2016, Vol. 36
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二氧化硫(SO2)是一种常见的大气污染物，主要来源于含硫化合物的燃烧、冶炼和加工等过程(Lu et al.，2010).环境中低浓度的SO2可为植物提供硫元素，促进植物生长发育；而高浓度的SO2会影响植物的光合作用和呼吸过程，导致植物生长缓慢，甚至诱发植物死亡(Randewig et al.，2012; Choi et al.，2014).
环境中的SO2经气孔进入植物体内，主要通过产生亚硫酸根(SO32-)和亚硫酸氢根(HSO3-)对组织和细胞产生毒性作用(Lewandowska et al.，2008).进入胞内的SO32-经氧化途径产生硫酸根(SO42-)，或经还原途径生成半胱氨酸，进入细胞硫循环.SO32-氧化过程中会产生活性氧，使胞内活性氧水平升高(Lang et al.，2007; Brychkova et al.，2007).近期本课题组研究发现，SO2胁迫能引起拟南芥和蚕豆叶细胞内NO水平升高(赵均等，2014；李蕊等，2015).
NO和H2O2是植物体内的两种信号分子，在植物响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用(Ma et al.，2010; Sun et al.，2010; Wang et al.，2013).课题组前期研究发现，NO参与SO2胁迫下拟南芥和蚕豆的气孔运动调节(赵均等，2014；李蕊等，2015)；H2O2能够作为信号分子调控SO2诱导的蚕豆保卫细胞凋亡(Yi et al.，2012).此后，相继有学者在萱草和万寿菊中发现NO和H2O2在SO2诱导保卫细胞凋亡中的信号调节作用(Wei et al.，2013，2015)，但这些报道均集中于草本植物的保卫细胞，且未对NO和H2O2的互作关系进行研究.迄今为止，关于SO2对木本植物的毒性效应，以及NO和H2O2两种信号分子在SO2诱导木本植物死亡过程中发挥的作用尚不清楚.
SO2气体易溶于水产生SO32-和HSO3-分子，两种分子摩尔比为3∶1(Shapiro，1977).有关SO2毒性研究常用SO2衍生物(Na2SO3和NaHSO3混合液，摩尔比3∶1)处理(尹晶晶等，2010; 付宝春等，2015; Yi et al.，2012; Wei et al.，2013; 2015).因此，本文选择生长在我国西北地区的高大乔木树种—胡杨的细胞为材料，采用SO2衍生物处理，研究SO2对胡杨细胞的毒性作用及NO和H2O2的调节作用，以期为揭示SO2对木本植物的毒害效应及相关机制提供理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods) 2.1 植物材料取胡杨新鲜幼嫩叶片，在含0.5 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA的Murashige&Skoog(MS)固体培养基(pH 5.7)上诱导产生愈伤组织.将愈伤组织继代培养15 d后，选择颜色淡黄、生长旺盛的愈伤细胞进行处理和实验.
2.2 处理方法将生长15 d的胡杨愈伤细胞在MS液体培养基(pH 5.7)中平衡6 h后，分别按以下方法进行处理：①分别用0、1、2、5 mmol·L-1 SO2衍生物处理细胞0、3、6、9、12 h后，检测细胞死亡率；②用2 mmol·L-1 SO2衍生物处理细胞0、3、6、9、12 h后，检测胞内H2O2和NO水平，以0 mmol·L-1 SO2衍生物处理作为对照；③分别用2 mmol·L-1 SO2衍生物、2 mmol·L-1 SO2衍生物+0.5 mmol·L-1 H2O2、2 mmol·L-1 SO2衍生物+0.5 mmol·L-1 ASA、2 mmol·L-1 SO2衍生物+2 U·L-1 CAT处理细胞，6 h后检测细胞死亡率、硝酸还原酶活性和胞内NO水平；④分别用2 mmol·L-1 SO2衍生物、2 mmol·L-1 SO2衍生物+0.5 mmol·L-1 SNP、2 mmol·L-1 SO2衍生物+0.5 mmol·L-1cPTIO、2 mmol·L-1 SO2衍生物+0.5 mmol·L-1钨酸钠(Tungstate)处理细胞，6 h后检测细胞死亡率、抗氧化酶活性和胞内H2O2水平.
2.3 细胞死亡率检测利用Fluorescein Diacetate(FDA)荧光染料检测细胞活性.具体参见Sun等(2012)的方法，在1 mL细胞样品中加入20μg·mL-1 FDA溶液，室温下避光孵育10 min后，用荧光显微镜(BX51，Olympus，Japan)检测细胞荧光，每个重复观察5个视野，每个视野至少观察100个细胞.根据是否发绿色荧光统计细胞死亡率，发亮绿色荧光的为活细胞，不发绿色荧光或绿色较暗的为死细胞.细胞死亡率为死细胞数目与细胞总数之比.
2.4 H2O2水平检测利用2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA)荧光探针检测胡杨细胞内的H2O2水平.将胡杨细胞在50μmol·L-1 H2DCFDA中暗孵育5 min，然后在激光共聚焦显微镜(Leica SP5，Wetzlar，Germany)下观察细胞内的绿色荧光.激发波长为488 nm，接收波长为500~530 nm.利用Image-Pro Plus version 6.0软件来计算相对荧光强度，相对荧光强度越大，表示细胞内H2O2水平越高.
2.5 NO水平检测利用DAF-FM DA(4-Amino-5-Methylamino-2，7-Difluorofluorescein Diacetate)荧光探针检测胡杨细胞内的NO水平.将胡杨细胞在10μmol·L-1DAF-FM DA中暗孵育60 min后，利用激光共聚焦显微镜(Leica SP5，Wetzlar，Germany)下观察细胞内的绿色荧光.激发波长为488 nm，接收波长为515~535 nm.利用Image-Pro Plus version 6.0软件来计算相对荧光强度，相对荧光强度越大，表示细胞内NO水平越高.
2.6 硝酸还原酶(NR)活性测定利用磺胺比色法检测胡杨细胞的NR活性(刘洁等，2010)，以单位时间内每克鲜重细胞产生的NO2-表示酶活性.
2.7 抗氧化酶活性测定将细胞样品在50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH 7.0，内含1 mmol·L-1 EDTA和1%(m/V，g·mL-1)PVP)中充分研磨成匀浆，4℃、12000 g离心20 min后，取上清备用.测定APX活性时，在提取液中加1 mmol·L-1 ASA；利用Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo，USA)测定细胞提取液的蛋白浓度；CAT和APX活性的测定方法参照文献(Sun et al.，2014).
2.8 数据统计分析利用SPSS17.0软件对数据进行方差分析，通过Duncan方法对不同处理组之间的数据进行多重比较，不同字母表示组间差异显著(p＜0.05).
3 结果(Results) 3.1 SO2对胡杨细胞的致死效应用不同浓度的SO2衍生物(0、1、2、5 mmol·L-1)处理胡杨细胞，通过FDA染色检测胡杨细胞死亡率.结果表明，SO2衍生物诱导的胡杨细胞死亡具有浓度效应和时间效应.细胞死亡率随着SO2衍生物浓度的增加而增加，用5 mmol·L-1 SO2衍生物处理9 h后的死亡率是用1 mmol·L-1 SO2衍生物处理9 h后的死亡率的4.4倍(图 1).同一浓度下，处理时间越长，细胞死亡率越高.例如，用2 mmol·L-1 SO2衍生物处理0 h后，细胞死亡率仅为3.3%；处理9 h后，死亡率提高到45.7%(图 1).对照组(0 mmol·L-1 SO2衍生物)在处理12 h内的细胞死亡率均无明显变化(图 1).后续实验中，选取2 mmol·L-1作为SO2衍生物处理浓度.
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| 图 1 不同浓度SO2衍生物处理后胡杨细胞的死亡率(星号表示与处理起始时(0 h)相比差异显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001(Student′s t检验)) Fig. 1 Cell death rate of P. euphratica cells treated with different concentrations of SO2 derivatives |
用2 mmol·L-1 SO2衍生物处理胡杨细胞0、3、6、9、12 h后，分别通过H2DCFDA和DAF-FM DA特异性荧光探针检测细胞内的H2O2和NO荧光强度，以此反映胞内H2O2和NO的水平变化(图 2a).SO2衍生物处理3 h后，胞内H2O2水平明显升高，H2O2荧光强度是起始时(0 h)的1.5倍(图 2b)；而NO水平和起始时相比并无明显差异(图 2c).此后随着处理时间的延长，胞内H2O2和NO水平均逐渐增加(图 2b、2c).在12 h时，H2O2和NO荧光强度分别达到起始时的3.6倍和2.9倍(图 2b、2c).此外，对照组(0 mmol·L-1 SO2衍生物)细胞的H2O2和NO水平在处理12 h内均无明显变化(图 2b、2c).这些结果表明，SO2衍生物诱导的胡杨细胞死亡可能与胞内H2O2和NO水平升高有关.
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| 图 2 SO2衍生物(2 mmol·L-1)处理后胡杨细胞内H2O2和NO水平变化(a：代表性荧光图片；b、c：利用Image J软件计算的H2O2和NO相对荧光强度；星号表示与处理起始时(0 h)相比差异显著；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001(Student′s t检验)) Fig. 2 Changes of H2O2 and NO levels within P. euphratica cells after 2 mmol·L-1SO2 treatment |
为了进一步研究H2O2和NO在SO2诱导的胡杨细胞死亡中发挥的作用，分别使用外源H2O2(0.5 mmol·L-1)、H2O2清除剂ASA(0.5 mmol·L-1)和CAT(2 U·L-1)、NO供体SNP(0.5 mmol·L-1)、NO清除剂cPTIO(0.5 mmol·L-1)、NO合成抑制剂钨酸钠(Tungstate，0.5 mmol·L-1)和2 mmol·L-1 SO2衍生物共同处理细胞，6 h后通过FDA染色检测细胞死亡率.结果显示，SO2衍生物+H2O2处理组的细胞死亡率比SO2衍生物单独处理组高77.7%，而SO2衍生物+CAT和SO2衍生物+ASA处理组的细胞死亡率均明显低于SO2衍生物单独处理组，分别是SO2衍生物单独处理组的72.1%和66.2%(图 3a).由图 3b可以看出，与SO2衍生物单独处理相比，NO清除剂cPTIO和合成抑制剂钨酸钠的使用明显降低了细胞死亡率；而NO供体SNP和SO2衍生物共同处理后，细胞死亡率则明显提高.以上结果表明，H2O2和NO均参与调控SO2诱导的胡杨细胞死亡.
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| 图 3 H2O2和NO干扰剂对SO2衍生物诱导胡杨细胞死亡的影响 Fig. 3 Effects of H2O2 and NO antagonists on the SO2 derivatives-induced P. euphratica cell death |
利用外源H2O2和H2O2清除剂CAT、ASA，分别与2 mmol·L-1 SO2衍生物共同处理细胞，6 h后通过DAF-FM DA特异性荧光探针检测胞内的NO水平(图 4a).与对照相比，SO2衍生物处理后的细胞内NO水平显著升高(图 4b).SO2衍生物+H2O2处理组的NO水平明显高于SO2衍生物单独处理组，而一定浓度的H2O2清除剂(2 U·L-1 CAT或0.5 mmol·L-1 ASA)则抑制了NO生成，SO2衍生物+CAT和SO2衍生物+ASA处理组的NO相对荧光强度分别是SO2衍生物单独处理组的57.0%和73.7%(图 4b).以上结果表明H2O2能够促进SO2诱导的胞内NO产生.
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| 图 4 H2O2干扰剂对SO2衍生物诱导胡杨细胞产生NO的影响(a：代表性荧光图片；b：利用Image J软件计算的NO相对荧光强度) Fig. 4 Effects of H2O2 antagonists on the SO2 derivatives-induced NO production within P. euphratica cells |
硝酸还原酶(NR)介导的NO合成是植物细胞内产生NO的重要途径.SO2胁迫下，外源H2O2明显提高了胡杨细胞内的NR活性；而使用H2O2清除剂CAT、ASA后，SO2衍生物+CAT和SO2衍生物+ASA处理组细胞的NR活性受到明显抑制，分别是SO2衍生物单独处理组的70.4%和83.1%(图 5).以上结果表明，SO2胁迫下NR途径参与H2O2诱导的NO合成.
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| 图 5 H2O2干扰剂对SO2胁迫下胡杨细胞硝酸还原酶活性的影响 Fig. 5 Effects of H2O2 antagonists on the nitrate reductase activities in SO2-stressed P. euphratica cells |
为了进一步探讨NO和H2O2在SO2诱导胡杨细胞死亡中的交叉互作关系，利用外源NO供体SNP(0.5 mmol·L-1)、NO合成抑制剂钨酸钠(Tungstate，0.5 mmol·L-1)、NO清除剂cPTIO(0.5 mmol·L-1)，分别与2 mmol·L-1 SO2衍生物共同处理细胞，6 h后检测胡杨细胞的抗氧化酶(APX、CAT)活性和胞内H2O2水平.结果表明，SO2衍生物胁迫后细胞APX活性(以ASA计)和CAT活性(以H2O2计)均受到明显抑制(图 6).与SO2衍生物单独处理组相比，SO2衍生物+SNP处理组细胞的APX和CAT活性分别下降了47.1%和32.8%(图 6)，H2O2水平增加了40.6%(图 7)；SO2衍生物和钨酸钠共同处理后，细胞APX和CAT活性分别较SO2衍生物单独处理时提高了47.9%和44.7%(图 6)，H2O2水平降低了47.1%(图 7)；使用NO清除剂cPTIO后，与SO2单独处理组相比，细胞APX和CAT活性也均有不同程度的提高，而胞内H2O2水平明显下降(图 6、图 7).
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| 图 6 NO干扰剂对SO2胁迫下胡杨细胞抗氧化酶活性的影响 Fig. 6 Effects of NO antagonists on the antioxidant enzymes activities in SO2-stressed P. euphratica cells |
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| 图 7 NO干扰剂对SO2胁迫下胡杨细胞H2O2水平的影响(a：代表性荧光图片；b：利用Image J软件计算的H2O2相对荧光强度) Fig. 7 Effects of NO antagonists on the H2O2 level in SO2-stressed P. euphratica cells |
较高浓度的SO2进入植物体后，以亚硫酸盐和亚硫酸氢盐的形式对植物组织、细胞和生物大分子产生毒性(Lewandowska et al.，2008).尹晶晶等(2010)报道2~4 mmol·L-1 SO2衍生物暴露3 h可使蚕豆表皮保卫细胞活性下降，细胞死亡率明显升高.本文利用1~5 mmol·L-1 SO2衍生物处理胡杨细胞3~12 h，发现SO2诱导的胡杨细胞死亡具有浓度效应和时间效应，SO2浓度越大，处理时间越长，胡杨细胞死亡率越高(图 1).
根据已有文献报道，SO2的毒性作用主要源于暴露引发的细胞活性氧水平升高.细胞内活性氧水平升高后，一方面可造成生物大分子(如DNA、蛋白质和膜脂)损伤，另一方面可使胞外Ca2+内流，并激活Caspase-like蛋白酶活性，最终导致细胞死亡(Li et al.，2012; Yi et al.，2012).H2O2和NO是在植物生长发育过程中起重要调节作用的信号分子，当植物受到逆境胁迫时，H2O2和NO迅速积累，激活下游信号，介导细胞死亡(De Michele et al.，2009; Sun et al.，2014).曾有学者在对萱草和万寿菊的叶表皮研究中发现，H2O2和NO参与调节SO2诱导的保卫细胞凋亡(Wei et al.，2013；2015).本实验用2 mmol·L-1 SO2衍生物处理胡杨细胞，随着处理时间的延长，细胞死亡率逐渐增加(图 1)，同时胞内H2O2和NO水平也逐渐升高(图 2).本文进一步通过药理学实验，发现一定浓度的外源H2O2或NO供体SNP能够提高SO2胁迫下胡杨细胞的死亡率，而使用H2O2清除剂CAT和ASA、NO清除剂cPTIO、NO合成抑制剂钨酸钠后，SO2诱导的胡杨细胞死亡率明显降低(图 3)，这些结果都表明，H2O2和NO参与调控SO2诱导的胡杨细胞死亡.
逆境胁迫下H2O2和NO在许多生理过程中都表现出相互协同性或依赖性(Bright et al.，2006; Qiao et al.，2014).De Michele等(2009)发现镉胁迫下NO诱导H2O2的产生，启动拟南芥悬浮细胞的程序性死亡.高温胁迫下，H2O2位于NO上游，通过增加热激蛋白积累来提高植物对高温的耐性(Wang et al.，2014).上述研究结果暗示，H2O2和NO信号分子在植物体内存在复杂的交叉互作关系.本研究显示，SO2胁迫后胡杨细胞内H2O2水平的升高先于NO(图 2)，且快速产生的H2O2能够诱导NO水平升高(图 4).硝酸还原酶(NR)介导的NO合成是植物细胞内产生NO的重要途径.Desikan等(2002)在拟南芥保卫细胞中发现，H2O2通过提高NR活性来促进NO生成.与此类似，我们的研究也发现外源H2O2可以提高SO2胁迫下胡杨细胞的NR活性，促进胞内NO的产生，而利用抗氧化剂CAT和ASA清除H2O2后，NR活性和NO产生均受到明显抑制(图 4、图 5).这些结果表明，SO2胁迫下，胡杨细胞内快速产生的H2O2通过激活NR活性来促进NO产生.另一方面，胞内产生的NO也能够影响H2O2水平.本文结果显示，SO2胁迫下，外源NO供体SNP能够抑制抗氧化酶(CAT和APX)活性，增加胡杨细胞内的H2O2水平，而一定浓度的NO清除剂cPTIO和NO合成抑制剂钨酸钠均可提高CAT和APX活性，降低胞内H2O2水平(图 6、图 7)，表明SO2胁迫下，胞内产生的NO能够通过抑制抗氧化酶活性来提高H2O2水平.这和Sun等(2014)报道的结果是相似的，他们也发现在植物细胞内，胁迫诱导产生的NO能够降低抗氧化酶活性，从而导致胞内H2O2大量积累.
综上，本文通过药理学实验初步证明了H2O2和NO在调控SO2诱导胡杨细胞死亡过程中的相互作用(图 8)，对于二者在信号调节通路中的上下游关系并不明确，仍需进一步研究.
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| 图 8 H2O2和NO在SO2诱导胡杨细胞死亡中的互作关系模式图 Fig. 8 A schematic model showing the crosstalk of H2O2 and NO in regulation of SO2-induced cell death of P. euphratica |
一定浓度的SO2衍生物可诱导胡杨细胞死亡，使细胞内H2O2和NO水平升高.H2O2与NO在胡杨细胞死亡过程中发挥信号调节作用，且存在相互作用关系.一方面，SO2胁迫下胡杨细胞快速产生的H2O2能够上调硝酸还原酶活性，促进NO生成；另一方面，NO可以通过抑制抗氧化酶活性(CAT和APX)来提高H2O2水平.H2O2与NO互作调控SO2诱导的胡杨细胞死亡.
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