2016, Vol. 36
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2. 西北农林科技大学, 杨凌 712100
2. Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100
印染废水的处理一直是污水处理行业的难题(Singh et al., 2011), 而微生物处理法是比较有应用前景, 且不会产生二次污染的处理方法, 它能够将染料分子降解成无色或转化成低毒、无毒的化合物, 也是国内外相关领域一直研究的热点(Khan et al., 2013; Husain, 2006), 但目前的相关研究主要集中在偶氮类、杂环类、蒽醌类废水方面, 对于三芳基甲烷类废水的处理研究相对较少且不够深入.苯胺蓝是一种典型的三芳基甲烷类染料, 结构复杂, 并广泛应用于生物染色、纺织品行业, 苯胺蓝在自然状态下很难被降解或转化, 因此, 产生的废水对环境造成了严重的污染(Azmi et al., 1998).以往对苯胺蓝脱色的研究主要以真菌(白腐真菌)为主(Kaushik et al., 2009; Sanchez et al., 2009), 然而, 利用真菌脱色染料废水存在一定的缺陷(李慧星, 2015)：①多数真菌生长和代谢的周期长, C源利用的多样性较差；②多数真菌是依靠产酶对染料分子进行降解, 但真菌产酶条件苛刻, 受到C、N源的限制性调控较强；③真菌酶的稳定性是限制其大规模应用的主要原因.基于此, 本文以水溶性苯胺蓝作为典型污染物模型, 筛选能够利用多底物的耐热苯胺蓝降解放线菌, 并进行鉴定和污染物的降解研究, 以期为放线菌在三芳基甲烷污水处理中的应用奠定基础.
2 实验材料与方法(Materials and methods) 2.1 实验材料 2.1.1 土壤样品主要采集地：陕西省西安市长安区境内秦岭山麓.采集方法(李振高等, 2008)：除去地面植被, 按蛇形法采集底层腐殖质土壤, 然后混合, 4 ℃保存.
2.1.2 培养基、菌种高氏1号培养基：参照文献(周德庆, 2006).苯胺蓝脱色平板：葡萄糖20.0 g, KNO3 1.0 g, MgSO4 0.5 g, K2HPO4 0.5 g, 琼脂15.0 g, 苯胺蓝0.1 g, 蒸馏水1000 mL, pH自然.苯胺蓝液体脱色培养基：葡萄糖20.0 g, KNO3 1.0 g, MgSO4 0.5 g, K2HPO4 0.5 g, 苯胺蓝0.1 g, 蒸馏水1000 mL, pH自然.菌种：灰色链霉菌标准菌株JF (陕西省微生物研究所保藏中心)
2.1.3 主要仪器与试剂恒温培养箱、恒温摇床、PCR仪、电泳仪、全波长扫描仪、微生物自动分析仪(Biolog)、脱色摇床、冷冻离心机等；苯胺蓝(水溶性)、DNA提取试剂盒.
2.2 实验方法 2.2.1 菌株筛选称1 g土壤倒入10 mL无菌水中, 摇匀, 并于65 ℃保温1 h, 冷却后依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7；然后用移液器吸取100 μL打入苯胺蓝脱色平板中, 涂布均匀, 30 ℃倒置避光静止培养, 每隔12 h观察平板的脱色情况, 并从中挑取具有脱色圈的放线菌, 接入高氏1号培养基上.
2.2.2 菌株C源利用特性及遗传鉴定利用插片法将菌株在平板上培养至长出孢子, 然后将盖玻片放在载玻片上, 在显微镜下观察菌株的菌丝形态；同时, 用无菌棉签从培养皿中蘸取表面孢子(注意不要接触到培养基), 在IF-A比浊管中分散至浊度达到90%~98%之间, 然后用8排自动移液器将菌液加入Biolog genⅢ96孔板中, 30 ℃静置培养, 每隔24 h用Biolog微生物自动分析仪测定对C源及生物因子的利用情况(田雅楠等, 2011).
用DNA提取试剂盒对高氏1号液体培养的菌株进行DNA提取, 采用通用引物进行扩增, 电泳验证, PCR产物在苏州金唯智公司测序, 然后序列在NCBI中进行Blast比对, 构建进化树.
2.2.3 菌株液体苯胺蓝脱色实验配制质量分数0.05‰的苯胺蓝标准溶液, 在可见-紫外全波长扫描仪上进行全波段扫描, 确定苯胺蓝的特征吸收位点.
将初筛得到的菌株接入液体苯胺蓝脱色试管中, 分别在30 ℃下进行摇床培养, 每隔12 h记录脱色情况, 并进行苯胺蓝各基团脱除率的测定.收集菌体, 加入无菌水进行摇瓶解析48 h, 10000 r·min-1离心, 取上清液测定菌体对苯胺蓝的吸附作用.
3 结果与分析(Result and analysis) 3.1 苯胺蓝脱色平板初筛利用苯胺蓝脱色平板初步获得1株放线菌AG-56, 单独点接到苯胺蓝平板和液体苯胺蓝中验证其脱色能力, 结果如图 1所示.从图 1中可以看出, 所筛选的放线菌菌株AG-56在苯胺蓝平板上培养48 h, 产生明显的透明圈, 且透明圈的大小明显大于菌落生长的大小, 说明此菌株能够产生使苯胺蓝褪色的生物酶.而根据文献(Archibald et al., 1992), 该生物酶可能是氧化酶类, 并且是属于胞外酶.从液体脱色情况来看, 接入菌株AG-56的培养基中苯胺蓝的颜色基本消失, 而对照组苯胺蓝的颜色无变化, 说明菌株AG-56对苯胺蓝具有很强的脱色能力, 且通过对离心后的沉淀分析可知, 菌株对苯胺蓝的脱色不仅仅依靠胞外酶, 还有可能菌体自身对苯胺蓝具有一定的直接吸附作用(Si et al., 2013).
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| 图 1 菌株AG-56对苯胺蓝的脱色作用(a.苯胺蓝平板, b.苯胺蓝液体培养3 d后离心上清液) Fig. 1 Decolorization of Aniline Blue with AG-56 |
从图 2可知, 菌株AG-56无论在菌落形态还是显微形态都具有明显的放线菌特征.但此菌株在高氏平板上的气生菌丝并不发达, 孢子成熟后变成灰色(图 2a)；显微镜下AG-56菌丝细长, 相互缠绕, 气生菌丝无分支, 无隔膜(图 2b).
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| 图 2 AG-56培养平板(a, 3 d)与显微的(b, 400倍)形态 Fig. 2 Culture plate (a) and micro-structure (b) of AG-56 |
Biolog平板C源平板是考察目标菌株对71种C源和23种因子的敏感程度的方法(Garland et al., 1991).对AG-56与灰色链霉菌JF (Streptomyces griseochromogenes)进行了71种C源和23种敏感因子测试对比.从图 3可以看出, 在培养初期, 菌株AG-56对C源的利用多样性要低于对比菌株, 且两者对C源的选择性利用表现出了比较大的差异性.菌株AG-56在培养初期能够利用A4(海藻糖)、A5(纤维二糖)、A6(龙胆二糖)、A7(蔗糖)、B1(棉籽糖)、C1(葡萄糖)等15种C源.通过在590 nm和750 nm处吸光值对比发现, 15种C源中对C1(葡萄糖)的利用率最高, 说明葡萄糖是菌株AG-56的最直接C源；而对比菌株(Streptomyces griseochromogenes)在初期能够利用21种C源, 但只有A5(纤维二糖)、C1(葡萄糖)、H1(吐温40)、H4(β-羟基-D, L丁酸)、H6(乙酰乙酸)、H8(乙酸)6种C源与菌株AG-56相同, 说明两者的直接C源特性相差较大.
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| 图 3 AG-56(a.24 h, b.120 h)与对比菌株(c.24 h, d.120 h) C源、敏感因子代谢图(黑色实心圆表示对该因子/碳源非常敏感/可利用-阳性；灰白色半圆表示对该因子/碳源较为迟钝/可利用性差-半阳性；白色圆圈表示对该因子/碳源非常迟钝/不可利用-阴性) Fig. 3 source and the sensitive factor metabolic of AG-56and Streptomyces griseochromogenes |
随着培养的进行, 经过不同C源的连续诱导, 菌株AG-56的C源利用开始呈现多样性, 在培养120 h后除B2(乳糖)、B6(N-乙酰-D-葡糖胺)、D2(甘露醇)外, 其它碳源都有所利用；而对比菌株经过120 h后, 可利用C源数量稍有增加, 但多样性显著低于AG-56.说明菌株AG-56具有很强的适应能力, 且在复杂C源的条件下依然能够生长旺盛, 在成分复杂的污水处理方面展现出了一定的应用前景.
在敏感因子方面, 菌株AG-56在培养初期对大多数因子比较敏感, 随着培养的进行, 菌株慢慢对抑制因子产生了一定的抗性, 在培养120 h时, 菌株对D11(利福霉素)、H10(氨曲南)、G10(萘啶酮酸)、G12(亚碲酸钾)、高盐及低pH产生了耐性.对比菌株Streptomyces griseochromogenes在培养初期对敏感因子的抗性要稍强于测试菌株AG-56, 但培养120 h后, 对比菌株虽然抗性因子的种类有所增加, 但稍差于测试菌株, 主要表现在G10(耐鼎酮酸)、G11(氯化锂)、G12(亚碲酸钾)、H10(氨曲南)的抗性上.菌株AG-56在复杂环境中表现出了很强的适应能力和代谢多样性, 具有极高的潜在利用价值.
3.2.3 遗传学鉴定通过16S rDNA测序得到1485个碱基, 并与NCBI数据库中比对, 发现菌株AG-56与放线菌中链霉菌属的序列相似性达到99%, 并与灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)属同一分支.利用MAGA4软件构建系统发育树, 结果如图 4所示.
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| 图 4 AG-56遗传进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of AG-56 |
对苯胺蓝标品做全波长扫描结果(图 5)显示, 液体苯胺蓝在192、314、602 nm处具有明显的吸收峰, 602 nm处是苯胺蓝发色基团的吸收峰, 这与文献(张瑞景, 2014)报道一致, 192、314 nm处是紫外基团的吸收峰, 文献中未见报道, 且以往的研究主要针对可见区基团的降解, 并未涉及紫外吸收基团的降解.
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| 图 5 苯胺蓝标品全波长扫描(图中1、2、3表示对应的出峰顺序) Fig. 5 Aniline Blue label scan curve |
链霉菌AG-56对苯胺蓝3个特征波长基团的降解率如图 6所示.从图 6中菌株生长曲线与降解曲线的关系可以看出, 菌株对苯胺蓝的降解主要发生在菌种进入稳定期后.即60 h前主要是菌种的生长及诱导产酶期, 并伴随菌株对苯胺蓝的吸附作用(图 7), 这与真菌对染料的降解相似(Si et al., 2013).对于602、314 nm处基团, 菌体吸附发挥作用主要在前期, 60 h以后, 菌体吸附的贡献率直线下降；且从理论上讲, 菌体对苯胺蓝的吸附是有限的, 而后期主要依靠菌体产酶对苯胺蓝的降解, 602 nm处基团降解96 h, 降解率达到70%以上, 菌株对602 nm处基团的降解是苯胺蓝脱色的主要原因.对314 nm处基团的降解主要发生在72 h后, 并且在监测时间内, 最大降解率只达到了32%, 而菌体吸附作用也只提供了10%以下的去除率.对苯胺蓝192 nm处基团的降解自菌体生长开始就处于一种稳步上升的趋势, 说明菌体对此波长处基团的吸附作用最大, 虽然72 h后, 降解效率稍有提高, 但从图 7中可以明显看出, 菌体的吸附作用仍然占有80%以上的去除贡献率.当最大降解率达到48%时, 菌体吸附仍然是192 nm处基团去除的主要作用.
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| 图 6 菌株AG-56对苯胺蓝的脱除曲线 Fig. 6 Decolorization curve of Aniline Blue with Streptomyces AG-56 |
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| 图 7 AG-56菌体吸附作用对苯胺蓝脱除的贡献率 Fig. 7 The contribution rate of bacteria adsorption of Aniline Blue removal |
因此, 菌株对苯胺蓝特征基团的降解能力顺序为602 nm基团＞192 nm基团＞314 nm基团, 并由图可推测AG-56对602 nm、314 nm处基团的降解主要是依靠菌株进入稳定期后产酶的作用, 对192 nm处基团的脱除存在物理吸附和产酶降解两种主要作用(Si et al., 2013), 且以菌体吸附作用为主.
从图 8可以看出, 在AG-56对苯胺蓝的脱色过程中, pH随着菌体的生长逐渐降低, 特别是60 h后, 菌体进入稳定期, 苯胺蓝进入了快速降解期, pH也下降较快.这说明菌体进入稳定期后, 可能开始分泌能够降解苯胺蓝的酸性酶类, 随着酶分泌的越多, 使得pH呈现下降趋势.
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| 图 8 苯胺蓝降解过程中pH的变化 Fig. 8 pH changing in degradation of Aniline Blue |
微生物法是降解苯胺蓝等复杂染料的有效途径, 目前对于放线菌用于染料脱色的研究还相对较少, 不过研究发现, 一些放线菌包括分枝杆菌也能够对三苯基甲烷类染料进行脱色.1991年, Yatome等(1993)首先报道了放线菌对三苯基甲烷染料的生物降解, 发现两株放线菌Nocardia corallina和N. globerula对结晶紫具有脱色活性.Jone和Falkinham (2003)也发现了5种分枝杆菌(Mycobacterium avium、M. intracellulare、M. scrofulaceum、M. marinum和M.chelonae)均能对孔雀绿和结晶紫进行脱色.国内广东农科院研究人员筛选到两株木质素降解链霉菌, 在苯胺蓝固体平板上培养5 d后, 能产生脱色圈(顾文杰等, 2012).
本实验所筛选的放线菌StreptomycesAG-56在多种C源的利用性、可诱导性及对苯胺蓝的降解方面都展现了极好的性能, 表明其在污水处理特别是三芳基甲烷类染料废水处理方面具有较高的应用价值.而后续对于StreptomycesAG-56的研究应主要集中在StreptomycesAG-56的降解机理、分子机制、污染物耐受机制、降解动力学等系统性的科学问题上, 以期能够为该菌株的工业化应用奠定坚实的理论基础.
5 结论(Conclusions)1) 从土壤中分离获得了一株能够降解水溶性苯胺蓝的放线菌, 经过形态观察和16S rDNA遗传鉴定为链霉菌属(Streptomyces), 命名为Streptomyces AG-56, 且通过与链霉菌属中的灰色链霉菌对比发现, Streptomyces AG-56菌株具有比灰色链霉菌更广泛的C源利用特性和可诱导性.
2) Streptomyces AG-56在液体条件下对苯胺蓝的3个吸收波长基团都具有降解能力, 对602 nm处发色基团的降解能力最大, 即能够对苯胺蓝进行脱色.菌种进入稳定期后, pH逐渐下降, 菌体开始分泌降解苯胺蓝的酸性酶类, 苯胺蓝的降解主要发生在此时期内.另外, 菌株的物理吸附对液体中的苯胺蓝具有一定的脱除作用.
致谢(Acknowledgement): 感谢陕西省微生物研究所和西北农林科技大学资源环境学院为本研究所提供的实验平台.| [${referVo.labelOrder}] | Archibald F S. 1992. A new assay for lignin-type peroxidases employing the dye azureB[J]. Applied and Environmental Microbiology, 58(9) : 3110–3116. |
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