高CSH的菌株能够加快底物的降解速率,CSH为56.0%的NX-1菌株能在28 h内将正己烷完全降解,平均降解速率为14.3 mg·L-1·h-1,而CSH为15.0%的NX-1菌株在28 h的降解效率仅为38%,需40 h才能将正己烷完全降解,平均降解速率为10 mg·L-1·h-1.结果表明降解效率和CSH的大小紧密相关,CSH越大,降解效率越高.Tribedi等(2014)通过改变培养基中葡萄糖和硫酸铵的浓度提高Pseudomonas sp. AKS2菌株的CSH,CSH从18%提高到43%,对聚乙烯琥珀的降解率从16%提高到54%.Zhang等(2010)也比较了具有不同CSH的Serratia spp. JC1和Serratia spp. JCN13降解高效氯氰菊酯的效率,经过4 d的降解后,CSH为91%的JCN13降解效率为90%,而CSH为63%的JC1降解效率只有80%,结果同样表明CSH的提高能够加快高效氯氰菊酯的降解并提高其利用效率.

Singleton等(2001)研究发现由于具有较高CSH的细胞比具有较低CSH的细胞更容易接触到疏水性VOCs,从而更高的CSH的细胞降解疏水性VOCs的效果更好.同样,Tribedi等(2012)Zhang等(2010)的研究都推测出高CSH细胞能够更好地附着在疏水性底物或者疏水性底物形成的液滴表面,进而加快了对该底物的降解.因此在本实验中推测可能是CSH的提高,增加了微生物对疏水性底物的吸收和降解,或者是疏水性VOCs更容易吸附在高CSH细胞的表面,进而被高效地降解,具体机理将在后续的研究中进行验证.

图 3 具有不同CSH的NX-1菌株降解正己烷的曲线(误差棒代表 3个平行样的标准偏差) Fig. 3 Biodegradation of hexane by NX-1 cells at different CSHs(Error bars represent standard deviations of triplicates)
4 结论(Conclusions)

1)从浙江某制药企业污水处理池的活性污泥中筛选得到一株能以正己烷为唯一碳源且生长良好的高效降解菌株NX-1.经过形态观察、Biolog鉴定和16S rDNA序列分析结果,确定NX-1为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina).

2)通过研究环境条件对CSH的影响,发现pH、淀粉及壳聚糖浓度对菌株NX-1 CSH的影响较大.

3)在单因素实验基础上,确定关键影响参数.选择pH、淀粉、壳聚糖为优化对象,以 CSH为响应值,采用 Design Expert 设计响应面实验,得到CSH最大值的最优条件是:pH为7.61,淀粉浓度为9.39 g·L-1,壳聚糖浓度为1 g·L-1,最大CSH达到56.0%.并且高CSH的NX-1菌株能够加快正己烷的降解速率.

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