1 引言(Introduction)

随着金属冶炼、采矿、塑料、电镀、皮革业等行业的迅猛发展, 含镉废水的排放量剧增, 镉污染问题频现(Kavak, 2013).人类在摄入一定量的镉元素后可患癌、致畸, 并对人体内多种酶产生影响(Kim et al., 2014; Hashim et al., 2011).与此同时, 随着环境重金属污染问题的加剧, 对于重金属污染的治理已迫在眉睫(Demirbas, 2008; Mohamed et al., 2014).

废水中重金属的处理方法主要分为物理法、化学法、生物法等, 近年来, “绿色”治理逐渐兴起, 而其中的固定化微生物修复技术因具有二次污染小、吸附率较高、环保经济、应用前景好等优点, 被频繁地应用于重金属、有机污染废水治理中, 符合绿色治理的概念, 成为近年水处理技术的热门发展方向(Gupta et al., 2006; Shafaei et al., 2007; 于明革等, 2010; Ghosh et al., 2015).

目前, 用于固定化技术的微生物主要有黄孢原毛平革菌、白腐真菌、酿酒废酵母菌、鲁氏酵母菌、多黏类芽孢杆菌、硫酸盐还原菌、简青霉菌、黑根霉菌等；常见的固定化载体包括海藻酸钠、聚乙烯醇、壳聚糖、生物炭、生物材料(如秸秆、丝瓜囊等).也有研究人员将磁性纳米颗粒进行混合用于固定化, 制得具有一定磁性便于分离的生物吸附剂, 发现其对重金属的去除效果较好.例如, 徐雪芹等(2008)将简青霉用丝瓜囊固定化后用于吸附废水中的Pb²⁺、Cu²⁺, 吸附率均达到98%, 吸附量分别达到223.36、163.28 mg·g^-1；张静进等(2010)用海藻酸钠固定多黏类芽孢杆细菌并用于Pb²⁺的吸附, 吸附率达到93.74%, 最大吸附量可达到370.37 mg·g^-1；昝逢宇等(2011)将啤酒酵母菌用海藻酸钠固定后用于Cu²⁺、Cd²⁺的吸附, 其吸附率维持在80%以上, 实际最大吸附量分别可达66.58、75.41 mg·g^-1.超累积植物内生菌作为一类能定殖于超累积植物组织间隙或细胞内部的细菌、真菌, 对重金属具有强耐受性, 是一类很有应用潜力的微生物, 目前的研究主要是将其与各类超累积植物联合修复重金属污染废水、底泥、土壤, 暂没有将其用于微生物固定化技术的报道.纳米Fe₃O₄颗粒作为一种新型的纳米材料, 具有容易制备、磁性强、易于分离、比表面积大、对重金属离子吸附力强等优点, 逐渐成为人们重点关注的研究对象(陈赞等, 2015; 乐兰等, 2015).近年来, 研究人员将纳米Fe₃O₄颗粒进行各种改性以期能更充分地发挥其优势, 并将其应用于固定化微生物中以达到耐用、处理效率高、克服传统材料难回收、难分离等缺点的目的(罗超, 2014).

因此, 本实验将磁性纳米Fe₃O₄颗粒进行二氧化硅改性后, 联合海藻酸钠包埋固定从超累积植物龙葵体内提取得到的植物内生菌Bacillus nealsonii, 制得一种新的生物吸附剂, 以去除水中的Cd²⁺, 并对最佳制备条件及影响因素进行研究, 同时, 对吸附过程中的吸附动力学、吸附等温模型进行探究, 以了解吸附过程中的吸附机理.

2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 微生物的来源

实验所用菌种为本实验组采用肖潇等(2011)的方法从超累积植物龙葵(采自湖南省衡阳市水口山尾砂库周边)体内分离所得.提取得到的微生物对重金属Cd²⁺有着较强的耐受性, 最高浓度可达80 mg·L^-1.此菌株编号为LRE04, 经16S rDNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属, 命名为Bacillus nealsonii(GenBank序列登录号为KF535131).

2.2 菌悬液的制备

将从龙葵体内提取的微生物LRE04进行扩大培养.调节种子液培养基pH为7.0, 在立式压力蒸汽灭菌筒(DY04-13-44-00型)中于0.1 MPa下灭菌30 min.在经过扩大培养的新鲜的内生菌斜面上挑取菌落, 接种到装有50 mL种子液培养基的100 mL锥形瓶内, 在30 ℃、150 r·min^-1的天呈恒温振荡器(TS-2102型)中培养24 h, 将此培养液作为植物内生菌LRE04接种时所用的种子液.发酵液培养基pH不需调节, 为自然pH, 将其置于0.1 MPa下灭菌30 min, 在无菌操作条件下以体积分数为2%的接种量接种种子液于含50 mL培养基的100 mL锥形瓶中, 在温度30 ℃、150 r·min^-1下振荡培养48 h后, 取出置于4 ℃下备用.

2.3 固定化微生物小球的制备

将改性磁性纳米颗粒按0.5~2.0 g·L^-1的量加入到30~80 g·L^-1的海藻酸钠溶液中, 然后在105 ℃条件下灭菌30~60 min, 最后在无菌条件下冷却60~90 min, 制得无菌改性磁性纳米颗粒与海藻酸钠混合液；无菌条件下, 在上述溶液中接入微生物悬浮液, 每100 mL混合液中的接种量为0.1~0.8 mL, 充分摇匀混合后得到混合溶液, 将1体积混合溶液渐渐滴到4~10体积的灭菌CaCl₂溶液中, 在室温下静置一段时间后得到二氧化硅改性磁性纳米颗粒+内生菌+海藻酸钠小球颗粒的反应溶液, 再将固定化微生物小球转移至100 mL微生物液体培养基中, 30 ℃、150 r·min^-1条件下培养4 d.

2.4 正交实验的设计

改性磁性纳米颗粒质量分数、海藻酸钠质量分数、菌液接种量、交联时间分别表示为因素A、B、C、D, 各因素的取值范围及水平设计见表 1.

2.5 固定化微生物小球的结构表征

将在最佳制备条件下得到的生物吸附剂进行冷冻干燥后, 部分进行切片, 通过场发射扫描电镜(捷克泰思肯, 型号为TESCAN MIRA3)对其表面、内部结构及附着于吸附剂上的微生物进行形态观察, 以了解制得吸附剂的表面、内部结构及附着于生物吸附剂上的微生物生长状况.

2.6 吸附试验 2.6.1 吸附影响因素

配制浓度分别为40、50、60、70、80、90 mg·L^-1的Cd²⁺溶液, 将pH调至3、4、5、6、7, 分别取出50 mL倒入100 mL的锥形瓶中, 加入3、5、10、15 mL (对应干重分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g·L^-1)的固定化小球, 将其置于30 ℃、150 r·min^-1的恒温摇床中, 设定好时间, 在不同的实验条件下进行球状生物吸附剂的吸附研究.在对应时间吸附后, 定时取样, 并进行过滤, 取其滤液进行测定.用AAalyst700原子吸收分光光度计测定溶液中剩余金属离子的浓度, 每个样品设定3个平行样, 取其平均值.

2.6.2 吸附动力学实验

本实验是在pH为6, 转速为150 r·min^-1, Cd²⁺浓度分别为5、10、15 mg·L^-1的条件下, 吸附720 min过程中考察磁性聚乙烯醇固定化LRE04球状生物吸附剂对Cd²⁺的吸附情况, 得出不同时间内吸附剂对Cd²⁺的吸附率及吸附容量平均值, 再对得到的数据进行线性拟合.

2.6.3 吸附等温模型实验

在温度298、303、308 K下, 向浓度为5~50 mg·L^-1的Cd²⁺溶液中投加对应量的球状生物吸附剂, 调节溶液pH为6, 在转速为150 r·min^-1的恒温振荡器上振荡相应时间后, 取出离心分离后, 取上清液测量其中Cd²⁺含量, 设定3组平行实验, 计算吸附率及吸附量的平均值.

3 结果与讨论(Results and discussion) 3.1 固定化微生物小球的最佳制备条件

采用正交表L9(3⁴)并按照表 1确定的因素及其水平组织实验, 将Cd²⁺的吸附率作为考核指标.求出各因素不同水平下的实验结果之和, 分别以K₁、K₂、K₃表示, 根据其大小来判断最佳水平.由实验结果可知, 因素A以水平2最佳, 因素B以水平3最佳, 因素C以水平2最佳, 因素D以水平1最佳；同时, 通过极差R来判断可知, 各因素的影响大小顺序为B>A>C>D, 即吸附剂的最佳制备条件为B₃A₂C₂D₁.

综合上述结果分析可得, 固定化微生物小球的最佳制备条件为改性磁性纳米颗粒质量分数0.1%、海藻酸钠质量分数8.0%、菌液接种量0.4%、交联时间2 h.

3.2 固定化微生物小球的吸附性能评价 3.2.1 pH对吸附性能的影响

废液pH值对提取所得的内生菌LRE04及制备得到的固定化微生物小球吸附Cd²⁺的影响较强, 从图 1a可看出, 当溶液pH从3增加至6时, 吸附率随之增加, 当pH达到6时, 吸附率可达最大值89%, pH值为7时, 吸附率下降.由图 1a还可知, 将微生物进行固定化后制得的小球对重金属的吸附率较单独微生物有大幅度的增加, 且固定化微生物小球比微生物活体吸附剂对重金属溶液的pH有着更强的耐受适应能力.

固定化微生物小球的表面电荷和电离度极容易受溶液pH影响, 进而影响其化学特性和表面特征.当pH过低时, 水合氢离子(H₃O⁺)会占据附着在小球表面及孔隙中微生物细胞壁的链接基团, 产生斥力作用阻碍Cd²⁺向细胞靠近, 溶液pH值越低水合氢离子(H₃O⁺)越多阻力越大.但随着pH值升高并超过Cd²⁺产生微沉淀的上限时, 溶液中的大量Cd²⁺会以不溶解氧化物、氢氧化物微粒的形式, 使吸附无法进行(Ghosh et al., 2015).本实验用于吸附的固定化微生物小球是以海藻酸钠、改性磁性纳米颗粒包埋植物内生菌LRE04制得, 相比单一内生菌LRE04而言, 其吸附Cd²⁺时受溶液pH值影响较小, 也有着相对较高的吸附率.改性磁性纳米颗粒因粒径小、比表面积大、具有磁性等特点, 本身对Cd²⁺有着较强的吸附能力, 如乔永生等(2015)利用二氧化硅改性磁性纳米颗粒吸附废水中的Cd²⁺, 发现其吸附率可达到91%；黄文等(2012)发现Fe₃O₄/SDS纳米颗粒对废水中Cd²⁺的吸附率可达87%.而固定化微生物小球表面、孔隙均可供内生菌LRE04附着, 从超累积植物龙葵体内获得的LRE04细胞表面含有羧基和羟基, 能螯合转化吸附Cd²⁺, 本身对Cd²⁺有着一定的吸附、转化作用.固定化微生物吸附剂的吸附率是单独微生物的2.6倍.

3.2.2 吸附时间对吸附性能的影响

由图 1b可知, 吸附时间对固定化微生物小球处理含镉废水有着相对大的影响, 在前12 h内属于快速吸附, 其速率相对较大；在12 h后吸附速率逐渐减小直至不变, 吸附过程基本趋于平衡；在12~24 h间, 溶液中Cd²⁺浓度的变化不大, 说明固定化微生物小球表面及孔隙的吸附点被充分占据.固定化微生物小球表面孔隙、附着内生菌衣鞘、细胞壁对Cd²⁺的吸附起很大作用, 有一部分Cd²⁺也可通过微生物离子转移系统进入内生菌内部转化成其他无毒化合物(Alkan et al., 2015).

3.2.3 吸附剂用量对吸附性能的影响

在Cd²⁺初始浓度为50 mg·L^-1、生物吸附剂用量(干重)分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g·L^-1的条件下, 考察吸附剂用量对吸附过程的影响, 结果如图 1c所示.由图可知, 随着吸附剂用量的增加, 吸附剂对Cd²⁺的吸附率逐渐升高, 吸附剂用量从2.0 g·L^-1增长到2.5 g·L^-1时, 吸附率从82%增加到96%.

固定化小球表面吸附位点会随着吸附剂用量的增大而增加.同时, 吸附效率的增加也与吸附位点和Cd²⁺之间的浓度梯度差有关, 浓度差使得固定化微生物小球对Cd²⁺的吸附动力增加.但吸附剂用量增加到一定程度后, 吸附率开始减小, 首先吸附剂用量增加会使得固定化微生物小球产生团聚, 吸附剂的有效表面积增加有限, 从而导致吸附容量的下降, 使得部分固定化微生物小球达不到饱和吸附状态.

3.2.4 离子初始浓度对吸附性能的影响

一般而言, 重金属离子的吸附过程与重金属离子浓度/生物量之比有关, 增大重金属离子的初始浓度可以使得吸附剂的吸附量增加(Boschi et al., 2011).在低浓度重金属离子存在的条件下, 金属离子的浓度越高, 则吸附剂表面吸附位点更容易被占满, 吸附剂的利用率较高, 吸附剂的吸附率逐渐增加, 单位数量吸附剂所吸附的金属的量也比较大.但当重金属离子浓度超过一定浓度时, 吸附位点饱和度也会增加, 空的结合点逐渐减少, 吸附量会因为吸附剂表面吸附位点的饱和而不再继续增加, 反而会降低重金属离子的吸附率.而且, 在活体细胞吸附重金属的过程中, 增加金属离子的浓度会增大对生物的毒性, 会影响甚至抑制生物体的生长及代谢活动, 从而抑制吸附过程的进行(Sar et al., 2009).从图 1d可以看出, Cd²⁺初始浓度从40 mg·L^-1升至50 mg·L^-1时, 该吸附剂对Cd²⁺的吸附率增加并达到最高, 吸附率达90%以上, 有着很好的去除效果；当Cd²⁺浓度大于50 mg·L^-1时, 吸附剂的吸附率下降.

综上来看, 在pH为6, 吸附时间达到12 h, 吸附剂用量为2.5 g·L^-1(以干重计), Cd²⁺初始浓度为50 mg·L^-1时, 固定化小球对Cd²⁺的吸附率最佳, 可达96%, 与其他吸附剂对Cd²⁺的吸附率(如黄沅清等(2015)用氨三乙酸酐改性纤维对Cd²⁺的吸附率最高达90.6%, 朱健等(2015)利用复合改性的硅藻土对Cd²⁺的吸附率最高达76.5%)相比, 本研究所制得的这种新型球状生物吸附剂对于Cd²⁺的吸附能力处于一个较高的水平.

3.3 扫描电镜观察结果

从图 2a、2b可以看出, 此种生物吸附剂的表面及内部的孔隙很多, 增加了吸附剂内部及表面的孔隙率、比表面积, 很利于吸附剂对废液中Cd²⁺的吸附、富集.从图 2c可看到, 吸附剂所附的微生物生长状况较好, 很牢固地附着于吸附剂表面, 增大了比表面积, 有利于废液中Cd²⁺的附着及传输到内部孔隙中；同时, 吸附剂内部与表面的微生物细胞壁有着较多的官能团(羟基、羧基、氨基等), 这些官能团可对废液中的Cd²⁺产生键合力, 能很好地吸附废液中Cd²⁺.

3.4 吸附动力学

将动力学实验得到的数据带入Langergren准一级动力学方程(式(1))和准二级动力学方程(式(2))进行拟合, 拟合得到的参数及结果见表 2.由表 2可知, 对吸附的前60 min数据进行拟合, 发现R²值很高, 不同浓度下的R²分别达到了0.9956、0.9964、0.9972, 说明在前60 min内吸附过程符合准一级动力学.而对于准二级动力学拟合情况, R²值分别达到0.9996、0.9997、0.9994, 比准一级动力学的R²值高.由此可见, 整个吸附过程更符合准二级动力学, 即化学键的形成对吸附有着很大影响, 此生物吸附剂对Cd²⁺的吸附以化学吸附为主(Gupta et al., 2010).

(1)

(2)

式中, q_e为吸附平衡时的吸附容量(mg·g^-1)；q_t为吸附t时刻的吸附容量(mg·g^-1)；K₁为一级吸附速率常数(min^-1)；K₂为二级吸附速率常数(g·mg^-1·min^-1).

3.5 等温吸附模型

在pH为6、温度为30 ℃、转速为150 r·min^-1的条件下, 配制浓度为5~50 mg·L^-1的Cd²⁺溶液, 做12 h的平衡吸附试验, 并绘制等温吸附曲线, 进行等温模型拟合, 其中, Freundlich等温吸附模型及Langmuir等温吸附模型的表达方程如式(3)、(4)及(5)所示.

(3)

(4)

(5)

式中, q_e为吸附平衡时的吸附容量(mg·g^-1)；q_m为吸附剂的最大吸附容量(mg·g^-1)；C_e为吸附平衡时溶液中Cd²⁺的浓度(mg·L^-1)；K_L为表征吸附能力的吸附平衡常数(L·mg^-1)；R_L为平衡常数, 判断反应是否可行；K_F为Freundlich吸附容量常数；n为亲和常数.

采用Langmuir模型和Freundlich模型拟合的相关参数见表 3.等温线用Langmuir方程拟合时, 可由拟合相关参数求出R_L值.其中, R_L是表示吸附剂亲和力的一个常数(Mabrouk et al., 2012; Ponnusamy et al., 2012), 0 < R_L < 1时, 说明有利于吸附；R_L>1时, 说明吸附性能较差；R_L=1时, 说明整个吸附过程呈线性关系；R_L无限趋于0时, 说明整个吸附过程不可逆.从表 3可以看出, R_L值在0~1之间, 说明此生物吸附剂对Cd²⁺吸附有利, 易于吸附.

Freundlich模型中的n值是吸附剂吸附作用强弱的指标, 1/n越大, 吸附能力越大.从表 3中可以看出, 随着温度升高, 1/n值逐渐增加, 可知随着温度升高, 固定化生物吸附剂对Cd²⁺的吸附作用不断增强.Freundlich模型通常能较好地描述各种不理想情况下的表面吸附及多分子层吸附(Montazer-Rahmati et al., 2011).由表 3还可以看出, Langmuir模型与Freundlich模型的R²值均比较大, 说明吸附过程用这两类模型均能较好地拟合, 但不同浓度下Langmuir模型的R²值均比Freundlich模型的R²值更大, 两者模型拟合得到的R²分别为0.9509、0.9126、0.9130和0.9689、0.9833、0.9726.因此, 改性磁性纳米颗粒固定化内生菌小球对Cd²⁺的吸附平衡能较好地用Langmuir模型描述, 由此计算得到的最大单分子层吸附量为13.02 mg·g^-1.

3.6 固定化微生物小球的解吸特性

为提高固定化小球的利用率, 并回收部分金属, 需对固定化小球做吸附-解吸实验, 通过测定其解吸率来确定其可循环利用的次数.本实验采用1 mol·L^-1的HCl作为解吸剂, 在吸附后用无菌生理盐水洗涤固定化小球3次, 然后用等体积的盐酸在摇床中进行解吸实验, 解吸时间为30 min.进行吸附解吸循环5次, 吸附-解吸实验中所用Cd²⁺溶液浓度为50 mg·L^-1, 实验结果见表 4.

实验结果表明, 固定化小球吸附-解吸循环5次后, 其吸附率仅比第1次下降了5%, 由此可知, 用改性磁性纳米颗粒固定化微生物可高效反复地吸附溶液中的Cd²⁺, 能有效地循环利用, 循环解吸5次后解吸率仍高达86%左右.

4 结论(Conclusions)

1) 改性磁性纳米颗粒固定化植物内生菌LRE04吸附剂最佳制备条件为:改性磁性纳米颗粒质量分数0.10%、海藻酸钠质量分数8%、菌液接种量0.4%、交联时间2 h.

2) 固定化微生物小球对Cd²⁺有较好的吸附性能.固定化小球最佳吸附条件为pH 6, 吸附时间12 h, 吸附剂用量(干重)2.5 g·L^-1, Cd²⁺初始浓度50 mg·L^-1, 此条件下固定化小球对Cd²⁺的吸附率最佳可达96%.

3) 通过扫描电镜观察可以看出, 制备得到的生物吸附剂的内外部结构孔隙率相对较大, 同时, 附着于吸附剂表面的微生物生长状况良好, 整个吸附剂的结构利于吸附剂对废水中Cd²⁺的吸附.

4) 改性磁性纳米颗粒固定化植物内生菌LRE04小球对重金属Cd²⁺的吸附动力学符合准二级动力学, 以化学吸附为主, 整个过程的吸附平衡能较好地用Langmuir模型及Freundlich模型拟合, 但Langmuir模型的拟合效果更好, 其吸附过程主要为单分子层吸附, 最大吸附量可达13.02 mg·g^-1.

5) 解吸结果表明, 固定化小球可高效反复地吸附溶液中重金属离子, 固定化小球经吸附-解吸循环5次后, 小球吸附能力几乎不受影响, 能有效的循环利用.