2016, Vol. 36
[PDF全文]
2. 中石油北京天然气管道有限公司, 北京 100101
2. PetroChina Beijing Gas Pipeline Co. Ltd., Beijing 100101
石油污染对生态环境造成的危害日益严重, 采用物理或化学手段可有效降低石油污染, 但存在二次污染及治理成本高、条件苛刻等缺点, 生物降解法具有条件温和、环境影响小、适应性广等优点, 是治理石油污染有效方法之一(Al Saleh et al., 2009；Yang et al., 2014；Dean Ross et al., 2002；Xia et al., 2005；Ibrahim et al., 2013).已报道能降解石油的微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母及藻类.其中以细菌种类最多, 主要有假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)(Likhoshvay et al., 2013；Petrikov et al., 2013；Takeno et al., 2005；Biswal et al., 2009).不同环境来源微生物特性差别较大, 对石油组分降解能力及降解途径不同, 我国大部分油田开采及运输区冬季冰期较长、平均气温低, 微生物处理效果受温度等条件影响大, 寻找耐高盐、酸碱等极端环境微生物具有重要意义(徐成斌等, 2014；Brakstad et al., 2006；Kunihiro et al., 2005).
本文从我国西部石油污染土壤中筛选了一株适应性强、降解能力高的石油降解菌株, 进行了生理生化及16S rDNA序列分析, 并对菌株生长及降解特性进行研究.将该菌添加到活性污泥中, 采用SBR间歇式活性污泥法处理含油废水效果良好(李哲等, 2000；Lackner et al., 2015), 为极端环境下微生物治理石油污染及含油废水处理提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 样品及培养基污染土样取自于甘肃金川公司周边石油污染土壤, 原油样品来自于中石油兰州石化公司.
LB培养基：蛋白胨5.0 g；酵母粉2.5 g；NaCl 5.0 g；琼脂10.0 g；pH 7.0；蒸馏水500 mL.
基础培养基：NH4NO3 3.0 g；K2HPO4 1.5 g；KH2PO4 1.5 g；NaCl 0.5 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；FeCl2 0.01 g；CaCl2 0.01 g；pH 7.0；蒸馏水1000 mL.
2.2 试剂及仪器Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Maker 2000、细菌基因组DNA提取试剂盒(均来自上海生工生物工程股份有限公司), Agarose(TaKaRa Biotechnology), 十七碳酸甲酯(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司), 石油醚(天津市富宇精细化工有限公司).
TRACE DSQ GC-MS联用仪(美国赛默飞世尔科技有限公司), UV-2102PC紫外可见分光光度仪(尤尼柯上海仪器有限公司), Tanon-3500凝胶图像处理系统、EPS-300电泳仪(上海天能科技有限公司), TC-96/G/H PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司), 5B-3B(V8)水质测定仪(兰州连华环保科技有限公司).
2.3 石油降解菌的筛选及鉴定取10 g石油污染土样加入100 mL无菌水中, 于30 ℃、150 r·min-1振荡培养24 h.取上层液体2 mL, 加入到100 mL以原油为唯一碳源的基础培养基驯化培养, 原油浓度逐级递增为1000, 2000, 3000, 4000 mg·L-1, 每次驯化周期为3 d.取末次驯化培养液, 以10-1、10-3、10-5倍稀释, 在LB培养基上涂板, 分离优势菌, 于-80 ℃保藏备用.已分离菌株再转接到原油浓度为3000 mg·L-1的基础培养基中, 于30 ℃、150 r·min-1培养7 d, 测定石油降解率, 最后选取1株适应能力强、高效利用石油菌株JC-106.细菌形态观察、革兰氏染色、生理生化鉴定参照文献进行(Michael et al., 2005；东秀珠等, 2001).
用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取细菌总DNA, 采用16S rDNA通用引物(27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGCTC AG-3′；1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)扩增目的片段, 反应循环参数如下：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性50 s, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 30个循环, 72 ℃延伸10 min.PCR产物送上海生工生物工程公司测序, 在NCBI基因库中进行BLAST比对, 通过CLASTAL X和MEGA4.0软件构建系统发育树.
2.4 石油降解菌生长特性菌株JC-106按1%接种量(V/V)接入LB液体培养基, 分别于5、15、25、30、35、40、45、55 ℃, 150 r·min-1振荡培养24 h, 测定各培养液OD600 nm, 确定菌株的最适生长温度.选择初始pH分别为2、4、6、7、8、10、12, 盐度分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%, 于35 ℃、150 r·min-1条件下培养24 h, 测定各培养液的OD600 nm, 确定菌株的最适生长pH和盐度.
取JC-106菌液2 mL转接到原油浓度为3000 mg·L-1基础培养基, 分别在15、35 ℃条件下振荡培养, 在1、3、5、7、10、15、20 d对进行取样涂平板计数, 计算菌株在原油培养基中生长数量.
2.5 石油降解率测定将菌株JC-106接种于含3000 mg·L-1原油基础培养基中, 分别于15、35 ℃, 150 r·min-1振荡培养15 d, 试验设3组平行、3组空白.重量法测定石油降解率, 即以石油醚为萃取溶剂, 对残余原油进行反复萃取回收, 萃取液用干燥无水硫酸钠过滤到烧杯中, 自然干燥并称重.石油降解率(η)按(1)式计算：
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(1) |
式中, M1为对照组石油质量(g), M2为样品组石油质量(g).
用正己烷萃取培养液中剩余原油, 过滤掉残余菌体和杂质, 定容到100 mL容量瓶中.以十七烷碳酸甲酯作为内标物(IS), 用GC-MS对石油烷烃组分进行分析, 用内标法测定残余石油中烷烃组分含量.GC-MS运行条件：DB-5MS毛细管柱30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；采用程序升温, 柱温50 ℃, 维持3 min后以15 ℃·min-1的速率升到120 ℃, 再以8 ℃·min-1升温速率升到260 ℃, 保持25 min.载气氦气, 柱流量1 mL·min-1, 分流比20:1.进样口温度250 ℃, 传输线温度260 ℃, 进样量1 μL, 离子源温度250 ℃, EI源, 电离电压70 eV；扫描范围35~650 amu.
2.6 菌株在不同有机碳源中生长特性将菌株JC-106接到不同浓度十二烷、二十四烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、联苯、邻苯二酚、芘、萘、蒽、菲为唯一碳源的基础培养基, 于35 ℃、150 r·min-1培养7 d, 取样计数, 计算菌株在不同有机碳源中生长数量.
2.7 石油降解菌对含油废水的处理从兰州市某污水处理厂生物曝气池取一定量活性污泥对其进行5 d驯化培养, 按泥水比为1:3的比例, 取活性污泥2.3 L、水6.9 L加入圆柱形生物反应器中(h=80 cm、d内=14 cm、σ=0.5 cm、V有效=12.3 L).以葡萄糖(700 mg·L-1)、氯化铵(120 mg·L-1)、磷酸二氢钾(7 mg·L-1)为进水营养物质, 进水各指标浓度为COD：656.9 mg·L-1；NH4+-N：48.74 mg·L-1；TP：1.232 mg·L-1；原油：1000 mg·L-1.室温为26~34 ℃, 1 d运行两个周期, 曝气10 h, 停留2 h, 在装置停止运行期间加营养换水.以2%(V/V)接种量接JC-106菌液于反应器中作为实验组, 以不加JC-106菌液反应器为空白对照组.分别于1、3、5、7、10、12、15 d取样, 测定出水COD、NH4+-N、TP、原油浓度, 计算各指标去除率.实验组反应器中JC-106菌株进行分离、鉴定, 计算JC-106在反应器中数量.
3 结果(Results) 3.1 石油降解菌筛选和鉴定从西部石油污染土壤分离到具有高效石油降解能力的优势菌株JC-106, 菌落呈桔红色, 圆形不透明, 表面光滑, 边缘规整, 细胞为球杆状, 细菌16S rDNA与赤红球菌(Rhodococcus rubber, NR_118602.1)序列相似性为100%, 菌株在GenBank中序列登录号为KT247409, 在系统发育树上与其聚类(图 1), 初步确定JC-106为赤红球菌(Rhodococcus rubber).
| 表 1 菌株JC-106生理生化特征 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain JC-106 |
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| 图 1 菌株JC-106的系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree of strain JC-106 |
把JC-106接种于LB液体培养基, 分别在不同温度、初始pH和盐度下培养.发现其在15～40 ℃、pH 6～8、盐度0～4%的条件下生长良好, 菌株最适生长温度为35 ℃, 最适pH 8, 最适盐度为1% (图 2A、B、C).JC-106在原油为唯一碳源的培养基生长情况如图 2d所示, 15 ℃培养时, JC-106在最初1～3 d生长缓慢, 3 d后菌体数量明显增长, 15 d时达最高.在35 ℃培养时, 在1 d数量明显增加, 5 d达最高, 7 d后菌体数量开始下降.
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| 图 2 菌株JC-106生长特性(a.温度对菌株生长影响；b.初始pH对菌株生长影响；c.盐度对菌株生长影响；d.菌株在含原油培养基中生长特征) Fig. 2 Growth characteristics of strain JC-106 (a. Effect of culture temperature on the cell growth; b.Effect of initial pH on the cell growth; c.Effect of NaCl concentration on the cell growth; d. Growth characteristics of strain in the medium with crude oil as single carbon source) |
JC-106接种于原油浓度为3000 mg·L-1基础培养基, 分别于15和35 ℃培养15 d, 对原油降解率分别为58.18%和41.61%.GC-MS分析发现原油中以直链烷烃为主, 包括正十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷、二十烷、二十一烷、二十四烷、二十七烷、二十八烷、四十四烷.在35 ℃培养时, 对直链烷烃、植烷、姥鲛烷的降解率分别为98.16%、54.60%和85.46%, 15 ℃培养时的降解率分别为96.13%、48.61%和86.83%(图 3).
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| 图 3 菌株JC-106降解原油的GC-MS分析(a. RT=13.39为正十五烷, RT=16.18为正十七烷, RT=20.36为十七烷碳酸甲酯(内标物), RT=21.22为正二十一烷；b. RT=16.20为姥鲛烷, RT=17.59为植烷, RT=20.36为十七烷碳酸甲酯, RT=23.46为正二十七烷；c. RT=13.43为正十五烷, RT=16.23为正十七烷, RT=20.41为十七烷碳酸甲酯, RT=21.27为二十一烷；d. RT=12.85为植烷, RT=15.48为正二十烷, RT=16.25为姥鲛烷, RT=20.41为十七烷碳酸甲酯) Fig. 3 GC-MS analyses of the oil degradation by strain JC-106(a. RT of 13.39 indicates pentadecane. RT of 16.18 indicates heptadecane. RT of 20.36 indicates heptadecanoic acid, methyl ester. RT of 21.22 indicates heneicosane; b. RT of 16.20 indicates 2, 6, 10, 14-tetramethyl-pentadecane. RT of 17.59 indicates 2, 6, 10, 14-tetramethyl-hexadecane. RT of 20.36 indicates heptadecanoic acid, methyl ester.RT of 23.46 indicates heptacosane. c. RT of 13.43 indicates pentadecane. RT of 16.23 indicates heptadecane. RT of 20.41 indicates heptadecanoic acid, methyl ester. RT of 21.27 indicates heneicosane; d. The RT of 12.85 indicates 2, 6, 10, 14-tetramethyl-hexadecane. RT of 15.48 indicates eicosane. RT of 16.25 indicates 2, 4, 10, 14-tetramethyl -pentadecane. RT of 20.41 indicates heptadecanoic acid, methyl ester) |
将JC-106接于不同有机物为唯一碳源基础培养基中, 35 ℃培养7 d, 结果如表 2所示, 菌株在十二烷、二十四烷、正辛烷中生长较好, 也能在邻苯二酚、萘、蒽等芳香烃的培养基中生长.
| 表 2 菌株JC-106在不同有机碳源中生长情况 Table 2 Growth characteristics of strain JC-106 in the medium with different organic carbon sources |
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通过SBR间歇式活性污泥法, 含油废水处理15 d后, 出水各指标浓度和去除率见图 4, 实验组COD、NH4+-N、TP的平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%, 石油去除率为92.43%, 不加入石油降解菌的对照组去除率为53.80%.菌株JC-106在SBR生物反应器中生长情况见图 5, JC-106在废水中的初始浓度为2.66×109 cfu·mL-1, 在处理含油废水1~15 d的时间内, JC-106数量维持在4.8×1010～1.0×1011 cfu·mL-1.
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| 图 4 含油废水出水指标浓度和去除率 Fig. 4 Removal efficiency of the oily wastewater |
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| 图 5 菌株JC-106在含油废水中的生长情况 Fig. 5 Growth characteristics of strain JC-106 in the oily wastewater |
已报道降解石油微生物超过200多种, 不同菌株对石油组分降解效果存在差异, Quatrini等从地中海海岸线石油污染土壤筛选出一株诺卡氏菌、两株红球菌和两株戈登氏菌, 其中红球菌对C20和C28的降解率分别为54.39%和81.29%(Quatrini et al., 2008).Walter等分离的红球菌可降解芘等多环芳烃(Walter et al., 1991).Soudi等从石油污染土壤分离的红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)SKO-1, 培养56 h后对浓度为1000 mg·L-1苯酚的降解率为99.64%(Soudi et al., 2011).Johnson等分离的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)只对C5~C10烷烃有很好降解效果(Johnson et al., 2006).本文从我国西部石油污染土壤中分离的赤红球菌JC-106在15 ℃培养15 d后对原油的降解率为41.61%.GC-MS分析发现原油中96.13%正构烷烃(C14~C44)被降解, 同时也能降解支链和复杂的植烷、姥鲛烷等.在正十二烷、正二十四烷、正辛烷及邻苯二酚、蒽、萘等有机物中较好生长, 表明该菌能利用和分解这些化合物.
含油废水通常呈高COD、高油含量、高氨氮等特点, 对其处理难度较大, 利用高效石油降解菌处理含油废水具有广阔应用前景(Mukred et al., 2008；Gryta et al., 2001；Scholz et al., 2000；Kiyono et al., 2003).徐新阳等从石油污染土壤和含油废水活性污泥中驯化了4株石油降解菌, 对含油废水处理64 h后, 发现对含油废水中COD的去除率最高达68.00%, 混合菌对含油废水中COD的去除率明显高于单一菌种(徐新阳等, 2007).罗群等以活性污泥为微生物菌种来源, 构建了小试反应装置, 利用添加柴油的海水驯化高效石油降解菌, 发现柴油大部分组分得到了不同程度降解, 两个平行反应器中柴油的降解率分别达到98.30%和98.80%(罗群等, 2010).本文自主设计SBR活性污泥处理装置, 采用间歇式活性污泥处理方法研究了添加JC-106对高浓度含油废水处理效果, 经15 d处理后, 出水水质中的COD、NH4+-N、TP的平均去除效率高, 对废水中原油有显著降解效果.菌株在含油废水中稳定生长, 一次添加即可维持所需菌量, 且菌体数量一直维持在较高水平, 表明该菌株能适应废水环境, 又呈现出较好原油去除能力.
5 结论(Conclusions)1)从石油污染土壤中筛选出1株高效石油降解菌JC-106, 经细菌形态学、生理生化及16S rDNA序列分析初步鉴定为赤红球菌(Rhodococcus rubber), 该菌具有较广环境适应性, 在15～40 ℃、初始pH 6～8、盐度0～4%条件下生长良好.
2)赤红球菌JC-106在15和35 ℃下培养15 d对原油的降解率分别为41.61%和58.18%, 在35 ℃培养时, 对直链烷烃、植烷、姥鲛烷的降解率分别为98.16%、54.60%和85.46%, 15 ℃培养时的降解率分别为96.13%、48.61%和86.83%.能分解利用十二烷、二十四烷、正辛烷及邻苯二酚、蒽、萘等芳烃.
3)用SBR间歇式活性污泥法, 将赤红球菌JC-106用于含油废水处理, 菌株在含油废水中生长良好, 15 d后处理废水出水的COD、NH4+-N、TP的平均去除率分别为96.49%、96.88%、99.15%, 石油去除率为92.43%, 可用于极端环境石油污染废水处理及污染土壤生物修复.
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